异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)虽然是目前治愈恶性血液病最重要的手段，但原发耐药、具有不良遗传学改变(如IKZF1突变、TP53、FLT3-ITD等)、移植前未能取得深度缓解等高危急性白血病移植后复发率高达40%~60%，复发后长期生存甚至不到10%[1-4]。得益于移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效应，供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion, DLI)被广泛用于各种恶性血液病移植后复发的治疗[5-6]。但由于GVL效应起效较缓慢，DLI对移植后血液学及骨髓复发的急性白血病作用有限。目前认为回输时的疾病状态及肿瘤负荷显著影响DLI反应率及生存率[5]。因此，对移植后高复发风险的急性白血病如何提早DLI干预时机是目前探索的热点。已有研究开始尝试对allo-SCT原发病持续缓解的高危急性白血病予预防性DLI，样本量较小，回输方案各异，且临床疗效差异较大[7-9]。目前研究均未能回答高危急性白血病allo-HSCT后早期行改良DLI是否能预防复发且带来生存获益。本研究尝试回顾性分析本中心近5年allo- HSCT后接受预防性改良DLI的62例高危急性白血病患者资料，对预防性DLI进行临床疗效及安全性分析。
1 资料与方法 1.1 病例资料收集2013年1月至2017年6月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心接受allo-HSCT的急性白血病患者共477例。具有较高复发风险的极高危白血病的特征包括：原发耐药、移植时疾病未缓解(not remission，NR)或第3次完全缓解(third complete remission，CR3)以上、移植时微小残留病(minimal residual disease，MRD)阳性、高危遗传学改变[如t(4;11)、IKZF1、TP53]、携带BCR-ABL或FLT3-ITD在移植后不能耐受靶向维持治疗。共62例高危急性白血病在allo-HSCT后接受了预防性改良DLI。其中男性31例，女性31例，中位年龄29.5(9~51)岁，发病至移植时间为246(145~2 426)d。具体临床特征见表 1。本研究经本院科研伦理审查委员会审批通过[2019科研快审第(1244)号]，患者均签署知情同意书，并随访至2019年1月1日，无失访。
| 基本临床特征 | 例数(%) |
| 原发病 | |
| 急性淋巴细胞白血病 | 38(61.3) |
| 急性髓细胞白血病 | 24(38.7) |
| 诱导治疗次数 | |
| ≤2 | 48(77.4) |
| ＞2 | 14(22.6) |
| 移植时疾病状态 | |
| CR1 | 34(54.8) |
| CR2 | 19(30.7) |
| CR3 | 2(3.2) |
| NR | 7(11.3) |
| 移植时MRD | |
| 阳性 | 34(54.8) |
| 阴性 | 28(45.2) |
1.2 移植流程
40例患者接受亲缘半相合外周血造血干细胞异基因移植，16例接受亲缘全相合外周血造血干细胞异基因移植，余6例接受非亲缘外周血造血干细胞异基因移植。所有供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)动员后分离外周血干细胞，留取部分造血干细胞在液氮中冻存备用。供者选择、移植预处理方案及移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)方案详见本中心既往报道[10]。33例患者在预防性DLI前曾出现不同程度急性移植物抗宿主病(aGVHD), 其中Ⅰ度27例，Ⅱ度6例，经抗GVHD治疗后，患者获得完全缓解。
1.3 DLI方案高危急性白血病移植后进行预防性DLI的条件：①原发病处于CR且MRD＜0.01%，且融合基因、基因突变均阴性；②供受者嵌合度≥98%；③既往无Ⅲ~Ⅳ度aGVHD发生；④目前无现症aGVHD或慢性移植物抗宿主病(cGVHD)；⑤无严重现症感染。供者淋巴细胞来自于移植时由G-CSF动员后采集冻存的外周血造血干细胞。输注后小剂量环孢素(cyclosporin，CSA)[1~2 mg/(kg·d)]口服预防GVHD，如果无明显排异发生，可在DLI后3~4周内逐渐撤停。
1.4 原发病及并发症监测所有患者回输后每周门诊随访血常规、肝肾功能、药物浓度、感染、aGVHD、cGVHD发生情况。每月进行骨髓细胞学、MRD及融合基因监测。
1.5 研究终点及统计学分析总体生存率(overall survival，OS)定义为从造血干细胞回输开始至各种原因引起死亡的时间。无白血病生存率(leukemia-free survival，LFS)为从造血干细胞回输开始至白血病复发或者死亡的时间。无排异无复发生存率(GVHD-free and relapse-free survival，GRFS)定义为从造血干细胞回输开始至Ⅲ~Ⅳ度aGVHD、中重度cGVHD、复发或者死亡的时间。
复发、GVHD、非复发死亡的累积发生率通过竞争风险模型分析[11]。OS、LFS及GRFS采用Kaplan-Meier方法计算。采用SPSS 20.0统计软件及R 3.4.0分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 患者DLI后情况62例高危急性白血病患者在allo-HSCT后，于中位时间105.5(59~355)d接受了预防性改良DLI，中位CD3细胞量为3.95(0.4~7.6)×107/kg。
2.2 预防性DLI后GVHD发生情况预防性DLI后，分别有10例、8例、3例、4例患者发生Ⅰ度、Ⅱ度、Ⅲ度、Ⅳ度aGVHD，中位发生时间为DLI后40(7~92) d。Ⅱ~Ⅳ度及Ⅲ~Ⅳ度aGVHD的100 d累积发生率分别为22.6% (95%CI：22.1%~23.1%)及11.3%(95%CI: 11.0%~11.6%)。Ⅱ度以上aGVHD加用糖皮质激素2 mg/(kg·d)治疗，激素耐药者加用益赛普、卢克替尼等二线抗GVHD药物治疗，患者aGVHD均得到有效控制。
31例患者在DLI后出现cGVHD，其中轻度11例，中度9例，重度11例，中位发生时间在DLI后93.5(25~739) d。中重度cGVHD的3年累积发生率为32.9%(95%CI：32.2%~33.6%)。其中1例患者接受DLI后出现消化道Ⅳ度aGVHD，经益赛普、舒莱、间充质干细胞输注后排异控制，+103 d出现肺部排异，并进展为闭塞性细支气管炎，移植后19.64个月因GVHD合并严重肺部感染死亡。
2.3 改良预防性DLI后复发及生存情况随访截止至2019年1月1日。移植后中位随访33.2(3.4~64.7)个月。共17例患者复发，中位复发时间为移植后9.6(2.9~51.6)个月。复发患者接受了包括化疗、治疗性DLI、放疗等治疗，仅3例患者取得再次缓解。3年总体累积复发率为29.7%(95%CI：29.0%~30.4%)(图 1A)。
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| A：累积复发率(RI)；B：总体生存率(OS)；C：无白血病生存率(LFS)；D：无复发无排异生存率(GRFS) 图 1 62例患者累积复发率、总体生存率、无白血病生存率及无复发无排异生存率情况 |
至随访终点，41例患者疾病处于长期缓解状态，共21例患者死亡，其中15例患者死于原发病，2例死于严重感染，4例死于严重GVHD。3年的OS、LFS、GRFS分别为69.6 % (95%CI：57.9 %~81.3%)、63.6%(95%CI：51.5%~75.7%)和31.7%(95%CI：19.6%~43.8%)(图 1B~D)。3年无复发死亡率为6.7%(95%CI：6.5%~6.9%)。
3 讨论疾病复发仍然是急性白血病allo-HSCT后最大的难题，尤其是复发难治、携带不良遗传学改变等高危患者移植后复发率及生存令人失望。DLI作为一种过继性细胞免疫治疗，通过其GVL效应进一步清除宿主体内的残留白血病细胞，是防治移植后复发的有效手段之一。DLI后GVHD及治疗相关的死亡，不同程度地限制了其在临床上的广泛应用。一方面，许多研究致力于改进DLI方案，减少相关死亡的发生而保留其GVL效应。另一方面，相对于复发后予以治疗性DLI，抢先性DLI或预防性DLI被逐渐应用于临床。由于缺乏大样本前瞻性随机研究及不同中心DLI方案的异质性，移植后预防性DLI的干预时机、适用人群、最佳方案及其临床疗效仍不明确。
传统DLI直接输注未动员的供者外周血淋巴细胞，输注后aGVHD发生率可达49%~91%，20%~40%患者会出现血细胞减少，且感染风险增加。近年，研究者通过输注由G-CSF动员的外周血细胞改良了传统DLI，在保留淋巴细胞免疫活性的同时降低了治疗相关死亡率，大大改善了DLI的临床疗效。许多研究也证实由G-CSF动员的改良DLI可显著降低GVHD发生率，而不影响其抗白血病作用[12-13]，相关机制可能与G-CSF将T细胞从Th1极化为Th2、促进调节性T细胞和耐受性树突细胞的分化、增加T细胞种类等有关。另外DLI相关GVHD与回输后是否预防性抗GVHD、免疫抑制剂剂量及疗程直接相关。北大人民医院报道：在DLI后采用CSA[起始剂量为2.5 mg/(kg·d)，目标血药浓度≥100 ng/mL]或者甲氨蝶呤(methotrexate，MTX，10 mg，DLI后2~4周内每周1次)抗GVHD治疗，总疗程为输注后2~6周。此方案下，Ⅲ~Ⅳ度aGVHD及cGVHD的发生率分别为13.2%~28.4%及45.4%~ 48.1%，累积复发率及OS分别为35.7%~51.3%、30.5~50.2%[14-15]；该中心的进一步探索显示：预防GVHD治疗超过2周组DLI相关aGVHD显著低于抗GVHD治疗不足2周组(6/10 vs 2/29, P=0.001)，而两组cGVHD发生率、累积复发率、OS差异均无统计学意义[12]。本中心预防性DLI后CSA剂量低于北大人民医院方案，Ⅲ~Ⅳ度aGVHD、中重度cGVHD无明显增加，且3年累积复发率低于30%，说明较小剂量的CSA足以预防DLI后GVHD发生，而不影响GVL效应。除上述淋巴细胞来源及输注后抗GVHD方案外，移植供者来源、回输距离移植时间、DLI次数及淋巴细胞中CD3+细胞量均影响DLI相关GVHD发生率及治疗相关死亡率。因此，仍需要大量研究探索预防性DLI最佳方案。
虽然目前预防性DLI的临床疗效缺乏前瞻性随机试验证实，小样本研究已尝试异基因移植后早期DLI预防高危急性白血病复发。一项回顾性研究报道：31例高危恶性血液病在半相合造血干细胞移植后接受预防性DLI, 2年OS、GRFS及复发率分别为40.1%、31.9%及52.0%[9]。CAUCHOIS等[16]对36例高危恶性血液病在半相合移植后进行了预防性DLI, 1年无进展生存及OS高达76%及83%，累积复发率仅16%，鉴于中位随访时间仅10个月，此结果需要谨慎对待。欧洲血液和骨髓移植(EBMT)的急性白血病工作组将allo-SCT后接受预防性DLI的105例急性白血病患者与13 827例对照组患者进行病例匹配，分析DLI是否能带来获益，结果显示：AML和标危AML中预防性DLI组与对照组复发及生存指标无明显差异，而27例高危AML明显可从预防性DLI中获益(5年OS：69.8% vs 40.2%, P=0.027；5年复发率：30.5% vs 46.0%, P=0.200；5年非复发死亡率：7.4% vs 18.6%, P=0.022)，而治疗相关死亡率无增加[13]。但此研究缺乏患者初发病时分子遗传学情况、移植后供受者嵌合度、MRD监测情况等重要信息，一定程度影响两组病例的匹配性及结果的可信度。本研究是目前纳入样本量较大的预防性DLI研究之一，62例患者在中位时间为33.2个月的随访后，得出与以上EBMT相似结果：3年OS及LFS分别为69.6%及63.6%，3年累积复发率为29.7%。既往研究报道的高危白血病异基因移植后复发率在40%~60%，长期无病生存不到30%[1-2, 4, 17]。与以上研究及历史数据相比，本中心方案的预防性改良DLI可以降低高危急性白血病移植后复发，改善患者生存。
综上所述，高危急性白血病患者接受allo-HSCT后，予以预防性输注由G-CSF动员的冻存外周血淋巴细胞并联合小剂量CSA抗GVHD治疗，可降低复发率，提高OS及LFS，而GVHD发生率及治疗相关死亡在可接受范围之内。
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