2. 402260 重庆,重庆市江津区中心医院肿瘤科
2. Department of Oncology, Jiangjin District Central Hospital, Chongqing, 402260, China
结肠直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年上升,也是癌症相关死亡的第3大原因。虽然在治疗CRC方面取得了巨大的成就,但是由于其转移的频繁,CRC的预后仍然很差[1-2]。新型肿瘤相关基因富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11,PRR11)位于染色体17q22上,编码360个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示PRR11含有2个富含脯氨酸区域和1个锌指结构域,其中锌指结构域可以结合双链DNA并调节基因转录。研究发现PRR11在结直肠癌组织中高表达,且与结直肠癌的发生、发展存在明显的相关性[3-4]。一项新的研究还表明:PRR11在细胞周期进程中受到严格调控,并在人肺癌来源的H1299细胞中诱导过早的染色质浓缩。PRR11是细胞周期依赖性的,与各种肿瘤的发生、发展密切相关,并且在肺癌、肝门胆管癌和胃癌等细胞中高表达,敲除PRR11可导致细胞周期停滞和细胞增殖、迁移和侵袭的抑制[5-9]。本研究分析PRR11在结直肠癌中的表达和临床意义,以及RNA干扰和过表达对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响,探讨PRR11对结直肠癌的作用,为探究其分子机制打下基础。
1 材料与方法 1.1 组织及细胞来源选取2015年1月至2018年3月在重庆市江津区中心医院病理科经甲醛固定和石蜡包埋的结直肠癌组织切片136例和对应癌旁组织68例,患者术前均未接受过任何抗肿瘤治疗。1株人正常结直肠上皮细胞HCoEpiC和3株人结直肠癌细胞SW480、HT29、HCT116购于中国科学院上海细胞库。
1.2 试剂主要试剂:PRR11鼠抗人单克隆抗体(TA800457)、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒购于美国OriGene公司;PRR11鼠抗人单克隆抗体(OTL1C1)购于美国Invitrogen公司;E-cadherin鼠抗人单克隆抗体(ab1416)、Vimentin兔抗人单克隆抗体(ab92547)、β-catenin兔抗人单克隆抗体(ab32572)购于美国Abcam公司;总RNA提取试剂盒Total RNA Kit、反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription System Kit和荧光定量PCR试剂盒GoTaq® qPCR Master Mix Kit购于美国Promega公司;Transwell小室购于上海玉博生物科技有限公司;BD Matrigel基质胶购于美国Corning公司;PRR11sh-RNA和si-RNA慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成。
1.3 方法 1.3.1 免疫组织化学检测将选取的蜡块进行3 μm连续切片,严格按照S-P试剂盒说明书操作,一抗PRR11(1 :50)在4 ℃中孵育过夜,二抗孵育后DAB染色,苏木精复染,最后封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。染色结果判定:以胞浆和胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。染色强度评分:无染色为0分;弱阳性染色为1分;适度颗粒状染色为2分;强烈弥散和均匀的阳性染色为3分。阳性细胞百分率计分:无阳性细胞为0分;<10%为1分;10%~50%为2分;>50%~75%为3分;>75%为4分。以阳性细胞百分率与染色强度乘积判断:0~3分为阴性,>3分为阳性。同一切片由2位经验丰富的病理科医师独立确定。
1.3.2 细胞培养采用RPMI1640培养基(10%胎牛血清),培养于细胞培养箱(5%CO2、37 ℃)中。
1.3.3 总蛋白提取和Western blot检测采用RIPA裂解缓冲液从培养的细胞(HCoEpiC、SW480、HT29、HCT116)中提取蛋白质,BCA法测定蛋白浓度,10%的SDS-PAGE分离胶电泳分离蛋白质裂解物,用湿转方法将蛋白转至PVDF膜,5%BSA溶液封闭2 h后,将PVDF膜置于PRR11单克隆抗体稀释液(1 :1 000)中,4 ℃下孵育过夜,TBST脱洗3次、5 min/次,然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下孵育1 h,TBST脱洗,最后采用Super Singal West Dura发光试剂盒检测蛋白信号,X胶片曝光。以β-actin作为内参蛋白,所用稀释比例为1 :5 000。同样方法检测PRR11过表达和沉默后PRR11和EMT相关信号分子蛋白水平的变化,所用一抗稀释比例β-catenin(1 :5 000)、E-cadherin(1 :50)、Vimentin(1 :2 000),山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均为(1 :5 000)。
1.3.4 总RNA提取和RT-PCR检测PRR11、GAPDH引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司,内参GAPDH上游引物:5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′,下游引物:5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′, 产物长度为106 bp;PRR11上游引物:5′-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3′,下游引物:5′-CTCTGGGT T-ATGCAGTTCTGG-3′, 产物长度为118 bp。采用TRIzol试剂从培养的细胞中提取总RNA并测定其浓度和D(260)/D(280)比值,使用反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription System Kit将总RNA逆转录为cDNA, 最后使用荧光定量PCR试剂盒GoTaq® qPCR Master Mix Kit进行定量PCR检测。反应体系为20 μL,反应程序为:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火10 s,95 ℃延伸15 s,共计40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对基因表达。
1.3.5 慢病毒转染LV-PRR11和LV-PRR11-RNAi慢病毒转染:选取对数生长期、状态好的结直肠癌细胞HT29做慢病毒转染,以4×105个细胞铺于6孔板,设置LV-PRR11、LV-PRR11-RNAi、LV-PRR11 NC和LV-PRR11-RNAi NC组,根据转染说明书,在感染时加入感染增强液HiTransG P 8 μg/mL。转染后72 h,用荧光显微镜观察转染效率,嘌呤霉素用于筛选稳定的细胞系。
1.3.6 细胞划痕修复实验取转染后稳定表达的各组细胞以1×106/孔的密度接种于6孔板,并在培养箱中培养过夜。每孔用200 μL无菌枪头在正中及两侧划3条平行的直线,PBS洗3次,用无血清培养基进行饥饿培养,沿划痕在0~72 h观察并记录细胞迁移情况。
1.3.7 Transwell实验测定HT29细胞的迁移和侵袭能力。将Transwell小室置于24孔板中,先用BD Matrigel基质胶60 μL包被Transwell小室,再将重悬于无血清培养基中的转染后HT29细胞以1×105/孔接种于Transwell小室中,并将600 μL RPMI1640(含10%FBS)加入Transwell小室下层。在细胞培养箱(5%CO2、37 ℃)中培养24 h后,用湿棉签擦拭残留于上层的细胞和基质胶,甲醛固定15 min,PBS洗小室2次,再用0.5%结晶紫染色20 min,PBS洗2次,固定后用倒置显微镜成像观察,随机选择5个区域(100×)计数侵入的细胞数量。根据相同的方法,在没有基质胶的Transwell小室中研究细胞迁移能力。
1.3.8 免疫荧光观察取转染后的各组细胞在6孔板中进行细胞爬片,将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次后,用4%多聚甲醛固定爬片15 min,PBS洗3次,0.5%Triton X-100室温通透20 min,PBS洗3次后用山羊血清封闭30 min,再加入β-catenin(1 :250)一抗,4 ℃孵育过夜,用TBST洗涤爬片3次,并在室温下与荧光染料偶联的二抗(1 :500)孵育1 h后,滴加DAPI进行核复染,最后用含荧光淬灭剂的封片液封片。
1.4 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,数据以x±s表示,组间差异采用独立样本t检验,PRR11的表达与临床病理参数之间的关系采用χ2检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 PRR11在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌患者临床特征的关系PRR11的表达定位于细胞质/细胞膜内,结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(P < 0.01,表 1、图 1)。PRR11的表达与临床因素包括远处转移、肿瘤大小和肿瘤分期有关(P < 0.05),而与年龄、性别、分化程度、肿瘤浸润深度和淋巴结转移无关(表 2)。
临床特征 | n | PRR11表达 | χ2值 | P值 | |
高表达 | 低表达 | ||||
年龄/岁 | |||||
≥60 | 79 | 52 | 27 | 2.407 | 0.121 |
< 60 | 57 | 30 | 27 | ||
性别 | |||||
男 | 76 | 48 | 28 | 0.590 | 0.442 |
女 | 60 | 34 | 26 | ||
肿瘤分化程度 | |||||
低分化 | 48 | 30 | 18 | 0.151 | 0.698 |
中、高分化 | 88 | 52 | 36 | ||
肿瘤浸润深度 | |||||
肌层以内 | 23 | 9 | 14 | 3.270 | 0.071 |
肌层以外 | 113 | 73 | 40 | ||
淋巴结转移 | |||||
阳性 | 72 | 48 | 24 | 2.595 | 0.107 |
阴性 | 64 | 34 | 30 | ||
远处转移 | |||||
阳性 | 23 | 19 | 4 | 5.758 | 0.016 |
阴性 | 113 | 63 | 50 | ||
肿瘤长径/mm | |||||
≥50 | 86 | 58 | 28 | 4.992 | 0.025 |
< 50 | 50 | 24 | 26 | ||
肿瘤分期 | |||||
Ⅰ/Ⅱ | 64 | 31 | 33 | 7.099 | 0.008 |
Ⅲ/Ⅳ | 72 | 51 | 21 |
2.2 PRR11在结直肠癌细胞中的表达
在HCoEpiC、SW480、HT29和HCT116细胞中,RT-PCR检测结果显示,3种癌细胞(SW480、HT29和HCT116)中PRR11 mRNA的表达显著高于正常结直肠上皮细胞HCoEpiC(P < 0.05),且PRR11在HT29细胞中表达最高(图 2A);Western blot检测结果表明:3种癌细胞中PRR11蛋白的表达显著高于正常结直肠上皮细胞(P < 0.05),且在SW480和HT29细胞中表达量相对较高(图 2B、C)。
2.3 过表达PRR11促进HT29细胞的迁移和侵袭
LV-PRR11慢病毒瞬时转染HT29细胞,筛选稳定的细胞系后,Western blot检测结果显示:LV-PRR11组蛋白表达明显高于LV-PRR11 NC组(0.75±0.14 vs 0.43±0.11,P < 0.05,图 3A),表明靶向PRR11的LV-PRR11能在蛋白水平有效过表达PRR11;Transwell实验结果显示:LV-PRR11组的细胞较LV-PRR11 NC组有更强的迁移和侵袭能力(P < 0.05,图 3B、C);划痕试验结果显示:LV-PRR11组的细胞迁移能力较LV-PRR11 NC组强(图 3D)。表明PRR11在结直肠癌细胞HT29中过表达可能对促进其迁移和侵袭能力有着重要作用。
2.4 沉默PRR11抑制HT29细胞的迁移和侵袭
LV-PRR11慢病毒瞬时转染HT29细胞,筛选稳定的细胞系后,Western blot检测结果显示:LV-PRR11-RNAi组蛋白表达明显低于LV-PRR11-RNAi NC组,表明靶向PRR11的LV-PRR11-RNAi能在蛋白水平有效沉默PRR11(P < 0.05,图 4A);Transwell试验结果显示:LV-PRR11-RNAi组的细胞较LV-PRR11-RNAi NC组有更弱的迁移和侵袭能力(P < 0.05,图 4B);划痕试验结果显示:LV-PRR11-RNAi组的细胞迁移能力较LV-PRR11-RNAi NC组弱(图 4C)。结果表明:PRR11可能在结直肠癌细胞HT29迁移和侵袭过程中起重要作用。
2.5 过表达和沉默PRR11后HT29细胞EMT相关信号分子的表达
Western blot检测结果显示:PRR11过表达后,与LV-PRR11-RNAi NC组比较,LV-PRR11组的EMT相关转录因子β-catenin明显上调,上皮细胞标志分子E-cadherin下调,间质细胞标志分子Vimentin较LV-PRR11 NC组上调(P < 0.05,图 5A);反之,PRR11沉默后,与LV-PRR11-RNAi NC组比较,LV-PRR11-RNAi组β-catenin和Vimentin明显下调,E-cadherin明显上调(P < 0.05,图 5B)。
在RNA水平上,PRR11过表达后,β-catenin明显表达上调;PRR11沉默后,β-catenin明显表达下调(P < 0.05,图 6)。免疫荧光结果显示,PRR11过表达后,LV-PRR11组的结直肠癌细胞中β-catenin具有明显的核转位现象,其荧光强度明显强于LV-PRR11 NC组;PRR11沉默后,LV-PRR11-RNAi组的β-catenin无明显核转位现象,其荧光强度弱于LV-PRR11-RNAi NC组(图 7)。
3 讨论
CRC的发病率和死亡率虽然在世界范围内有显著不同,但根据世界卫生组织GLOBOCAN数据,在全球范围内,CRC仍然是男性第3大常见的恶性肿瘤,女性中的第2位癌症[10]。CRC的发病机制复杂,多数学者认为CRC是由于遗传异常积累的结果,癌症防御机制的失活和致癌途径的激活是导致肿瘤的重要原因,而肿瘤的复发和转移往往是导致CRC治疗失败和患者死亡的主要原因。既往研究已发现了几种基因是CRC转移的调节因子,如QI等[11]研究发现BOP1、CKS2和NFIL3作为Wnt信号通路的新靶点影响小鼠CRC的转移;miR-224被证明可以通过抑制CRC中的SMAD4来充当转移的启动子[12]。然而,CRC转移的具体机制仍有待进一步探索。
新型基因PRR11在癌症的发生、发展中起着重要的作用。然而,PRR11在癌症中的分子机制尚不清楚。研究证明:Wnt蛋白能与膜受体卷曲蛋白Fz和辅助受体低密度脂蛋白LRP5/6受体家族结合, 来启动Wnt/β-catenin通路。在食管癌中,PRR11高表达组显示出比低表达组更低的5年无病生存率,且PRR11可能通过破坏Wnt/β-catenin途径的负调节来激活Wnt/β-catenin信号通路,他们推测PRR11可能与破坏性复合物(APC,GSK-3β和AXIN2)相互作用激活Wnt/β-catenin途径[13]。在卵巢癌细胞中,PI3K/AKT/β-catenin信号通路有助于PRR11介导其增殖、迁移和侵袭[14]。在非小细胞肺癌(NSCLC)中,敲除DLX6-AS1和PRR11显著抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭以及诱导细胞凋亡,PRR11过表达逆转了这种作用[15]。有研究发现:PRR11在肝癌细胞系中的沉默可以显著降低β-catenin的表达,且明显抑制肝癌细胞增殖、集落形成以及细胞的迁移和侵袭,表明PRR11可能通过Wnt/β-catenin信号通路在肝癌的进展中起着致癌作用[16]。然而,PRR11在CRC中的表达及其与侵袭和转移之间的关系仍需探明。
本研究采用慢病毒转染的方法,过表达和沉默PRR11后监测细胞侵袭和转移能力的变化。结果显示:PRR11在结直肠癌组织和细胞中的表达较癌旁组织和正常结直肠上皮细胞高,且过表达PRR11后,结直肠癌细胞HT29的侵袭和迁移能力增强;相反,沉默PRR11后,HT29的侵袭和迁移能力减弱。EMT相关信号分子表达情况结果显示:PRR11过表达随着EMT相关转录因子β-catenin和间质细胞标志分子Vimentin的表达上调,上皮细胞标志分子E-cadherin的表达下调,伴随β-catenin明显的核转位;PRR11沉默促进EMT相关转录因子β-catenin和间质细胞标志分子Vimentin的表达下调,上皮细胞标志分子E-cadherin的表达上调,且β-catenin核转位不明显。我们推测:PRR11在结直肠癌中可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路来调控肿瘤的侵袭和转移能力,靶向Wnt/β-catenin信号通路可以为癌症患者的治疗提供一个新的临床治疗方法。
综上所述,PRR11在结直肠癌中的高表达,且在肿瘤的侵袭和迁移中有着重要作用,PRR11通过调节Wnt/β-catenin信号通路,促进β-catenin核转位来促进结直肠癌转移。然而,PRR11启动Wnt/β-catenin途径是通过与破坏性复合物结合还是作用于Wnt蛋白与受体的结合过程等具体分子机制,仍需要后续相关实验进一步探索。
[1] |
SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2018[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(1): 7-30. DOI:10.3322/caac.21442 |
[2] |
SIEGEL R, DESANTIS C, JEMAL A. Colorectal cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64(2): 104-117. DOI:10.3322/caac.21220 |
[3] |
明畅畅.富含脯氨酸蛋白11和Ki-67在直肠癌中的表达及临床意义[D].福州: 福建医科大学, 2017. MING C C. The expression and clinical significance of proline rich protein 11 and ki-67 in rectal cancer[D]. Fuzhou: Fujian Medical University, 2017. |
[4] |
李燕. PRR11和CTHRC1蛋白在结直肠癌组织中的表达情况及相关性研究[D].郑州: 郑州大学, 2019. LI Y. Expression and correlation of PRR11 and CTHRC1 in colorectal cancertissues[D]. Zhengzhou: Zhengzhou University, 2019. |
[5] |
HUANG Y J, NI R, WANG J, et al. Knockdown of lncRNA DLX6-AS1 inhibits cell proliferation, migration and invasion while promotes apoptosis by downregulating PRR11 expression and upregulating miR-144 in non-small cell lung cancer[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 109: 1851-1859. DOI:10.1016/j.biopha.2018.09.151 |
[6] |
SONG Z C, LIU W Y, XIAO Y, et al. PRR11 is a prognostic marker and potential oncogene in patients with gastric cancer[J]. PLoS ONE, 2015, 10(8): e0128943. DOI:10.1371/journal.pone.0128943 |
[7] |
CHEN Y, CHA Z S, FANG W Z, et al. The prognostic potential and oncogenic effects of PRR11 expression inhilar cholangiocarcinoma[J]. Oncotarget, 2015, 6(24): 20419-20433. DOI:10.18632/oncotarget.3983 |
[8] |
张莲.非小细胞肺癌细胞中沉默PRR11基因抑制细胞增殖并诱发自噬的分子机理[D].重庆: 重庆医科大学, 2018. ZHANG L. Silencing of PRR11 suppresses cell proliferation and induces autophagy in NSCLC cells[D]. Chongqing: Chongqing Medical University, 2018. |
[9] |
张莲, 张春冬, 卜友泉, 等. PRR11调节肺癌细胞系A549侵袭迁移的分子机制研究[J]. 重庆医科大学学报, 2018, 43(5): 662-666. ZHANG L, ZHANG C D, BU Y Q, et al. Silencing PRR11 inhibits the migration and invasion of lung cancer A549 cells[J]. J Chongqing Med Univ, 2018, 43(5): 662-666. DOI:10.13406/j.cnki.cyxb.001692 |
[10] |
BRENNER H, KLOOR M, POX C P. Colorectalcancer[J]. Lancet, 2014, 383(9927): 1490-1502. DOI:10.1016/s0140-6736(13)61649-9 |
[11] |
QI J J, YU Y, AKILLI ÖZTVRK Ö, et al. New Wnt/β-catenin target genes promote experimental metastasis and migration of colorectal cancer cells through different signals[J]. Gut, 2016, 65(10): 1690-1701. DOI:10.1136/gutjnl-2014-307900 |
[12] |
WANG Z Z, YANG J, DI J B, et al. Downregulated USP3 mRNA functions as a competitive endogenous RNA of SMAD4 by sponging miR-224 and promotes metastasis in colorectal cancer[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 4281. DOI:10.1038/s41598-017-04368-3 |
[13] |
ZHOU L, DENG Z Z, LI H Y, et al. Overexpression of PRR11 promotes tumorigenic capability and is associated with progression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. OncoTargets Ther, 2019, 12: 2677-2693. DOI:10.2147/OTT.S180255 |
[14] |
ZHU J, HU H, WANG J, et al. PRR11 overexpression facilitates ovarian carcinoma cell proliferation, migration, and invasion through activation of the PI3K/AKT/β-catenin pathway[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 49(2): 696-705. DOI:10.1159/000493034 |
[15] |
HUANG Y J, NI R, WANG J, et al. Knockdown of lncRNA DLX6-AS1 inhibits cell proliferation, migration and invasion while promotes apoptosis by downregulating PRR11 expression and upregulating miR-144 in non-small cell lung cancer[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 109: 1851-1859. DOI:10.1016/j.biopha.2018.09.151 |
[16] |
QIAO W, WANG H Y, ZHANG X Z, et al. Proline-rich protein 11 silencing inhibits hepatocellular carcinoma growth and epithelial-mesenchymal transition through β-catenin signaling[J]. Gene, 2019, 681: 7-14. DOI:10.1016/j.gene.2018.09.036 |