Gilbert综合征(Gilbert syndrome，GS)是遗传性非结合型胆红素血症中的最常见类型，其发病率达10%左右，以间断或持续的轻中度非溶血性非结合型胆红素升高为主要临床表现(OMIM：#143500)。GS多数呈良性结果，但严重者可导致核黄疸甚至与精神疾患相关[1]；且与其变异相关的胆红素代谢相关基因UDP-葡糖醛酸基转移酶1A1基因(UDP-glucuronyl transferase 1A1 gene，UGT1A1)同时也是最重要的编码药物Ⅱ相代谢酶的基因之一，因而GS与多种药物代谢及毒副作用相关，可引起化疗相关腹泻、黄疸、肝衰竭[2-5]。因此，对Gilbert综合征患者及其相关基因变异的精准识别及遗传机制研究尤为重要。
UGT1A1基因编码的UGT1A1酶是肝脏催化脂溶性葡萄糖醛酸化为水溶性的胆红素的唯一酶，在既往研究中：一方面，通过对普通人群的全基因组研究表明该基因的c.-40_-39insTA和c.211G>A等变异与胆红素水平升高相关[6]；而病例-对照研究也充分证实了在病例组中c.-40_-39insTA以及c.211G>A等致病变异与疾病的相关性，功能研究也充分验证了这些变异可以导致UGT1A1酶的转录及催化活性的显著下降[7, 8]，但并未对c.-40_-39insTA和c.211G>A的连锁关系得出明确结论，由此也未能充分解释包括c.-3279T>G和c.-1352C>A等高频变异在GS中的作用，并对它们是否为致病变异存在争议。
本研究对46例GS患者与80名健康对照者UGT1A1基因的增强子PBREM、启动子TATA盒、PE、DE及外显子进行直接测序，并通过对所测得的SNP进行连锁不平衡分析、构建单体型和单体基因型等研究阐明了c.-40_-39insTA和c.211G>A分别与完全不连锁的c.-3279T>G和c.-1352C>A连锁形成不同的单体型，阐明了来自不同同源染色体的c.-40_-39insTA和c.211G>A的两两变异是GS的主要遗传机制和变异Marker，而c.-3279T>G和c.-1352C>A与它们的各自连锁则进一步发挥了剂量效应作用。
1 资料与方法 1.1 病例所纳入的46例无血缘关系的GS患者，均为汉族；其中男性34例，女性12例，平均年龄为32.6±11.57岁，总胆红素水平的平均值为43.01±11.65 μmol/L，以非结合型胆红素水平升高为主(详见表 1)。
| 指标 | 值 | |
| 例数(男:女) | 46(34:12) | |
| 年龄(岁) | 32.6±11.57 | |
| 胆红素 | TB/μmol·L-1 | 43.01±11.65 |
| UCB/μmol·L-1 | 33.80±10.18 | |
| CB/μmol·L-1 | 9.27±3.19 | |
| TB/DB | 0.22±0.058 | |
| 转氨酶 | ALT/U·L-1 | 23.1±20.5 |
| AST/U·L-1 | 20.1±18.6 | |
| ALP/U·L-1 | 70.4±20.7 | |
| GGT/U·L-1 | 23.0±31.2 | |
| 蛋白 | TP/g·L-1 | 73.1±6.9 |
| ALB/g·L-1 | 46.1±5.2 | |
| GLO/g·L-1 | 25.9±4.9 | |
| 血脂 | TG/mmol·L-1 | 2.2±1.1 |
| Tch/mmol·L-1 | 4.5±1.9 | |
| 肾功 | Cr/μmol·L-1 | 40.3±20.9(mg/dl) |
| BUN/mmol·L-1 | 6.9±2.8(mg/dl) | |
| 空腹血糖 | Glu | 5.3±1.8(mg/dl) |
| 肝脏超声 | 腹部超声提示肝大、脾大或胆道系统疾病等异常者 | |
| 病史及药物史 | 按纳入及排除标准进行，首次检查发现胆红素升高前90 d之内任何的用药史 | |
| GS：Gilbert综合征；TB：总胆红素；UCB：非结合型胆红素；CB：结合型胆红素；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶；GGT：谷氨酰转肽酶；TB：总蛋白；ALB：白蛋白；GLO：球蛋白：TG：甘油三酯；Tch：胆固醇；Cr：肌酐；BUN：尿素氮；Glu：血糖 | ||
1.1.1 诊断标准及排除标准
诊断标准：①总胆红素>1.5 mg/dL(25.65 μmol/L)，＜6 mg/dL(102.6μmol/L)，且以UCB为主；②ALT、AST正常，以排除肝脏炎症；③红细胞计数(red blood cell，RBC)、血红蛋白(hemoglobin，Hgb)及网织红细胞计数(reticulocyte count，RT)正常，以排除潜在的溶血可能。
排除标准：①合并其他疾病；②有饮酒史，且超过5年，酒精量男性≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周内有大量饮酒史，折合酒精量>80 g/d；③首次检查发现胆红素升高前90 d之内任何的用药史；④腹部超声提示肝大、脾大或胆道系统疾病等异常者。
1.1.2 病例筛选流程根据诊断标准及排除标准，病例筛选按以下流程进行：1)对于转氨酶正常的以UCB为主的胆红素血症患者，详细询问病史并行体格检查，排除有慢性肝病史及药物服用史及合并高血压、糖尿病等其他疾病的患者，并再次复查肝功，仍提示以UCB为主的胆红素血症，ALT、AST等转氨酶仍正常；2)进一步行血常规及网织红细胞计数等检查，排除血红蛋白及网织红细胞计数异常的患者；3)再进一步行血清学及腹部彩超等检查：排除病毒表面标志物阳性、自身抗体阳性及肝脏、胆道形态异常的患者；4)对部分患者还行溶血试验、血清铜、铜蓝蛋白、异常血红蛋白电泳等检查进一步排除相关疾病。
在本研究中，共383例患者进入初筛，所有患者均为在第三军医大学西南医院感染科门诊或住院部就诊患者。通过询问病史、查体等进行初筛，所有患者都存在持续或间断的非结合型胆红素血症至少3年以上，且无ALT及AST升高等肝脏炎症表现。除尿黄、眼黄、肤黄等黄疸表现外，无阳性体征及不适主诉。再进一步行血常规、网织红细胞计数、甲肝抗体(HAV-Ab)、乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝抗体(HCV-Ab)、戊肝抗体(HEV-Ab)、自身抗体以及腹部超声等检查后，有289名患者被排除：273例患者检测到乙肝表面抗原阳性、5例患者结合型胆红素大于非结合型胆红素、3例患者HCV-IgM阳性、1例患者HAV-IgM阳性、1例患者为急性乙肝、5例患者病史不明、1例患者正在接受干扰素治疗。在余下的79例胆红素水平符合GS诊断标准的患者中，有33例患者被排除：18例患者未测网织红细胞计数、8例患者网织红细胞计数超过1.5%、2例患者在随访过程中出现转氨酶升高，1例患者存在贫血、4例患者在随访过程中胆红素呈下降趋势。
1.1.3 对照80例健康对照组成员从我科工作人员及研究生中招募，包括44名男性和36名女性，均为汉族，平均年龄36.7±11.4岁。入组前，至少每两年进行一次健康体检，体检项目包括血常规、肝肾功、乙型肝炎表明抗原等血清学检测，胸部X光检测，腹部超声等检查，这些检测检查结果均提示正常。入组时，再次检测包括ALT、AST、TB、UCB、CB等指标的肝功能检测，均提示正常。
1.2 UGT1A1基因突变分析 1.2.1 引物设计合成UGT1A1基因位于2号染色体3区7带，包含6个外显子，除启动子TATA盒外[-38到-23 bp，A(TA)6TAA]，尚存在启动子DE(-1 362 bp到-1 220 bp，distal element)和PE(-113到-70 bp，proximal element)，另外，在其上游还存在一个与苯巴比妥相关的增强子(-3 483 bp到-3 194 bp)[9-12]。本次扩增片段为UGT1A1基因的6个外显子及所有功能元件，但并不包括羧基端的非编码区(引物序列详见表 4)。扩增引物用software Primer 3.0(Whitehead Institute, Cambridge, MA)辅助设计。UGT1A1基因的序列号为：GenBank accession number NT_005120.16。引物位置避开SNP位点，并选取发夹结构形成少的引物，以避免引物二聚体的产生。对所选取的引物用UCSC浏览器进一步检测扩增产物是否为目的片段(详见表 2)。本次一共扩增9个片段，包括了UGT1A1基因的增强子，启动子区TATA盒、DE、PE，外显子1、2、3、4、5a及5b的编码区。在上述引物中，引物Cgt及CDE引用自既往文献。引物设计完成后，在北京华大基因合成。
| 引物名称 | 引物方向 | 序列(5′→3′) | 片段大小/bp | 目的片段 |
| Cgt | 正向 | CACCTCCTCCTTATTCTCTT | 400 | 增强子 |
| 反向 | CTCATTCCTCCTCTCTAGCC | |||
| CDE | 正向 | CTCTAAGCACATCCCCAAGTA | 525 | DE |
| 反向 | TAAGCAAGTTTCCATCCTTCA | |||
| CPE | 正向 | AAGTGAACTCCCTGCTACCTT | 244 | PE |
| 反向 | TCAACAGTATCTTCCCAGCAT | |||
| TATA-E1-1 | 正向 | AGCTCCACCTTCTTTATCTCTGAA | 578 | TATA盒和外显子1上半段 |
| 反向 | TGAGCTCCTTGTTGTGCAGT | |||
| E1-2 | 正向 | GATTCTTTCCTGCAGCGTGT | 649 | 外显子1下半段 |
| 反向 | GCATGTAAAAGTCCCACTCCA | |||
| E2 | 正向 | CAAACACGCATGCCTTTAATC | 500 | 外显子2 |
| 反向 | CAGGGAAAAGCCAAATCTAAGG | |||
| E3 | 正向 | AAGTTGCCAGTCCTCAGAAGC | 546 | 外显子3 |
| 反向 | GTTACTCACATGCCCTTGCAG | |||
| E4 | 正向 | CTGCAAGGGCATGTGAGTAAC | 632 | 外显子4 |
| 反向 | GAGGCAGAACTGCTTGAACG | |||
| E5b | 正向 | TCAAGCTCACTGGTAATAGGC | 483 | 外显子5b编码区 |
| 反向 | CTCCAACTTCTGGGCTCAAG | |||
| E5a | 正向 | CAGGTTTCCTTTCCCAAGTTT | 555 | 外显子5a编码区 |
| 反向 | AAGCACTCTGGGGCTGATTA |
| 单体型 | 位点 | GS个数(频率) n=46 |
对照个数 (频率)n=80 |
PGS 与对照 |
|||||||||
| -3 345 | -3 279 | -1 352 | -40_-39 | 211 | 686 | 715 | 1 091 | 1 253 | 1 456 | ||||
| H1 | C | G | C | G | C | C | C | T | T | 9(0.098) | 45(0.282) | 0.000 | |
| H2 | C | T | A | G | C | C | C | T | T | 8(0.087) | 61(0.381) | 0.000 | |
| H3 | C | G | C | insTA | G | C | C | C | T | T | 33(0.359) | 21(0.131) | 0.000 |
| H4 | C | G | C | insTA | G | A | C | C | T | T | 4(0.043) | 2(0.013) | 0.261 |
| H5 | C | T | A | A | C | C | C | T | T | 29(0.315) | 27(0.169) | 0.007 | |
| H6 | C | G | C | G | C | C | T | T | T | 5(0.054) | 1(0.006) | 0.047 | |
| H7 | C | T | A | G | C | C | C | T | G | 4(0.043) | 0(0.000) | 0.033 | |
| 注：下划线等位基因所示为变异等位 | |||||||||||||
1.2.2 基因组DNA制备及PCR扩增
采用Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega，USA)从5 mL新鲜全血中抽提DNA。按鼎国DNA Taq聚合酶(Beijing Dingguo Changsheng Biotech CO. LTD，China)说明书配制成50 μL PCR反应体系，扩增条件如下:95 ℃ 2 min后，以94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s进行35个循环，再以72 ℃延长7 min。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京华大基因纯化特异性片段并使用原PCR扩增引物测序。
1.2.3 SNP鉴定及基因分型用PolyPhred，program(http://www.genome.washington.edu)进行SNP的鉴定，先通过Consed程序编写拼接序列，然后使用FTP网络资源，在Windows环境下，读取拼接峰图，进行比对。除根据程序提示外，对每一个峰再次进行核查。对于噪音大，背景杂的样品，重新进行PCR扩增，并采用切胶纯化后再进行测序。
1.2.4 H-W检验、LD分析、单体型构建用haploview. lnk(Cambridge，MA 02141，USA)进行LD分析，先制备输入文件，输入文件包括测序结果文件及SNP位点物理距离文件，均为txt格式。该软件可直接输出每个SNP的H-W检验结果，并以点阵图的形式展示LD的结果，可根据需要展示配对r2值或D’值等，并使用Four Famete原则和Solid Spine of LD法定义单体型块。但haploview只能展示单体型频率及tagSNP的结果。对于每个个体的单体型及双体型，则使用基于Bayesian统计方法的PHASE软件来构建，其中模糊不清的单体型可根据家系结果选择，PHASE软件在DOS环境下运行，构建单体型时，选取在一个单体型块内的SNP位点来构建。
1.2.5 统计学分析使用SPSS PASW Statistics(version 18.0)进行等位基因频率、单体型频率、双体型频率的统计分析、比较，采用χ2检验，根据期望值，样本量大小选取不同的双侧检验结果(样本量＞40、期望值＞5：Pearson Chi-Squear；样本量＞40、期望值＜5：Continuity Correction；样本量＜40或期望值＜1：Fisher’s Exat Test)。
2 结果 2.1 UGT1A1基因分型结果在本研究中，在46例无血缘关系的GS患者和80个健康对照者中，除同义突变外，共检测到6个变异类型(详见表 3)，它们分别位于增强子，启动子DE、TATA盒，外显子1、4及5a，而启动子PE、外显子2、3及5b未测到变异。这些变异引起的蛋白质改变、各变异等位的等位基因频率及与对照组的比较结果详见表 3。
变异名称 |
位置氨基酸改 变蛋白改变 |
GS(N=46)纯合子杂合 子等位基因频率 |
对照(N=80)纯合子杂 合子等位基因频率 |
PGS与对照 | dbSNP |
| UGT1A1*60 | 增强子 | 14 | 13 | 0.048 | rs4124874 |
| c.-3279T>G | 23 | 42 | |||
| 0.554 | 0.425 | ||||
| UGT1A1*112 | 启动子DE | 9 | 25 | 0.048 | rs3755319 |
| c.-1352C>A | 23 | 42 | |||
| 0.446 | 0.575 | ||||
| UGT1A1*28 | TATA盒 | 9 | 1 | 0.000 | rs3064744 |
| c.-40_-39insTA | 19 | 21 | |||
| 0.402 | 0.144 | ||||
| UGT1A1*6 | 外显子1 | 6 | 2 | 0.007 | rs4148323 |
| c.211G>A | 17 | 23 | |||
| p.G71R | 0.315 | 0.169 | |||
| UGT1A1*27 | 外显子1 | 1 | 0 | 0.261 | rs35350960 |
| c.686C>A | 2 | 2 | |||
| p.P229Q | 0.043 | 0.013 | |||
| UGT1A1*7 | 外显子5a | 1 | 0 | 0.033 | rs34993780 |
| c.1456T>G | 2 | 0 | |||
| P.Y486D | 0.043 | 0.000 |
位于TATA盒的插入变异c.-40_-39insTA变异，使得野生型的TATA盒从6个TA重复[A(TA)6TAA]变异为7个TA重复[A(TA)7TAA]，该变异在GS组中的等位基因频率明显高于对照组(0.402和0.144；P=6.237E-6)。位于外显子1的c.211G>A变异使UGT1A1基因的第71个密码子从GGA变异为AGA，导致UGT1A1酶氨基酸序列的第71个氨基酸从甘氨酸变异为精氨酸，该变异在GS组中的等位基因频率也明显高于对照组(0.315和0.169；P=0.007)。位于外显子5a的c.1456T>G变异使UGT1A1基因第486个密码子从TAC变异为GAC，导致UGT1A1酶第486个氨基酸从酪氨酸变异为天冬氨酸，该变异的等位基因频率，GS组高于对照组(0.043和0.000；P=0.033)。位于外显子1的c.686C>A变异使UGT1A1基因的的229个密码子从CCG变异为CAG，导致UGT1A1酶氨基酸序列的第229个氨基酸从脯氨酸变异为谷氨酰胺，该变异在GS组和对照组中均可测到，其等位基因频率GS组与对照组无统计学差异(0.043和0.013；P=0.261)。而位于增强子的c.-3279T>G变异和位于启动子DE的c.-1352C>A变异则在GS组、对照组中均可测到，且其等位基因频率在各组中均高于0.300，该两个变异的等位基因频率在GS组与对照组中比较的结果，P值都为0.048，略小于0.05。
2.2 Hardy-Weinberg平衡检验和LD分析结果所有SNP均符合Hardy-Weinberg平衡，P值均大于0.05，相应P值如下：c.-3279T>G (P=1.000)，c.-1352C>A (P=1.000)，c.-40_-39insTA (P=0.104)，c.211G>A (P=0.714)，c.686C>A (P=0.110)，c.1456T>G (P= 0.074)。LD分析显示各个SNP之间存在强LD关系，所有SNP位于一个单体型块内。c.-3279T>G变异和c.-1352C>A变异的配对D’值及r2值均等于1，该两个SNP呈完全LD。除c.-3279T >G和c.-40_-39insTA、c.-1352C>A和c.-40_-39insTA间的配对D’值分别为0.96、0.96外，其余各位点间的配对D’值均为1。
2.3 单个个体单体型构建结果及分析用所测到的6个SNP位点构建单体型，共得到7个单体型(详见表 4)。其中，存在完全连锁不平衡关系的两个SNP c.-3279T>G和c.-1352C>A的两个变异等位c.-1379G和c.-1352A位于不同的同源染色体上，单体型H1和H2除分别含这两个变异等位中的一个变异等位外，不含其他变异等位，其他单体型分别由其他的1个或2个变异等位与这两个存在完全不连锁关系并位于不同的同源染色体上的变异等位(c.-3279G或c.-1352A)相连形成：c.211A、c.1456G变异等位与c.-1352A变异等位分别相连形成单体型H5、H7；c.-40_-39insTA、c.1091T变异等位与c.-3279G变异等位分别相连形成单体型H3和H6；c.686A变异等位和c.-40_-39ins变异等位与c.-3279G变异等位相连形成单体型H4。
除c.-3279G变异等位和c.-1352A变异等位外，c.-40_-39insTA变异等位与c.211A变异等位和c.1456G变异等位也总是存在于不同的同源染色体上，但它们的相应SNP之间并不像SNP c.-3279T>G和c.-1352C>A那样呈完全连锁不平衡的关系。
在这些单体型中，只含有c.-3279G变异等位的单体型H1和只含有c.-1352A变异等位的单体型H2在对照组中占有明显的优势，均高于GS组(0.282和0.098，P=3.160×10-4；0.381和0.087，P=4.557×10-7)；而含有c.-40_-39insTA变异等位的单体型H3和含有c.211A变异等位的单体型H5则在GS组中占有明显的优势，均高于对照组(0.359和0.131，P=2.271×10-5；0.315和0.169，P=0.007)。
2.4 单个个体单体基因型(双体型)结果分析在病例组及对照组中，一共存在17种单体基因型(双体型)(详见表 5)。其中，由单体型H1和H2组成的双体型在对照组中占有明显优势：双体型H1/H1只存在于对照组中；双体型H1/H2和H2/H2的频率高于GS组(0.325和0.065，P=0.001；0.163和0.022，P=0.015)双体型H3/H3、H3/H5和H5/H6在GS组中占有明显优势，其频率远远高于对照组(0.152和0.013，P=0.007；0.239和0.013，P=1.147×10-4；0.273和0.000，P=1.184×10-4)；双体型H5/H5的频率在GS组中也高于对照组(0.130和0.025，P=0.05)。
| 双体型 | 变异等位 | GS(个数/频率) | 对照(个数/频率) | P |
| H1/H2 | [c.-3279G]/[c.-1352A] | 3/0.065 | 26/0.325 | 0.001 |
| H2/H2 | [c.-1352A]/[c.-1352A] | 1/0.022 | 13/0.163 | 0.015 |
| H1/H3 | [c.-3279G]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA] | 2/0.043 | 6/0.075 | 0.750 |
| H1/H4 | [c.-3279G]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA; c.686A] | 1/0.021 | 1/0.013 | 1.000 |
| H1/H5 | [c.-3279G]/[c.-1352A;c.211A] | 2/0.043 | 3/0.038 | 1.000 |
| H1/H6 | [c.-3279G]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA; c.1456G] | 1/0.022 | 1/0.013 | 1.000 |
| H2/H3 | [c.-1352A]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA] | 3/0.065 | 12/0.150 | 0.157 |
| H3/H3 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA] | 7/0.152 | 1/0.013 | 0.007 |
| H3/H4 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA]/[c.-3279G;c.-40_-39insTA; c.686A] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
| H3/H5 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA]/[c.-1352A;c.211A] | 11/0.239 | 1/0.013 | 0.000 |
| H3/H6 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA]/[c.-3279G;c.1091T] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
| H3/H7 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA]/[c.-1352A;c.1456G] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
| H4/H4 | [c.-3279G;c.-40_-39insTA; c.686A]/[c.-3279G；c.-40_-39insTA; c.686A] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
| H5/H5 | [c.-1352A；c.211A]/[c.-1352A；c.211A] | 6/0.130 | 2/0.025 | 0.050 |
| H5/H6 | [c.-1352A；c.211A]/[c.-3279G；c.1091T] | 3/0.273 | 0/0.000 | 0.000 |
| H5/H7 | [c.-1352A；c.211A]/[c.-1352A；c.1456G] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
| H7/H7 | [c.-1352A；c.1456G]/[c.-1352A；c.1456G] | 1/0.022 | 0/0.000 | 0.778 |
3 讨论
c.-3279T>G变异位于UGT1A1基因的增强子上，UGT1A1基因的增强子又称苯巴比妥反应元件(phenobarbital-responsive enhancer module，PBREM)，位于UGT1A1基因的上游(-3 499到-3 210)[11]。含c.-3279G等位的增强子较含c.-3279T等位的增强子而言，其转录活性下降到62%[13]，可导致转录活性下降18%~30%的被认为是白种人的GS致病变异的c.-40_-39insTA变异等位与c.-3279G变异等位连锁[14-15]，构成单体型H3。但c.-3279G等位基因频率是否在GS组中占优势及可否被鉴定为GS的致病变异，不同的研究存在争议：很多个案报道和病例研究在患者中都测到了c.-3279G变异等位，首都医科大学附属北京佑安医院梁晨、郑素军等人在43例包括GS及Crigler-Najjar综合征Ⅱ型的患者中发现，c.3279G等位普遍存在于GS组中高达35%[16]，但在陈志威等人[17]所做的UGT1A1基因与成人高胆红素血症的风险与定量研究中，胆红素水平在正常范围内波动的人群c.3279G等位的基因频率仍高达29.5。在本研究中，c.-3279G等位的等位基因频率在GS组和对照组并无明显的统计学差异(0.554和0.425，P=0.048)，且只包含c.-3279G变异等位的单体型H2在对照组中占有明显的优势，其频率远远高于GS组(0.282和0.098，P=3.16×10-4)；在病例组中占明显优势的是除c.3279G变异等位外，同时存在c.-40_-39insTATA变异的单体型H4(0.359和0.131，P=2.271×10-5)；因此，通过个基因位点的连锁关系分析，本研究阐明了造成c.-3279G变异等位在病例组中集中的原因是c.-40_-39insTATA变异和该变异的连锁关系，c.-40_-39insTATA变异才是GS发病的致病变异和Marker变异基因。
在既往研究中，对于GS的遗传模式存在显性和隐性等争议，白种人普遍存在c.-40_-39insTATA纯合变异，但亚裔人群除c.-40_-39insTATA纯合变异、c.211A等纯合变异外，尚存在c. -40_-39insTA和c.211G>A复合杂合变异，且c. -40_-39insTA和c.211G>A的杂合变异也广泛分布在正常人群中。在本研究中，最重要的是c.-1352C>A变异的鉴定以及该SNP与SNP c.-3279T>G的连锁关系的鉴定。不知何种原因，既往研究较少涉及启动子DE，而启动子DE被鉴定的当时，及在该启动子上鉴定了c.-1352C>A变异，含c.-1352A等位启动子的UGT1A1基因的转录活性为含c.-1352C等位启动子的UGT1A1基因转录活性的85%[10]。本研究的结果显示，c.-1352C>A变异与上述c.-3279T>G变异之间存在完全连锁不平衡的关系，且c.-1352A变异等位和c.-3279G变异等位总是位于不同的同源染色体上，在同一条染色体上，他们非此即彼。且在亚裔人群GS患者中除与白种人相同的c. -40_-39insTA变异等位外，最常见变异是可使胆红素结合的结构域肽段发生构象改变并使UGT1A1酶的活性下降40%[17]的c.211G>A变异，c.211A与c.-1352A构成单体型H5。同样，与c.-3279G类似的是，只包含c.-1352A等位基因的单体型H2在对照组中也同样占有明显优势，其频率亦远远高于GS组(0.381和0.087，P=4.557×10-7)；在病例组中占明显优势的是单体型H5(0.315和0.169，P=0.007)。因此，本研究通过纳入既往病例对照研究中被忽略的c.1352A重要变异等位，阐明了在GS中最常见的变异Maker c. -40_-39insTA和c.211G>A来源于不同的亲体，说明c. -40_-39insTA和c.211G>A复合杂合变异的两个变异来源于不同的亲本，大多数患者表现为“隐性”遗传模式，进一步解释了c. -40_-39insTA和c.211G>A的杂合变异在正常人群中广泛分布的原因。
在本课题组既往的家系研究中也充分证实了通过连锁关系分析所得出的各基因位点的传递关系，c.-40_ -39insTA和c.211G>A总是来源于不同的亲本，且总是分别与c.-3279G和c.-1352A各自相连的连锁关系[18]。同时，本研究进一步分析了千人基因组(发布版本20110521，下载日期为2019年8月9日)中的数据，SNP c.-3279T>G和c.-1352C>A之间仍然存在完全连锁不平衡的关系，且与c.-3279G和c.-1352A各自相连的连锁关系，各等位之间的连锁关系也与本研究结果一致。
本研究进一步分析了GS患者的单体基因型(双体型)，在GS组及对照组中一共存在17种。进一步分析表明只包括c.3279G和c.-1352A的H1和H2所构成的单体型(H1/H1、H1/H2、H2/H2)在对照组中的比例为0.537，而在GS组中的比例仅为0.087；但c.-40_-39insTA和c.211A与之连锁后分别组成的单体型H3、H4、H5、H6和H7构成的双体型(H3/H3、H3/H4、H3/H5、H3/H6、H3/H7、H4/H4、H5/H5、H5/H6、H5/H7、H7/H7)的频率在对照组中仅为0.05，而在GS组中高达0.717。
综上所述，尽管既往研究及本研究在GS患者中测出了众多相关的UGT1A1变异，但通过完整的包括被忽略的重要启动子DE的纳入和分析，本研究进一步阐明了这些变异之间的连锁关系，证明了GS的主要致病变异Marker为来源于不同同源染色体的c.-40_-39insTA变异等位和c.211A变异等位，他们的两两变异是GS发生的主要遗传机制；c.3279G和c.-1352A仅可能发挥剂量效应作用，他们的单独变异不足以导致GS的发生，排除了次要或无关变异位点，本研究的实施对于GS的基因诊断的广泛开展和筛查以及临床转化、兼备诊断等具有重要意义。
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