脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是脑卒中的一种类型，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点[1]。目前针对ICH的治疗手段主要包括血肿清除及对症支持治疗等[2]。然而，MENDELOW等[3-4]临床研究显示：血肿清除并不能改善患者的预后，对症支持治疗也仅仅起到了维持生命体征的作用，对神经功能的恢复作用甚微。目前认为：ICH后功能恢复障碍的原因之一是ICH后的继发性损伤，如炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、轴突破坏等[5]。且动物实验表明[6-7]：减轻ICH后的继发损伤，可以显著改善ICH后的症状。因此，针对ICH的继发性损伤的研究是ICH治疗的主要方向之一。Prdx1是一类过氧化物酶[8]，已有研究表明Prdx1通过减少氧自由基的产生，还原被氧化的蛋白等方式[9]，抑制机体在病理状态下的氧化应激反应，减轻炎症反应和细胞凋亡[10-11]，而这些病理过程均与ICH后的继发性损伤相关。但是对于Prdx1在ICH后的表达变化及作用研究甚少。因此，本研究通过探讨Prdx1在ICH中的表达变化及可能发挥的作用，为ICH的治疗提供新的分子靶点。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组40只8~10周的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，购于陆军军医大学动物实验中心，将动物置于标准饲养条件下饲养7 d。所有大鼠维持在(25±2)℃的恒温动物房中。12 h光照/12 h暗环境，食物和水充足。其中5只用于免疫荧光染色，35只按随机数字表法分为sham组、ICH 12 h组、ICH 1 d组、ICH 2 d组、ICH 3 d组、ICH 4 d组、ICH 5 d组(n=5)。
1.2 主要试剂抗NeuN抗体、抗Ibα1抗体、抗GFAP抗体及抗Prdx1抗体均购于英国Abcam公司；抗β-actin抗体购于美国Santa公司，荧光二抗Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、防荧光淬灭封片剂及TRIzol购于美国Invitrogen公司，DAPI购于广州Wellbio公司，蛋白磷酸酶抑制剂购于瑞士Roche公司，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶购于上海碧云天公司，辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗Goat-Anti-Mouse、Goat-Anti-Rabbit购于北京中杉金桥公司，SuperECL Plus购于美国Thermo公司，硝化纤维素膜购于德国默克公司，RNA逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，PCR引物购于上海生工公司，Prdx1干扰质粒由武汉生命之美公司提供。
1.3 方法 1.3.1 ICH模型建立SD大鼠ICH模型建立过程参见文献[12]：70 μL无抗凝剂的自体血或等体积的生理盐水，用注射泵以10 μL/min的速度注射于右侧纹状体(以Bregma为原点，向前0.2 mm，向左3.5 mm, 深度为5.5 mm)，注射完毕后留针10 min，缓慢拔针，缝合头部皮肤。模型建立的成功率达95%，在建模过程中死亡及失败的模型不包含在实验中。
1.3.2 免疫荧光染色参见文献[13]方法：用4%的多聚甲醛灌注固定大鼠脑组织，梯度脱水后，进行包埋，用冰冻切片机(徕卡公司，德国)切成30 μm厚的组织切片，切片用0.5%的Triton-X 37 ℃通透1 h，5%的BSA 37 ℃封闭2 h，一抗NeuN(1 :200), GFAP(1 :200)，Ibα1(1 :200)分别与Prdx1(1 :200)共染，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗后，37 ℃孵育荧光二抗1 h，荧光二抗包括Alexa Fluor 647(1 :500), Alexa Fluor 488(1 :500), PBS漂洗后，DAPI复染细胞核10 min，PBS漂洗，防淬灭封片剂封片后，在共聚焦显微镜下观察(徕卡，德国)，记录阳性细胞并计算平均值。
1.3.3 Western blot参见文献[14]方法：在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中分离30 μg蛋白质溶解物，转移到硝化纤维素膜上。在室温条件下，用5% BSA进行封闭。在4 ℃条件下孵育一抗过夜。实验中主要用到的一抗有Prdx1(1 :1 000), β-actin(1 :1 000)。用TBST洗去一抗，室温下与辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗孵育2 h。TBST清洗后，根据制造商的说明，利用化学发光系统检测蛋白的表达，并用image J计算灰度值。
1.3.4 RNA提取及qRT-PCR用TRIzol提取组织和细胞中的RNA，并利用逆转录试剂盒进行逆转录，在实时荧光定量PCR设备(ABI公司，美国)上进行检测，相关基因的表达水平用2-△△CT进行计算[15]。涉及的引物序列：大鼠GAPDH正向5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，反向5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′；大鼠Prdx1正向5′-CGCACCATTGCTCAGGAT-3′, 反向5′-AGCGGCCAACAGGAAGAT-3′；人GAPDH正向5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′, 反向5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；人CARD11正向5′-AATGACAGCGGCGGGTTTGAC-3′, 反向5′-TGGTGGGAGGAGGAGGAGGAG-3′；人C3AR1正向5′-AGATGCAGCGGACAGTGAACAC-3′, 反向5′-GCCAAGTGAGCCAGCGAGAAG-3′。
1.3.5 转录组测序及数据分析收集野生型HeLa细胞(对照组)和Prdx1干扰的HeLa细胞(干扰组)，每组样本收集5 μg RNA进行ployA库建设，对片段为300~500 bp的产物进行测序，并利用edgeR软件检测样本间差异表达的基因，对差异表达的基因进行GO分析。
1.4 统计学分析利用SPSS 20.0统计软件，数据以x±s表示，两样本之间采用独立样本t检验，多样本之间采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 Prdx1在大鼠大脑中的细胞定位区域差异性Prdx1与NeuN，Ibα1和GFAP免疫荧光共染色结果表明：在皮层，Prdx1主要表达在NeuN+的神经元，Ibα1+的小胶质细胞和GFAP+的星形胶质细胞中仅少量表达(图 1)；而在纹状体，Prdx1主要表达在GFAP+的星形胶质细胞，少量表达于Ibα1+的小胶质细胞，而在NeuN+的神经元中不表达(图 2)。
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| 图 1 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠皮层的分布 |
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| 图 2 免疫荧光染色观察Prdx1在大鼠纹状体的分布 |
2.2 Prdx1在ICH后的表达变化
qRT-PCR和Western blot检测结果显示：ICH后，Prdx1 mRNA水平从12 h开始上升，在ICH第3天时达到高峰，随后开始降低(P < 0.01, P < 0.05，图 3A)。而蛋白水平在ICH后12 h虽差异无统计学意义，但有降低的趋势，2 d后蛋白水平开始升高(P < 0.05，图 3B)。
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| A：qRT-PCR检测Prdx1在ICH后12 h和1、2、3、4、5 d的mRNA水平a: P < 0.01, b: P < 0.05, 与sham组比较；B：Western blot检测Prdx1在ICH后12 h和1、2、3、4、5 d的蛋白水平 图 3 Prdx1在ICH后的不同时间点变化趋势(n=5) |
2.3 Prdx1影响炎症、固有免疫反应及突触发育相关基因的表达
RNA-seq结果表明：Prdx1降低后，共有671个基因发生了差异性表达，其中289个基因高表达，382个基因低表达(图 4A)。对差异表达的基因进行GO分析, 结果提示：差异表达的基因集中在炎症反应、细胞凋亡、固有免疫反应及轴突发育等(图 4B、D)。对相关差异表达基因进行验证，得到了与RNA-seq类似的变化趋势(P < 0.05，P < 0.01，图 4C)。
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| A：差异表达基因火山图黑点表示无差异表达基因，蓝点表示下调表达基因，红点表示上调表达基因；B：下调表达基因的GO分析；C：对照组和Prdx1干扰组HeLa细胞相关基因的mRNA水平(n=3) a:P < 0.05, b: P < 0.01, 与对照组比较；D:上调表达基因的GO分析 图 4 Prdx1干扰后的差异表达基因及GO分析 |
3 讨论
ICH的继发性损伤是引起患者功能恢复障碍的主要原因之一，因此减轻继发性损伤是ICH治疗的有效靶点。既往的研究提示:过氧化物酶Prdx1可以减轻炎症反应、氧化应激等病理过程，而这些病理过程均参与ICH后的继发性损伤，但是Prdx1在ICH中的研究甚少。LIU等[16]报道：ICH后Prdx1表达增强，且TLR4/NF-κB信号通路激活，推测ICH后增高的Prdx1激活TLR4/NF-κB信号通路，从而加重ICH后的继发性损伤。但该研究缺乏Prdx1与TLR4/NF-κB相互作用的证据及Prdx1过表达或干扰后在ICH中效应，并没有完全阐明Prdx1在ICH的作用及机制。为了进一步明确Prdx1在ICH中的表达变化和可能作用机制，我们进行了该课题的研究。
首先，本研究发现Prdx1在中枢神经系统不同区域的细胞定位存在差异性。NAKASO等[17]研究显示：Prdx1主要在星形胶质细胞中表达，而本研究实验结果显示：Prdx1既表达于神经元，也表达于星形胶质细胞，且与区域相关；在纹状体区，其主要表达于星形胶质细胞，而在皮层区域，Prdx1主要表达于神经元。这种分布的差异性提示Prdx1功能的多样性。YAN等[18]研究发现:分布于神经元中的Prdx1通过与GDE2相互作用，驱动神经元分化。而分布于胶质细胞中的Prdx1主要通过抑制ROS及炎症等方式减轻中枢神经系统中的炎症反应。结合既往研究，我们猜想：ICH后神经元中的Prdx1可能通过促进前体细胞分化补充受损神经元，而星形胶质细胞中的Prdx1可能通过减轻ICH后的炎症反应及细胞凋亡等方式减轻ICH后的继发性损伤。位于神经元和星形胶质细胞中的Prdx1是否在ICH后发挥不同的作用，仍需进一步研究。
本研究显示：ICH后，Prdx1 mRNA水平从12 h开始增高，3 d时达到高峰，随之下降，而蛋白水平在12 h有降低的趋势，2 d开始升高，4 d达到高峰。这种蛋白和mRNA水平的不一致性可能与蛋白消耗性降低或蛋白合成的迟滞相关。NAKASO等[17]研究显示：Prdx1的蛋白水平在ICH后1 d时就高于sham组，造成与本研究结果差异性的原因可能与动物品种、建模方式等相关。同时，血肿周围组织的免疫荧光染色结果显示，ICH后，升高的Prdx1主要表达于星形胶质细胞，与既往的报道一致[17]。
最后，本研究通过转染Prdx1干扰质粒建立Prdx1低表达的HeLa细胞模型，与野生型HeLa细胞相比，Prdx1干扰后导致炎症反应、细胞凋亡、固有免疫反应和轴突发育等相关的分子差异性表达，这些结果表明：Prdx1在ICH中发挥作用可能与上述相关的病理过程有关。同时对相关的基因如C3AR1、CARD11等进行验证，结果提示Prdx1干扰后可以显著下调C3AR1、CARD11的表达。既往的研究表明：C3AR1参与脑损伤后的轴突修复及神经保护作用[19]，且通过其下游分子PTEN减轻脑损伤后的炎症反应等[20]，而CARD11对Treg细胞发挥功能是必不可少的[21]。因此我们推测：Prdx1在ICH中，可能通过影响C3AR1、CARD11等基因的表达，促进ICH后的轴突修复、减轻炎症反应及促进Treg细胞活化，从而减轻ICH后的继发损伤。但Prdx1通过怎样的机制作用于C3AR1、CARD11，从而引起其差异性表达仍需进一步研究。
综上所述，本研究结合体内实验及转录组测序等技术，明确了Prdx1在中枢神经系统的细胞定位及该分子在ICH后的表达变化，并预测了其在ICH中可能的作用机制，为ICH的治疗提供了新的靶点。
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