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TAS102选择性抑制ATRX缺失胶质瘤细胞的实验研究
王龙1, 蒋航1, 陈图南2, 李学刚2, 黄苏娜2, 穆宁2, 冯华2, 李飞2, 张云东1     
1. 401120 重庆,重庆医科大学附属第三医院神经疾病中心;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院神经外科
[摘要] 目的 探讨TAS102对α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因(α-thalassemia mental retardation X-linked, ATRX)缺失U87胶质瘤细胞体外增殖的影响及机制。方法 选择ATRX野生型U87细胞和ATRX敲除的U87ATRX-/-胶质瘤细胞为研究对象,设立U87对照组、U87药物组、U87ATRX-/-对照组、U87ATRX-/-药物组,采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期的变化,β-半乳糖苷酶染色检测细胞老化情况,采用免疫荧光和Western blot检测DNA损伤识别反应通路活化及相关蛋白的表达情况。结果 CCK-8检测结果显示,经不同浓度的TAS102培养72 h,U87ATRX-/-药物组细胞存活率低于U87药物组,U87组细胞IC50值为(10.50±1.52)mg/L,U87ATRX-/-细胞IC50为(4.72±0.48)mg/L,与U87组细胞相比,U87ATRX-/-组IC50更低(P < 0.01)。细胞周期检测示:U87对照组G2期细胞百分比为(17.86±2.12)%,药物组G2期细胞百分比为(23.04±3.57)%;U87ATRX-/-对照组G2期细胞百分比为(18.94±3.05)%,药物组为(61.67±1.13)%, 与U87药物组相比,U87ATRX-/-药物组G2期细胞明显增多(P < 0.01)。β-半乳糖苷酶染色结果示:U87对照组染色阳性细胞百分比为(7.73±0.71)%,药物组为(29.55±4.12)%,U87ATRX-/-对照组为(8.70±2.55)%,药物组为(53.64±7.03)%,与U87药物组相比,U87ATRX-/-药物组染色阳性细胞增多(P < 0.01)。免疫荧光检测53BP1的表达显示,U87对照组染色阳性细胞百分比为(14.5±7.39)%,药物组为(21.19±3.68)%,U87ATRX-/-对照组为(16.75±2.97)%,药物组为(54.27±8.38)%,U87ATRX-/-药物组53BP1表达较U87药物组明显增多(P < 0.05)。Western blot检测不同时间点ATR、CHK1、ATM、CHK2的磷酸化水平,U87ATRX-/-药物组ATM/CHK2的磷酸化水平增高。结论 TAS102能够选择性抑制U87ATRX-/-胶质瘤细胞增殖,通过诱导细胞衰老和活化ATM-CHK2损伤反应通路,引起细胞周期阻滞于G2期,抑制细胞增殖。
[关键词] TAS102    α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因    胶质瘤    DNA损伤    
TAS102 selectively inhibits proliferation of α-thalassemia mental retardation X-linked gene-deficient glioma cells
WANG Long1, JIANG Hang1, CHEN Tunan2, LI Xuegang2, HUANG Suna2, MU Ning2, FENG Hua2, LI Fei2, ZHANG Yundong1     
1. Department of Neurological Diseases, the Third Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401120;
2. Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
[Abstract] Objective To investigate the effect of TAS102 on the proliferation of α-thalassemia mental retardation X-linked (ATRX)-deficient U87 glioma cells in vitro and explore the mechanism. Methods Wild-type glioma U87 cells and ATRX knockout U87 cells (U87ATRX-/-) were both treated with TAS102, and the changes in the cell viability and cell cycle distribution were examined using CCK8 assay and flow cytometry, respectively. Beta-galactosidase staining was used to assess the cell senescence, and immunofluorescence staining and Western blotting were employed to detect the activation of DNA damage recognition reaction pathways and the expression of the related proteins. Results CCK-8 assay showed that TAS102 treatment for 72 h resulted in significantly lower cell viability in U87ATRX-/- cells than in wild-type U87 cells, and its IC50 value was significantly lower in U87ATRX-/- cells than in U87 cells (4.72±0.48 vs 10.50 ±1.52 mg/L, P < 0.01). TAS102 treatment resulted in more cells arrested in G2 phase in U87 cells [(23.04±3.57)% vs (17.86±2.12)%] and in U87ATRX-/- cells [(61.67±1.13)% vs (18.94±3.05)%], and the arrest was more obviously in the knockout cells than the wild-type ones(P < 0.01). Beta-galactosidase staining showed that the positive percentage was (7.73±0.71)% and (29.55±4.12)% in U87 cells and TAS102 treated cells, and (8.70±2.55)% and (53.69±7.03)% in control and treated knockout cells. There were more positive cells in the knockout than the wild-type cells (P < 0.01). Immunofluorescence assay showed that TAS102 treatment increased the percentage of 53BPI-positive cells in both of the cells [control and treated U87 cells: (14.5±7.39)% and (21.19±3.68)%; control and treated U87ATRK-/- A cells: (16.75±2.97)% and (54.27±8.38)%]. but the increment was significantly greater in U87ATRX-/- cells than in U87 cells (P < 0.05). In the phosphorylation levels of ATR, CHK1, ATM and CHK2 at different time points following TAS102 treatment, significant increment was seen in ATM/CHK2 levels in U87ATRX-/-cells. Conclusion TAS102 can selectively inhibit the proliferation of U87ATRX-/- cells by inducing cell senescence, activating ATM-CHK2 damage response pathways, and causing cell cycle arrest in G2 phase.
[Key words] TAS102    α-thalassemia mental retardation X-linked genes    glioma    DNA damage    

在胶质瘤全基因组测序中,约30%的年轻患者有α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因(α-thalass-emia mental retardation X-linked, ATRX)突变[1]。ATRX突变多发生于低级别年轻胶质瘤患者中,在成人原发性胶质母细胞瘤中很少突变[2]。这部分胶质瘤虽然最初生长缓慢,但最终都会进展为胶质母细胞瘤[2, 3]。替莫唑胺是目前胶质瘤的一线化疗药物,主要通过甲基化肿瘤细胞的鸟嘌呤残基,导致细胞周期阻滞和凋亡[4-5]。但是通过对复发肿瘤的研究发现,替莫唑胺治疗会诱导额外的基因突变,从而避免细胞周期停滞或凋亡。所以对于复发或是进展而来的胶质母细胞瘤,替莫唑胺治疗效果差,需要寻找新的治疗靶点和研究化疗药物。TAS102是2015年FDA批准的用于癌症的复方新药,由三氟胸苷(trifluorothymidine, FTD)和胸苷嘧啶磷酸化酶抑制剂(tipiracil hydroch-loride, TPI)组成,其抗癌机制是可以掺入DNA造成损伤、DNA功能障碍[6]。本研究探讨TAS102对ATRX缺失胶质瘤的作用,期望探寻ATRX缺失胶质瘤的治疗靶点。

1 材料与方法 1.1 主要材料

细胞培养基DMEM/F12、胎牛血清、胰酶购于美国Gibco公司。药物: FTD (货号T2255), TPI(货号SML1552),替莫唑胺(Temozolomide TMZ)(货号76899)购于美国Sigma公司。抗体ATRX(sc-55584)购于美国Santa Cruz公司,53BP1、ATM(D2E2)、p-ATM (Ser1981)、ATR、p-ATR、CHk2、p-Chk2、CHK1、p-CHK1购于美国Cell Signaling Technology公司,IDH1- R132H抗体购于美国Millipore公司,β-actin购于美国Affinity公司。细胞周期与细胞凋亡染色试剂盒、细胞衰老-β半乳糖苷酶染色试剂盒购于上海碧云天公司,CCK-8细胞增殖试剂盒购于武汉博士德公司。

1.2 细胞培养

细胞予含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,置于37 ℃、5%CO2 恒温培养箱内培养。

1.3 CCK-8检测细胞增殖活性

取对数生长期的细胞按每孔2 000接种于96孔板,次日更换新鲜含不同浓度的替莫唑胺(100、200、400、800、1 600 μmol/L)和TAS102(1、2、4、8、16 mg/L)培养液,每个浓度设3个复孔,同时设立不加药物的空白对照组,培养72 h后更换为含有10%CCK-8试剂的培养基,培养箱内继续孵育1.5 h后,酶标仪检测450 nm处光密度值[D(450)]。细胞存活率=[D(450)实验孔-D(450)空白孔]/[D(450)对照孔-D(450)空白孔]×100%。

1.4 细胞老化染色

取对数生长期的细胞接种于6孔板,次日更换培养液,对照组更换新鲜培养基,药物组更换为TAS102 2 mg/L的培养基。再培养72 h后进行β-半乳糖苷酶染色,吸出6孔板内细胞培养液,用PBS洗涤1次,每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液,室温固定15 min,吸除细胞固定液,用PBS洗涤细胞3次,每孔加入1 mL染色工作液,用parafilm膜封住6孔板防止蒸发,在无CO2的培养箱37 ℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察计数染色阳性细胞。

1.5 细胞周期检测

取对数生长期的细胞分别接种于6孔板,次日更换培养液及加药物处理,再培养48 h后收集细胞于EP管中,予70%的冰乙醇固定,4 ℃冰箱过夜。次日用PBS离心洗涤2遍后染色,每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37 ℃避光孵育30 min后流式仪上机检测。

1.6 免疫荧光检测

取对数生长期细胞接种于共聚焦培养皿,次日更换培养液及加药处理,再培养48 h,吸出培养液,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%TritonX-100室温通透20 min, PBS洗3遍, 滴加山羊血清封闭30 min,吸干封闭液后加一抗冰箱4 ℃过夜,次日PBST洗3次,吸水纸吸干后加稀释好的二抗室温孵育1 h,PBS洗3次,DAPI染色5 min,PBS洗涤3次后滴加抗荧光淬灭剂封片。共聚焦采集图像。

1.7 Western blot检测

收集经TAS102 2 mg/L处理的不同时间点(0、24、48、72 h)的U87及U87atrx-/-细胞,用含蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解,经BCA法测定蛋白浓度。每孔上样30 μg,6%的预制胶电泳,蛋白转移至PVDF膜,快速封闭液封闭15 min,加一抗4度冰箱孵育过夜,次日TBST洗涤3遍,辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h,ECL发光液显影,用图像分析系统扫描条带。

1.8 统计学分析

细胞增殖、细胞周期、细胞老化等实验均重复3次,计量资料以x±s表示,采用SPSS 25.0统计软件分析数据,组间比较采用两独立样本t检验。

2 结果 2.1 ATRX缺失U87细胞模型的建立

采用CRISPR技术敲除U87胶质瘤细胞中ATRX基因表达,选择ATRX缺失单克隆细胞转染IDH1-R132H进行实验。免疫荧光及Western blot检测结果示:ATRX蛋白在U87细胞中正常表达,在ATRX基因敲除细胞中表达缺失(图 1AB),同时,IDH1-R132H在ATRX敲除细胞中表达(图 1B)。

A:免疫荧光检测ATRX在U87细胞中的正常表达,在U87ATRX-/-细胞中表达缺失;B:Western blot检测U87ATRX-/-细胞中ATRX表达缺失及IDH1-R132H的表达 图 1 U87ATRX-/-细胞模型的鉴定

2.2 TAS102选择性抑制U87ATRX-/-细胞增殖

不同浓度的替莫唑胺处理细胞72 h,随着浓度的增加,两组细胞的存活率都逐渐降低,下降趋势一致(图 2A)。两组细胞存活率差别不显著,表明替莫唑胺对两组细胞的作用差别不大。但经不同浓度的TAS102处理72 h后,U87ATRX-/-细胞存活率下降更明显(图 2B)。采用Graphpad Prism软件计算两组细胞的TAS102 IC50值,U87细胞IC50值为(10.50±1.52)mg/L,U87ATRX-/-细胞IC50值为(4.72±0.48)mg/L。U87ATRX-/-细胞的IC50值更低,差异有统计学意义(P < 0.01,图 2C)。提示TAS102能选择性抑制ATRX缺失胶质瘤细胞的生长。

A:不同浓度的替莫唑胺对细胞存活率的影响;B:不同浓度的TAS102对细胞存活率的影响 图 2 CCK-8检测细胞存活率  (n=3, x±s)

2.3 TAS102导致U87ATRX-/-细胞周期G2期阻滞

予TAS102 2.0 mg/L处理细胞48 h后作细胞周期检测,结果显示:U87对照组G2期细胞百分比为(17.86±2.12)%,U87药物组细胞为(23.04±3.57)%;U87ATRX-/-对照组G2期细胞百分比为(18.94±3.05)%,U87ATRX-/-药物组为(61.67±1.13)%。U87ATRX-/-细胞经TAS102处理后G2期细胞较U87细胞明显增多(图 3P < 0.01),提示TAS102可选择性诱导U87ATRX-/-细胞G2期阻滞。

图 3 流式细胞仪检测各组细胞周期

2.4 TAS102诱导U87ATRX-/-细胞老化

经TAS102 2 mg/L处理72 h后进行β-半乳糖苷酶染色,U87对照组染色阳性细胞百分比为(7.73±0.71)%,U87药物组为(29.55±4.12)%,U87ATRX-/-对照组染色阳性细胞百分比为(8.70±2.55)%,U87ATRX-/-药物组为(53.64±7.03)%。U87ATRX-/-药物组细胞老化更多(P < 0.01),差异有统计学意义(图 4)。

图 4 β-半乳糖苷酶染色检测细胞老化

2.5 TAS102导致U87ATRX-/-细胞DNA损伤,活化ATM-CHK2损伤反应识别通路

经TAS102 2 mg/L处理48 h后用免疫荧光检测细胞53BP1的表达,U87对照组染色阳性细胞百分比为(14.5±7.39)%,U87药物组为(21.19±3.68)%,U87ATRX-/-对照组染色阳性细胞百分比为(16.75± 2.97)%,U87ATRX-/-药物组为(54.27±8.38)%,与U87药物组相比,U87ATRX-/-药物组53BP1表达增多(P < 0.05,图 5)。Western blot检测经TAS102处理后不同时间段细胞ATR、CHK1、ATM、CHK2的磷酸化水平,两组细胞ATR/CHK1磷酸化水平无明显增加(图 6A),U87细胞ATM/CHK2磷酸化水平增加不明显,而U87ATRX-/-组ATM/CHK2磷酸化水平明显增高(图 6B)。

图 5 免疫荧光检测细胞中53BP1表达

1: 0 h; 2: 24 h; 3: 48 h; 4: 72 h  A:ATR、CHK1磷酸化水平;B:ATM、CHK2磷酸化水平 图 6 Western blot检测TAS102处理后不同时间点细胞中ATR、CHK1、ATM、CHK2磷酸化水平

3 讨论

弥漫性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤。和人类身体其他部位恶性肿瘤一样,胶质瘤的发生是随着时间推移累积突变的结果。IDH1/2突变通常被认为是弥漫性胶质瘤的起源事件,IDH失调可能通过致癌代谢物2-羟基戊二酸盐(2HG)引起基因组广泛的超甲基化,随机或者选择性的激活癌基因[7]。如果继续出现P53突变和ATRX缺失,则发展为星形细胞胶质瘤[8]。这类肿瘤经历最初数年的相对缓慢进展,几乎最终都会进展为继发胶质母细胞瘤。因此,从分子病理学角度可以将具有IDH突变、P53突变、ATRX缺失的胶质瘤定义为星形细胞来源的继发胶质母细胞瘤[9]。目前针对ATRX缺失胶质瘤的研究缺乏,部分原因是缺少理想的细胞和动物模型。在胶质瘤中,所有ATRX的突变都是失活的并且可以导致蛋白表达的缺失[10]。我们采用CRISPR/CAS9技术建立ATRX敲除的胶质瘤细胞模型,并采用慢病毒稳定转染IDH1-R132H,建立了IDH1突变、ATRX缺失的胶质瘤细胞模型, 因此,本研究模拟了继发胶质母细胞瘤的细胞模型,符合胶质瘤的临床特征,研究更具临床意义。

TAS102是胸腺嘧啶核苷酸类似物FTD和TPI按(1 :0.5)比例组成的复合物,FTD是其抗肿瘤的主要活性成分,TPI可抑制FTD在体内的降解[11]。核苷酸类似物是抗肿瘤治疗的一个重要手段,它可以掺入DNA取代正常的碱基造成DNA损伤。本研究通过CCK8检测细胞增殖实验发现U87ATRX-/-细胞对TAS102更敏感(图 2B)。接着通过流式仪进行周期检测,发现TAS102处理48 h后G2期细胞增多,但U87ATRX-/-细胞G2期细胞增多更明显,说明TAS102处理后引起细胞阻滞于G2期。既往的研究也发现,FTD导致细胞周期阻滞于G2[12]。本研究中细胞周期阻滞和细胞增殖抑制趋势相符合,进一步证实了TA102能选择性作用于ATRX缺失的胶质瘤细胞,抑制细胞增殖。

细胞周期阻滞是细胞老化的基本特征,老化是细胞因各种因素如DNA损伤,端粒长度过短、缺氧等使细胞失去分裂能力而发生不可逆的细胞周期阻滞的一种状态[13]。β-半乳糖苷酶染色是目前检测细胞老化最广泛的方法,我们采用此法染色见,经TAS102处理72 h后,U87ATRX-/-细胞老化更明显,表现为细胞体积增大,形态扁平变长,胞质内呈深蓝色。衰老细胞分泌细胞因子,可促进免疫系统清除肿瘤,因此,诱导衰老可能是治疗癌症的一条途径[14]。ATRX是促进静止细胞向衰老转化的关键调控因子[15],ATRX缺失通过抑制衰老途径为癌细胞生长提供有利条件,诱导衰老可以考虑作为ATRX缺失胶质瘤的一种治疗策略。因此, 本研究发现TAS102能够诱导细胞衰老,也可能是其能选择性抑制ATRX缺失细胞的机制。

TAS102主要的抗癌机制是掺入DNA造成DNA损伤,已经证实FTD与DNA结合会在细胞周期的G2/M期诱导形成双链断裂损伤[16]。53BP1是DNA损伤反应的主要介导因子之一,是针对DNA双链断裂损伤做出反应的重要调控因子,在调控DNA双链断裂损伤修复的途径中起着关键作用[17-18]。本研究采用免疫荧光检测了TAS102处理后53BP1的聚集情况,证实了U87ATRX-/-细胞DNA损伤更重。ATM是DNA双链断裂损伤识别和修复的关键蛋白,ATM是CHK2的上游调节因子,ATM磷酸化后,引起CHK2的磷酸化,通过调节细胞周期检控点,引起细胞周期阻滞[19]。本研究发现两组细胞在识别DNA单链断裂损伤的ATR-CHK1通路的磷酸化水平差别不大,而在ATM-CHK2通路,ATRX缺失组磷酸化水平明显增高,说明TAS102引起U87ATRX-/-细胞的双链断裂损伤,从而活化ATM/ChK2通路,引起细胞周期阻滞。综上所述,本研究结果表明,TAS102可以选择性作用于U87ATRX-/-细胞,抑制细胞增殖,引起细胞周期G2期阻滞,其机制是通过造成DNA双链断裂损伤,活化ATM/CHK2通路和诱导细胞老化。

DNA损伤修复反应(DNA-damage response, DDR)触发细胞机制以保持基因组稳定性,包括DNA损伤感知,细胞周期调节和DNA修复[20]。基因富集分析发现ATRX主要在细胞周期、DNA损伤修复相关途径富集[21]。在HeLa细胞中进行的一项研究表明,siRNA下调ATRX会导致有丝分裂过程中异常的染色体融合[22]。胶质瘤中ATRX的丢失诱导微卫星不稳定,微卫星是重复的单核苷酸或二核苷酸序列,以易错的方式复制,导致突变率增加[23]。这些研究说明ATRX在保持基因组稳定性中发挥重要作用,ATRX缺失会导致DDR缺陷。所以,本研究发现TAS102能够选择性的作用于U87ATRX-/-缺失胶质瘤细胞,一方面可能是因为ATRX缺失后细胞存在DDR缺陷,对DNA损伤剂更敏感。另一方面,TAS102主要的抗癌机制是诱导DNA双链断裂损伤,FTD与DNA结合后主要通过同源重组(HR)途径诱导DNA双链断裂损伤[24],而ATRX缺失的肿瘤在修复外源性诱导的双链断裂损伤方面存在缺陷[25]。所以,本研究结果也说明了ATRX缺失的胶质瘤细胞对诱导DNA双链断裂的损伤因子更敏感,干扰HR修复通路可能是ATRX缺失胶质瘤的有效治疗策略。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201907113
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

王龙, 蒋航, 陈图南, 李学刚, 黄苏娜, 穆宁, 冯华, 李飞, 张云东
WANG Long, JIANG Hang, CHEN Tunan, LI Xuegang, HUANG Suna, MU Ning, FENG Hua, LI Fei, ZHANG Yundong
TAS102选择性抑制ATRX缺失胶质瘤细胞的实验研究
TAS102 selectively inhibits proliferation of α-thalassemia mental retardation X-linked gene-deficient glioma cells
第三军医大学学报, 2019, 41(24): 2393-2400
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(24): 2393-2400
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201907113

文章历史

收稿: 2019-07-15
修回: 2019-08-29

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