流行病学数据显示:全球慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)发病率高达11%,其住院率及病死率逐年增高,每年至少有240万人因CKD导致死亡,病死率排第11位,已成为全球公共卫生关注的焦点[1]。CKD一旦发生则呈现进行性发展的趋势,最终进展为慢性肾衰竭和终末期肾病(尿毒症)[2]。研究表明:引发CKD及进展的因素较多,传统因素包括年龄、高血压、糖尿病、高尿酸血症等危险因素。但最新研究证实:血清Klotho水平、矿物质骨代谢异常(mineral and bone disorder, MBD)、血管钙化、氧化应激和蛋白质能量消耗(protein-energy wasting, PEW)等因素在CKD进展过程中也起着非常重要的作用[3-4]。
Klotho是一种主要在肾脏组织中表达和分泌的抗衰老蛋白,其分泌型蛋白可作为一种激素样物质进入血液循环发挥特定作用。大量研究证实Klotho具有抑制肾纤维化、抗炎、抗氧化应激等器官和细胞保护作用[5],并且发现在CKD患者和动物模型中,Klotho在肾组织的表达和血清中显著降低,与肾脏预后不良密切相关[6]。但是也有研究对此观点持有争议,认为血清Klotho水平降低与肾脏不良结局事件间的关系尚需更进一步阐明。而我们前期研究结果提示:Klotho能够显著抑制尿毒症心肌病,加速动脉粥样硬化及血栓栓塞并发症的发生和发展,并且发现Klotho是CKD血管钙化的重要抑制因子[7]。此外,在CKD小鼠模型中,Klotho可以通过抑制成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2,FGF2)信号通路减轻肾纤维化,阻遏CKD进展[8],这些研究均提示Klotho在CKD进展中发挥重要保护作用。因此,本研究拟进一步明确Klotho在CKD3~5期患者疾病进展中的临床预测价值,为CKD防治提供有效靶点,以期达到延缓和改善慢性肾脏病进展的目的。
1 资料与方法 1.1 实验对象的选择选择2015年3-11月于我院肾内科住院的原发性CKD 3~5期患者261例,根据CKD-EPI公式计算eGFr=177.6×Scr-0.65×CysC-0.57×Age-0.20×(0.82 if female)×(1.11 if black)。依据2007美国肾脏病基金会制定的肾脏病生存质量指导(the national kidney foundation disease outcomes quality initiative, KDOQI)肾功能分期标准,将CKD分为4期:60 mL/(min·1.73 m2) ≤eGFR < 90 mL/(min·1.73 m2)为2期,30 mL/(min·1.73 m2) ≤eGFR < 60 mL/(min·1.73 m2)为3期,15 mL/(min·1.73 m2) ≤eGFR < 30 mL/(min· 1.73 m2)为4期,eGFR < 15 mL/(min·1.73 m2)为5期,其中CKD3期58例,CKD4期54例,CKD5期149例。患者基本信息及相关血清学检验包括:姓名、性别、年龄、身高、体质量指数、血压、肌酐、尿酸、胱抑素、肾小球滤过率、血钙、血磷、甲状旁腺激素、白蛋白、血红蛋白等。
纳入标准:①因慢性肾脏病3~5期就诊的患者;②成人(年龄≥18岁);③病历信息、随访资料完整。排除标准: ①继发性肾病患者(如糖尿病肾病、高血压肾病、紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮性肾炎等);②已开始透析治疗的患者;③近半个月有感染的患者;④妊娠合并肾病患者;⑤急性肾功能衰竭患者;⑥特殊人群(如患有一种特殊肾脏疾病的人群:如多囊肾、独肾等);⑦有器官移植需长期服用免疫抑制剂史;⑧拒绝参与者。
1.2 方法预测因子:血清基线Klotho蛋白水平。样本收集及保存:采集晨起空腹患者外周静脉血5 mL,静置30 min,3 000 r/min,离心10 min,取血清分装,-80 ℃保存备用。ELISA检测血清Klotho蛋白水平,试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。肌酐、尿酸、胱抑素、血磷、血钙、血红蛋白、甲状旁腺激素、白蛋白等采用陆军军医大学新桥医院检验科贝克曼AU5800自动生化仪检测。
1.3 结局事件及追踪结局事件:肾脏终点事件(定义为肾脏替代疗法治疗的开始,包括行血液透析、腹膜透析及肾脏移植)。符合纳入标准的CKD患者结局事件的追踪:①对于在我院肾内科长期随访的患者,通过医院系统对患者就诊记录进行追踪,出现结局事件或死亡则终止随访,否则追踪至随访截止日期2019年1月1日;②对于未在我院肾内科随访的患者,通过逐一电话或医保局随访追踪结局事件,出现结局事件或死亡则终止随访,否则追踪至截止日期2019年1月1日。
1.4 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件,首先使用K-S检验变量是否服从正态分布,服从正态分布的计量资料以表示,组间比较采用单因素方差分析;非正态分布的计量资料采用表示,组间比较采用Kruskal-Wallis检验。分类变量以患者的百分比(%)表示,并采用Fisher确切概率法或卡方检验进行比较。采用Spearman秩相关分析Klotho水平与eGFR的相关性。对Klotho按照三分位数分为3组,对潜在的危险因素进行单因素分析,采用Kaplan-Meier生存分析比较各组生存时间;再采用Cox回归分析与发生结局事件相关的危险因素, 同时采用多模型进行校正分析,模型1:血清Klotho单变量分析;模型2:年龄及性别调整;模型3:模型2+体质量指数+高血压+心血管疾病;模型4:模型3+血红蛋白+白蛋白;模型5:模型4+血磷+血钙+甲状旁腺激素。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基线特征最终纳入261例进行分析。其中,中位eGFR为11.72 mL /(min·1.73 m2),平均年龄为48岁,平均体质量指数为23.02 kg/m2,女性占54.41%,吸烟患者占22.99%,中位收缩压、舒张压分别为140 mmHg和87 mmHg。随着CKD分期越高,体质量指数、收缩压逐渐增高,组间差异具有统计学意义(P < 0.05)。同时,CKD患者晚期血红蛋白、血钙水平较低,而血清磷、甲状旁腺激素、胱抑素C及尿素氮水平较高,组间差异具有统计学意义(P < 0.05,表 1)。
基线特征 | 合计(n=261) | CKD 3期(n=58) | CKD 4期(n=54) | CKD 5期(n=149) | P值 |
年龄/岁a | 48.00±14.74 | 51.22±14.59 | 48.48±15.39 | 46.5±14.44 | 0.120 |
性别(女性)c | 142.00(54.41%) | 34.00(58.62%) | 20.00(37.04%) | 88.00(59.06%) | 0.016 |
吸烟人数c | 60.00(22.99%) | 12.00(20.69%) | 19.00(35.19%) | 29.00(19.46%) | 0.056 |
高血压人数c | 99.00(37.93%) | 25.00(43.10%) | 20.00(37.04%) | 54.00(36.24%) | 0.651 |
心血管病人数c | 12.00(4.60%) | 7.00(12.07%) | 1.00(1.85%) | 4.00(2.68%) | 0.008 |
体重指数/kg·m-2 a | 23.02±3.48 | 22.41±3.46 | 23.20±2.97 | 24.41±3.61 | 0.001 |
收缩压/mmHgb | 140.00(128.00-157.00) | 136.50(122.25-143.50) | 137.50(122.50-149.25) | 143.00(131.00-162.00) | < 0.001 |
舒张压/mmHgb | 87.00(77.50-96.00) | 83.00(76.00-91.25) | 84.00(72.00-96.25) | 88.00(79.00-99.00) | 0.061 |
血红蛋白/g·L-1 a | 96.41±25.45 | 121.26±19.84 | 108.06±20.32 | 81.00(69.00-97.50) | < 0.001 |
白蛋白/g·L-1 b | 38.90(35.50-42.40) | 39.25(34.70-4.85) | 39.35(34.63-43.80) | 38.80(35.90-41.95) | 0.659 |
血磷/mmol·L-1 b | 1.34(1.10-1.74) | 1.08(0.90-1.23) | 1.15(1.02-1.34) | 1.62(1.35-2.09) | < 0.001 |
血钙/mmol·L-1 b | 2.18(2.05-2.28) | 2.25(2.19-2.32) | 2.23(2.14-2.34) | 2.11(1.98-2.23) | < 0.001 |
甲状旁腺激素/pg·mL-1 b | 174.00(68.35-325.00) | 49.35(32.45-74.20) | 98.85(55.03-156.00) | 296.00(190.50-470.00) | < 0.001 |
肌酐/μmol·L-1 b | 437.00(201.00-719.00) | 128.50(112.00-160.75) | 257.50(209.50-324.75) | 669.00(498.50-908.50) | < 0.001 |
尿酸/μmol·L-1 a | 510.03±121.99 | 428.21±93.34 | 500.91±110.74 | 545.19±120.40 | < 0.001 |
尿素氮/mmol·L-1 b | 15.97(10.00-24.62) | 7.39(6.41-9.10) | 11.68(9.75-13.75) | 24.00(18.35-31.26) | < 0.001 |
胱抑素C/mg·L-1 b | 3.88(2.41-5.09) | 1.61(1.38-1.93) | 2.78(2.44-3.26) | 4.96(4.23-5.69) | < 0.001 |
肾小球率过滤/mL-1·min-1·1.73m-2 b | 11.72(7.57-27.43) | 42.09(35.67-50.86) | 19.75(16.98-25.83) | 7.96(6.32-10.26) | < 0.001 |
血清Klotho/pg·mL-1 b | 684.96(356.79-998.64) | 1153.85(859.92-1610.58) | 769.85(639.10-1042.13) | 528.62(260.57-731.51) | < 0.001 |
a:单因素方差分析;b: Kruscal-Wallis检验;c:χ2检验或Fisher确切概率法 |
2.2 血清Klotho水平与eGFR成正相关
中位血清Klotho水平为684.96 pg/mL(356.79-998.64 pg/mL)。血清Klotho水平随着CKD进展逐渐下降。单因素分析显示:血清Klotho水平与eGFR水平呈正相关(r=0.567,P < 0.001,图 1)。将血清Klotho水平作为分类变量,按血清Klotho水平进行三分位,将CKD患者分为3组人群(低Klotho水平组,中Klotho水平组和高Klotho水平组),低Klotho水平组Klotho值< 469.26 pg/mL,469.26 pg/mL≤中Klotho水平组Klotho值< 844.55 pg/mL,高Klotho水平组Klotho值≥844.55 pg/mL。平均随访42.7个月,低Klotho水平组中出现肾脏结局事件有75例,中Klotho水平组出现肾脏结局事件有55例,而高Klotho水平组中出现肾脏结局事件有33例。同时,血清Klotho水平越低,血红蛋白、血钙水平越低,而血磷、甲状旁腺激素水平越高, 组间差异均具有统计学意义(P均 < 0.05,表 2)。
特征 | 低Klotho水平组 (n=87) |
中Klotho水平组 (n=86) |
高Klotho水平组 (n=88) |
P值 |
CKD分期c | < 0.001 | |||
CKD3 | 7.00(8.05%) | 6.00(6.98%) | 45.00(51.14%) | |
CKD4 | 10.00(11.49%) | 23.00(26.74%) | 21.00(23.86%) | |
CKD5 | 70.00(80.46%) | 57.00(66.28%) | 22.00(25.00%) | |
年龄/岁a | 46.28±14.77 | 48.45±14.89 | 49.26±14.57 | 0.385 |
性别(女性)c | 51.00(58.62%) | 43.00(49.43%) | 49.00(56.32%) | 0.447 |
吸烟人数c | 12.00(13.79%) | 27.00(31.03%) | 21.00(24.14%) | 0.025 |
高血压人数c | 33.00(37.93%) | 31.00(35.63%) | 34.00(39.08%) | 0.892 |
心血管病人数c | 3.00(3.45%) | 1.00(1.15%) | 8.00(9.20%) | 0.033 |
体质量指数a/kg·m-2 | 22.27±3.00 | 23.25±3.92 | 23.53±3.41 | 0.042 |
收缩压b/mmHg | 140.00(131.00-159.00) | 139.00(125.50-150.00) | 139.50(125.25-158.50) | 0.244 |
舒张压a/mmHg | 88.16±15.06 | 85.48±13.10 | 85.65±15.22 | 0.601 |
血红蛋白b/g·L-1 | 84.00(71.00-101.00) | 94.03±24.04 | 107.88±25.34 | < 0.001 |
白蛋白a/g·L-1 | 38.55±4.84 | 39.30±5.80 | 38.85(34.75-41.78) | 0.178 |
血磷b/mmol·L-1 | 1.50(1.30-2.14) | 1.44±0.45 | 1.17(1.02-1.35) | < 0.001 |
血钙b/mmol·L-1 | 2.11(1.98-2.24) | 2.18(2.03-2.26) | 2.23(2.13-2.31) | 0.001 |
甲状旁腺激素b/pg·mL-1 | 253.00(129.00-526.00) | 195.50(97.73-331.25) | 73.90(42.85-184.50) | < 0.001 |
肌酐b/μmol·L-1 | 649.00(411.00-999.00) | 511.60±259.19 | 192.00(128.25-379.25) | < 0.001 |
尿酸a/umol·L-1 | 545.77±116.78 | 504.47±129.07 | 480.14±111.81 | 0.001 |
尿素氮a/mmol·L-1 | 24.03±10.71 | 16.84(12.21-24.14) | 9.91(7.39-16.33) | < 0.001 |
胱抑素Ca/mg·L-1 | 4.62±1.45 | 4.12±1.37 | 2.75±1.50 | < 0.001 |
肾小球率过滤b/mL·min-1·1.73 m-2 | 8.43(5.83-12.56) | 11.12(7.64-17.48) | 30.31(14.82-43.48) | < 0.001 |
血清Klothob/pg·mL-1 | 254.44(192.82-358.95) | 680.10(598.64-753.81) | 1 159.41(974.71-1561.59) | < 0.001 |
a:单因素方差分析;b: Kruscal-Wallis检验;c:卡方检验或Fisher确切概率法 |
2.3 血清Klotho水平能够预测CKD进展
为了进一步评估血清Klotho水平在CKD患者中的预后价值,Kaplan-Meier生存分析显示:低Klotho水平组、中Klotho水平组和高Klotho水平组人群中出现肾脏结局事件的时间有统计学差异,高Klotho水平组比低Klotho水平组、中Klotho水平组人群出现结局事件所需时间长。即血清Klotho水平越低,进展到肾脏终点事件所需时间越短,组间差异具有统计学意义(P < 0.001,图 2A)。对CKD分期进行亚组分析发现,在CKD3、CKD4患者中,按血清Klotho水平分为3组,Kaplan-Meier生存分析示组间差异无统计学意义(P=0.304、P=0.536,图 2B、C)。仅在CKD5患者中,Kaplan-Meier生存分析示差异具有统计学意义(P < 0.001,图 2D)。此外,按血清Klotho水平分为3组,当血红蛋白低于正常、血钙低于正常、血磷高于正常、PTH高于正常时,Kaplan-Meier生存分析示组间差异均具有统计学意义(P值均小于0.001,图 3A,图 4A、C、E)。在血红蛋白、血钙、血磷正常患者中,Kaplan-Meier生存分析示组间差异有统计学意义(P值均小于0.05,图 3B,图 4B、D)。但是,在甲状旁腺激素正常患者中P=0.799,无统计学意义(图 4F)。在Cox回归分析中,将血清Klotho水平作为一个单因素连续变量分析中,与高血清Klotho水平组人群相比,低Klotho水平组、中Klotho水平组两组人群的风险比分别是4.337(2.862, 6.573),P < 0.001和2.110(1.369, 3.253),P=0.001(表 3)。
组别 | 模型1 | 模型2 | 模型3 | 模型4 | 模型5 | |||||||||
P | HR (95%CI) | P | HR (95%CI) | P | HR (95%CI) | P | HR (95%CI) | P | HR (95% CI) | |||||
低Klotho水平组 | < 0.001 | 4.337(2.862, 6.573) | < 0.001 | 4.369(2.880, 6.628) | < 0.001 | 4.394(2.885, 6.694) | < 0.001 | 2.782(1.793, 4.317) | < 0.001 | 2.401(1.532, 3.763) | ||||
中Klotho水平组 | 0.001 | 2.110(1.369, 3.253) | 0.001 | 2.137(2.573, 1.386) | 0.001 | 2.156(1.392, 3.339) | 0.156 | 1.392(0.881, 2.199) | 0.699 | 1.098(0.682, 1.770) | ||||
高Kloth水平组 | - | - | - | - | - | |||||||||
高Klotho水平组作为对照组;模型1:血清Klotho单变量分析; 模型2:年龄及性别调整; 模型3:模型2 +体质量指数+高血压+心血管疾病;模型4:模型3 +血红蛋白+白蛋白;模型5:模型4 +血磷+血钙+甲状旁腺激素 |
3 讨论
本研究除外了糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾病、紫癜性肾病等常见继发性肾病,在最长随访时间近4年的情况下,发现在原发性肾小球疾病导致的CKD3~5期患者中,血清Klotho水平不仅与eGFR呈正相关,而且与血钙、血磷、甲状旁腺激素和血红蛋白水平也密切相关,也进一步证实血清Klotho是CKD患者进展到肾脏终点事件的独立危险因素。
Klotho最初被认为是一种抗衰老基因,主要表达于肾脏中的肾小管[9]。近年来,Klotho被认为是一种多效激素,除了可以调节钙磷稳态外,还具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化及心血管保护作用等多种生物学功能[10]。CKD的进展是多种复杂的病理生理反应的共同作用结果,肾间质纤维化是各类肾脏病进展为终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)的共同通路,它也是导致ESRD的主要病理基础。其中,钙磷代谢异常、内皮功能障碍、氧化应激、血管再生和肾脏修复受损等病理生理反应的发生和发展加重了肾间质纤维化,从而加速了CKD向ESRD进展。文献报道Klotho可通过抑制内质网应激来改善肾小管细胞凋亡[11],后续研究进一步证实Klotho蛋白主要通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与肾小管上皮细胞凋亡[12],进而促进肾损伤修复。而我们前期研究也发现在CKD小鼠中,Klotho可以通过抑制FGF2信号通路减轻肾纤维化,延缓CKD进展。同时也证实Klotho可通过削弱尿毒症毒素硫酸吲哚酚诱导的核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)活化,进而抑制肾纤维化及动脉粥样硬化的发生和发展,此外有研究观察到Klotho水平在CKD早期即出现下降,随着CKD的进展下降更为明显[13],上述研究均提示了Klotho与CKD进展关系密切,本研究也进一步印证了上述结果。此外,我们还观察到血清Klotho与CKD患者肾功能的恶化及进展密切相关,再次在临床上验证了Klotho与CKD进展相关性,也与文献报道一致[14],从而在动物实验和人群队列研究两个层面均验证了Klotho与CKD预后的关系,充分表明血清Klotho水平可作为CKD进展的预测指标,拓展了Klotho的临床应用价值,为建立以klotho为核心的预测模型奠定了基础。然而,我们在CKD3期或CKD4期患者中进行亚组分析时并未发现血清Klotho与肾脏终点事件密切相关,分析认为可能与各期样本量偏少和随访时间较短有关。需要大样本、长时间随访进一步验证Klotho与CKD患者肾功能进展的关系。
慢性肾脏病-矿物质骨代谢异常(chronic kidney disease-mineral and bone disorder, CKD-MBD)是CKD常见并发症之一,主要以钙、磷、维生素D、甲状旁腺激素代谢异常,血管和软组织钙化等为主要特征。一项大型观察性研究发现:在CKD3期就已出现血清磷酸盐负荷,随着CKD进展加重[15]。Klotho被证实可通过抑制肾小管及肠道上皮刷状缘上磷酸盐跨膜转运所需的钠磷协同转运蛋白表达及活性维生素D的合成,减少了肾脏、肠道对磷的重吸收,还可以通过影响甲状旁腺激素的合成与分泌,导致尿磷排泄增加[16]。动物实验还证实Klotho蛋白能够降低血管平滑肌细胞对磷酸盐的摄取[17],在Klotho和/或敲除成纤维细胞生长因子23 (fibroblast growth factor23, FGF-23)的动物出现了血管内皮完整性和功能严重异常、血管钙化、钙磷平衡紊乱和早期死亡[18],而过表达Klotho蛋白时,可加快Klotho敲除小鼠的血管形成[19]。同样,在人类主动脉平滑肌细胞中,尿毒症血清下调Klotho基因表达并诱导钙化产生,而上调Klotho则可以防止细胞外钙沉积[20],上述研究均表明Klotho在CKD-MBD的病理生理机制中的积极作用。本研究也证实了血清Klotho水平低的患者表现为低钙,高磷和高甲状旁腺激素,间接表明Klotho在CKD-MBD的病理生理机制中的重要调控作用。此外,本研究还发现血清Klotho水平与血红蛋白之间存在显著相关性。既往研究报道在长期透析患者中FGF23与血红蛋白呈现明显负相关[21],但其具体机制尚未完全清楚,是否与CKD患者肾功能不断恶化过程中Klotho/FGF23轴直接参与了肾脏分泌红细胞生成素的调控作用有关,还需相关的基础研究进一步阐明。
本研究存在一定的局限性:患者数量相对较少,样本量偏少可能会减弱结果的可靠性。尽管血液样本是在晨起空腹状态下采集的,但是由于患者饮食结构存在差异及既往钙剂等药物服用情况等不详,致使血清钙磷水平的检测存在一定偏差。同时,由于Klotho蛋白主要在肾脏中表达,但心脏、大脑及甲状旁腺等也均有表达,在肾脏受损后,其他器官也会有代偿性分泌,因此导致血清Klotho水平的来源变得相对复杂,但目前临床研究尚无有效手段可以避免此类问题所带来的的影响。后续研究可从上述不足方面出发、拓展,力求为Klotho与慢性肾脏病进展的关系提供更有力佐证。
综上所述,本研究发现血清Klotho水平与CKD患者肾功能下降密切相关,低Klotho水平可预测CKD患者的肾脏不良结局,证实了血清Klotho是CKD进展的独立危险因素和预测指标,因此,监测血清Klotho水平变化对CKD患者临床预后有极大的参考价值。
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