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瞬时受体电位通道A1促进盆腔神经损伤小鼠结肠动力恢复的实验研究
张勇, 田跃, 郑恢超, 戴飞翔, 史惠文, 王李, 童卫东     
400042 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院普通外科
[摘要] 目的 探讨瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential ankyrin 1, TRPAl)在去盆腔神经支配(pelvic nerve denervation,PND)小鼠结肠动力适应性恢复中的作用。方法 将108只C57小鼠采用随机数字表法分为两组(n=54):PND模型组、假手术组。两组依据干预措施分别再分为3组(n=18):无干预组、TRPA1激动剂(姜黄素)处理组、TRPA1拮抗剂(HC-030031)处理组。另将30只TRPA1基因敲除小鼠随机分为2组(n=15):PND模型组、假手术组。建立PND小鼠模型,术中盲肠预置管以进行结肠传输试验。结肠传输功能分别在术后第1、3、7天测定。结果 与假手术组相比,PND模型组小鼠术后第1天传输功能显著降低(P < 0.001),术后第3天的结肠传输功能有恢复趋势但仍然降低(P=0.040),至第7天,两组传输功能的差异无统计学意义(P=0.073)。经TRPA1激动剂(姜黄素)干预后,与对照组(无干预假手术组)相比,干预后假手术组结肠传输功能明显增强(P < 0.001),PND模型组小鼠术后第1天和第3天的结肠传输功能无差异(P=0.304、0.065),至第7天,PND模型组传输功能显著增高(P=0.001)。相反,TRPA1拮抗剂(HC-030031)干预后,PND模型组与对照组相比,小鼠术后第1、3、7天的结肠传输功能均显著下降(P < 0.05),结肠传输功能无恢复趋势。对TRPA1基因敲除小鼠观察到的结果与应用TRPA1拮抗剂的结果一致。免疫组化结果显示:TRPA1表达于小鼠结肠黏膜,小鼠去盆腔神经支配后,TRPA1出现先下降、后逐渐升高的适应性恢复趋势。结论 小鼠去盆腔神经支配后存在结肠动力适应性恢复现象,TRPA1表达于结肠黏膜,可显著促进PND小鼠的结肠动力恢复。
[关键词] 瞬时受体电位通道A1     去神经支配     盆腔神经损伤     结肠动力     姜黄素     HC-030031    
Transient receptor potential ankyrin 1 promotes recovery of colonic motility following pelvic nerve injury in mice
ZHANG Yong, TIAN Yue, ZHENG Huichao, DAI Feixiang, SHI Huiwen, WANG Li, TONG Weidong     
Department of General Surgery, Daping Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042, China
[Abstract] Objective To investigate the role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) in the recovery of colonic motility following pelvic nerve denervation (PND) in mice. Methods A total of 108 male C57 mice were randomized into PND model group (n=54) and sham operation group (n=54), and in each group, the mice were further randomized into untreated group, TRPA1 agonist (curcumin) treatment group, and TRPA1 antagonist (HC-030031) treatment group. Another 30 male TRPA1 knockout mice were also randomized into PND group (n=15) and sham operation group (n=15). All the mice underwent open surgery for PND by severing the pelvic nerve or received sham operation, and during the operation, a silicone tube was embedded in the cecum near the colon for testing colonic transit function on postoperative days 1, 3, and 7. Results Compared with the sham-operated mice, the PND mice showed significantly decreased colonic transit function on postoperative days 1 (P < 0.001) and 3 (P=0.040) but had comparable transit function on day 7. Compared with the sham-operated mice without any interventions (control group), curcumin treatment resulted in significantly enhanced colonic transit function in the sham-operated mice (P < 0.001), and promoted nearly full recovery of colonic transit function in PND mice on postoperative days 1 (P=0.304 vs control) and 3 (P=0.304 vs control) and even further enhancement on day 7 (P=0.001). In PND mice, treatment with the TRPA1 antagonist HC-030031 significantly lowered colonic transit function (P < 0.05) without any signs of recovery. The results of colonic transit test in TRPA1 knockout mice were consistent with those in HC-030031-treated PND mice. The results of immunohistochemistry showed that TRPA1 was expressed in the colonic mucosa of the mice, and PND caused a transient decrease in TRPA1 expression followed by a gradual recovery. Conclusion The colonic motility shows an adaptive recovery mechanism after PND in mice. TRPA1, which is expressed in the colonic mucosa of mice, can significantly promote colonic motility recovery following PND in mice.
[Key words] transient receptor potential ankyrin 1     denervation     pelvic nerve injury     intestinal motility     curcumin     HC-030031    

盆腔手术、外伤及产伤等极易出现排便功能障碍,其主要原因之一是盆腔神经的损伤[1]。特别是中低位直肠癌保肛手术后,80%~90%的患者可出现直肠前切除综合征,表现为直肠肛门坠胀、便意频繁、排便不尽等一系列排便功能障碍症状,严重影响患者的生活质量[2-3]。临床上观察到,这些排便障碍症状随时间推移有减轻的趋势[4]。因此推测机体存在适应性恢复机制,但详细的调控机制并不清楚。我们前期研究发现:在大鼠去盆腔神经支配(pelvic nerve denervation,PND)后,大鼠结肠黏膜中瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential ankyrin 1, TRPAl)的表达出现先下调后恢复的趋势,与肠道动力的恢复趋势一致,提示大鼠PND后肠动力恢复与TRPA1有关[5-7]。在小鼠是否存在同样的现象尚不清楚。同时,为进一步明确TRPA1在PND后结肠动力适应性恢复中的作用,需要利用TRPA1基因敲除小鼠进行研究。为此,本研究建立PND小鼠模型,观察TRPA1基因缺失及TRPA1激动剂、拮抗剂干预对结肠动力的变化,以明确TRPA1在小鼠PND后结肠动力变化中的作用,为更深入研究其机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠108只,鼠龄8~10周,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[许可证号:SCXK(京)2016-0002,批号:1103241911019180],体质量(24.3±1.8)g。清洁级雄性TRPA1基因敲除小鼠(C57BL/6J背景)30只,鼠龄8~10周,体质量(25.2±3.6)g,由本院祝之明教授惠赠。实验动物饲养于室温25 ℃、湿度65%~70%,自然光照周期,术前标准配方鼠粮喂养,自由摄取食水。

1.2 主要试剂

包括:4%多聚甲醛(北京索莱宝生物科技有限公司),5%水合氯醛(北京雷根生物技术有限公司),TRPA1激动剂(姜黄素,以色列Alomone labs)[8];TRPA1拮抗剂(HC-030031,美国Selleck Chemicals)[9];亚甲基美兰溶液(北京雷根生物技术有限公司)。兔抗TRPA1抗体购自以色列Alomone labs;免疫组化试剂SP9001及DAB试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 动物分组

108只雄性野生型C57小鼠按照随机数字表法分为两组,每组54只:①PND模型组;②假手术(sham)组。两组依据干预措施的不同均分为:①无药物处理组;②TRPA1激动剂姜黄素处理组;③TRPA1拮抗剂HC-030031处理组,每组18只。30只雄性TRPA1基因敲除小鼠按照随机数字表法分为两组,每组15只:①PND模型组;②假手术组。

1.4 模型制备

① PND模型组:PND模型小鼠建立方法参考文献[10],5%水合氯醛(0.4 mg/g)腹腔注射麻醉小鼠后,取下腹正中切口,长约2 cm,湿纱布隔离小肠于腹上区。解剖显微镜(日本OLYMPUS公司,型号:SZ61-SET)下辨认膀胱、直肠、精囊腺及前列腺,用棉签在前列腺后下方钝性剥离出盆腔神经,用显微剪剪断。缝合切口,关闭腹腔。因切断盆腔神经会导致尿潴留,每天按摩膀胱协助小鼠排尿2次(图 1)。②假手术组:水合氯醛麻醉后,与PND模型组选择同样腹部切口开腹,暴露盆腔约20 min后,关闭腹腔。所有术后小鼠单只分笼喂养,不限饮食,饲养环境温度25 ℃,相对湿度65%~70%,观察小鼠精神状态和进食、饮水及活动情况。TRPA1基因敲除小鼠:PND模型组与假手术组模型建立同上。

A:小鼠盆腔神经解剖图  G:盆腔神经节;PN:盆腔神经(黑色丝线标记处为盆腔神经离断处);HGN:腹下神经;B:离断盆腔神经后,小鼠膀胱尿潴留 图 1 PND模型的建立

108只C57小鼠中有6只死亡,其中假手术组死亡3只,PND模型组死亡3只,有4只因术后感染死亡,另2只因膀胱破裂死亡。TRPA1基因敲除小鼠无死亡。PND组小鼠术后出现尿潴留,证明模型制备成功。

1.5 结肠传输实验

所有小鼠需盲肠置管测量结肠传输功能。具体方法参见文献[11]:小鼠开腹后,沿皮下经左侧腹壁至颈后做一皮下隧道,并开口于颈后皮肤,将硅胶管(直径约2 mm)一段由皮肤开口处经皮下隧道引致腹腔。术中显露盲肠,用6-0丝线预置缝合荷包,在盲肠造口,从此造口将硅胶管放置距近端结肠约0.5 cm,而后拉紧预置的荷包并结扎固定,关腹,并将硅胶管另一端固定于颈后皮肤上。术后第1、3、7天将0.1 mL的亚甲蓝混合液缓慢由预置的硅胶管注入结肠,随后再注入0.1 mL空气使亚甲蓝全部进入结肠。

TRPA1激动剂(姜黄素)处理组分别在术后第1、3、7天经盲肠预置的导管缓慢注入亚甲蓝与姜黄素溶液(100 mg/kg)混合液0.1 mL,随后注入0.1 mL空气使导管中混合液全部进入结肠。TRPA1拮抗剂(HC-030031)处理组分别在术后第1、3、7天经盲肠预置的导管缓慢注入亚甲蓝与HC-030031溶液(100 mg/kg)混合液0.1 mL,随后注入0.1 mL空气使导管中混合液全部进入结肠。TRPA1基因敲除小鼠分别在术后第1、3、7天将0.1 mL的亚甲蓝混合液缓慢由预置的硅胶管注入结肠,随后再注入0.1 mL空气使亚甲蓝全部进入结肠。结肠传输比例测量参考文献[12]:所有分组中的小鼠在注入亚甲蓝20 min后立即处死,将整段结肠取出,用直尺测量亚甲蓝染色部分长度,计算该长度占结肠百分比,此百分比即为结肠传输比例。

1.6 结肠组织免疫组化检测

标本取下后均固定于4%多聚甲醛溶液12 h,然后进行石蜡包埋,切片厚度为5 μm。按照SP9001试剂盒说明书,采用超敏3步法进行TRPA1免疫组化染色,再应用DAB溶液显色。显色后切片用自来水进行充分冲洗,苏木精复染,二甲苯透明,中性树脂封片。待中性树脂风干后,对每组小鼠结肠黏膜TRPA1免疫组化染色切片于200×视野下相同条件拍照,采用ImageJ软件进行半定量分析,分别测定每个视野下的阳性染色平均光密度值(MOD)并进行统计分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以x±s表示,相同时相点组间比较采用独立样本t检验,两两比较应用LSD检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 PND对小鼠结肠传输功能的影响

与假手术组相比,PND模型组小鼠术后第1天和第3天的结肠传输功能均显著降低(P < 0.001,P=0.040),至第7天,两组传输功能的差异无统计学意义(P=0.073)。假手术组小鼠术后第1、3、7天的结肠传输功能差异无统计学意义,PND小鼠结肠动力存在恢复性趋势(图 2)。

a:P < 0.05,与假手术组比较 图 2 PND对小鼠结肠传输功能的影响

2.2 TRPA1激动剂(姜黄素)对PND小鼠结肠动力恢复的影响

与无干预的假手术组(对照组)相比,经过TRPA1激动剂干预后的假手术组第1、3、7天的结肠传输功能显著增强(P < 0.001);PND模型组小鼠术后第1天和第3天的结肠传输功能差异无统计学意义(P=0.304、0.065),至第7天,PND模型组传输功能显著增强(P < 0.001)。与姜黄素干预假手术组相比,PND模型组小鼠术后第1天和第3天的结肠传输功能均显著降低(P=0.001,P < 0.001),至第7天,两组传输功能的差异无统计学意义(P=0.302),结肠传输功能随时间呈适应性恢复趋势且传输功能显著增加(图 3)。

a:P < 0.05,与对照组比较; b:P < 0.05,与姜黄素干预假手术组比较 图 3 TRPA1激动剂(姜黄素)对PND小鼠结肠传输功能的影响

2.3 TRPA1拮抗剂(HC-030031)对小鼠结肠动力恢复的影响

与无干预的假手术组(对照组)相比,经过TRPA1拮抗剂干预后的假手术组(P=0.013、0.009、0.021)、PND模型组小鼠(P=0.001,P < 0.001,P=0.040)术后第1、3天和第7天的结肠传输功能均显著降低,两组结肠传输功能均受到显著抑制,且未观察到适应性恢复趋势(图 4)。

a:P < 0.05,与对照组比较 图 4 TRPA1拮抗剂(HC-030031)对PND小鼠结肠传输功能的影响

2.4 TRPA1基因缺失对小鼠结肠动力恢复的影响

与无干预的野生型小鼠假手术组(对照组)相比,术后第1、3、7天TRPA1基因敲除小鼠的假手术组(P=0.021、0.024、0.007)和PND模型组(P=0.003、0.001,P < 0.001)的结肠传输功能均显著降低,两组结肠传输功能均受到抑制。TRPA1基因敲除小鼠PND模型组与假手术组术后第1、3、7天差异无统计学意义,术后结肠传输功能无恢复趋势(图 5)。

a:P < 0.05,与野生型对照组比较 图 5 TRPA1基因缺失对小鼠结肠传输功能的影响

2.5 TRPA1在小鼠结肠组织的表达定位

假手术组、PND模型组TRPA1均表达于小鼠结肠黏膜。与假手术组相比,PND模型组术后第1天TRPA1表达明显降低(P < 0.001);第3、7天结肠黏膜TRPA1表达逐渐增高,呈现恢复性趋势(表 1图 6)。

表 1 PND模型组与假手术组小鼠结肠组织中TRPA1的表达(n=18,x±s)
组别 术后1 d 术后3 d 术后7 d F P
PND模型组 0.135±0.007 0.162±0.005 0.196±0.005 154.448 0.000
假手术组 0.218±0.014 0.225±0.019 0.231±0.024 0.614 0.554
t 0.931 8.313 10.324
P 0.000 0.000 0.015

A:PND组术后1 d;B:假手术组术后1 d;C:PND组术后3 d;D:假手术组术后3 d;E:PND组术后7 d;F:假手术组术后7 d 图 6 免疫组化检测各组小鼠结肠组织中TRPA1的表达(S-P ×200)

3 讨论

低位直肠癌根治术、产伤及创伤所致的盆腔神经损伤是引起排便功能障碍的主要原因,临床处理较为困难。少部分患者随时间推移有一定改善,这种代偿性恢复的机制尚不清楚,并且这种适应性恢复的时间较长,通常在12个月左右,程度也有限[4]。如果能够阐明这种适应性恢复的机制,就有希望实施相应的干预措施,加速患者的恢复过程。

本研究在小鼠PND模型上观察到与大鼠类似的结肠动力适应性恢复现象[5],提示盆腔神经损伤后的适应性恢复现象是广泛存在于哺乳动物的。为进一步明确TRPA1在PND后结肠动力恢复中的作用,本研究观察了TRPA1激动剂(姜黄素)对PND小鼠结肠动力的作用,发现姜黄素可显著促进PND小鼠结肠动力。相反,应用TRPA1拮抗剂(HC-030031)后,结肠传输功能显著下降,且PND小鼠的适应性恢复的趋势消失,提示TRPA1在PND后小鼠肠道动力适应性恢复中发挥核心作用。

为进一步验证TRPA1在PND后结肠动力恢复中的核心作用,本研究采用TRPA1基因敲除小鼠建立PND模型。发现TRPA1基因敲除后,PND小鼠结肠动力较野生型小鼠结肠显著减慢,而且结肠动力的适应性恢复趋势消失。证明TRPA1是PND小鼠结肠动力适应性恢复机制中不可替代的作用点。BRIERLEY等[13]在离体电生理研究中观察到TRPA1在维持迷走神经、内脏和盆腔神经传入的特定亚群中对肠道正常的机械性感觉功能是必需的。这也间接印证了本研究的结论。TRPA1在PND小鼠的肠道动力恢复中通过何种信号通路发挥作用,尚不明确。前期研究发现肠黏膜嗜铬细胞(EC细胞)高表达TRPA1[14-15],因此推测与5-HT相关受体途径有关,尚需更进一步的研究以证实。

本研究不足之处在于:只观测了结肠传输功能,未能实时监测结肠动力波的变化;另外,对TRPA1下游的信号通路未进行探讨。

综上所述,本研究利用小鼠基因敲除PND模型及相关干预措施,进一步证明TRPA1是盆腔神经损伤后肠道动力适用性恢复中不可替代的关键点,TRPA1激动剂有望在此类肠动力紊乱疾病中发挥治疗作用,其详细机制及新药开发有待进一步深入探讨。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201907111
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张勇, 田跃, 郑恢超, 戴飞翔, 史惠文, 王李, 童卫东.
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瞬时受体电位通道A1促进盆腔神经损伤小鼠结肠动力恢复的实验研究
Transient receptor potential ankyrin 1 promotes recovery of colonic motility following pelvic nerve injury in mice
第三军医大学学报, 2019, 41(22): 2152-2157
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(22): 2152-2157
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201907111

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收稿: 2019-07-14
修回: 2019-08-29

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