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类鼻疽杆菌通过抑制自噬调控HepG2细胞胞内脂质代谢
唐梦灵1,2, 胡治强2, 袁思琪1,2, 饶承龙2, 张雨2, 谢建平1, 李倩2, 毛旭虎2     
1. 400715 重庆,西南大学生命科学学院,三峡地区生态环境与生物资源国家重点实验室培育基地,现代生物制药研究所;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物及免疫学教研室
[摘要] 目的 探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后诱导的自噬抑制对胞内脂质代谢的调控作用。方法 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h为感染组,以未感染组作为对照。激光共聚焦显微镜观测各组细胞内脂滴和GFP-自噬点的数量;定量试剂盒检测各组细胞内甘油三酯及胆固醇水平;Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62表达水平。利用自噬抑制剂3-MA、Baf-A1以及自噬激活剂Rapa处理细胞,检测改变宿主细胞自噬水平后,对类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后胞内脂质代谢的影响;外源加入游离脂肪酸三醋酸甘油酯,通过细菌胞内计数实验检测类鼻疽杆菌胞内存活情况。结果 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h后,与未感染组比较,胞内脂滴数量增多,脂质成分甘油三酯和胆固醇水平也随感染时间延长逐渐升高,且在感染24 h后达到最高水平(P < 0.01);自噬检测发现,与未感染组比较,LC3Ⅱ蛋白表达随感染时间逐渐下降,p62蛋白表达水平随感染时间逐渐蓄积,胞内自噬小体的数量也随感染时间逐渐减少,且感染24 h后数量最低(P < 0.01),提示类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后自噬受抑;使用自噬抑制剂3-MA、Baf-A1以及自噬激活剂Rapa处理细胞后,与对照组比较,抑制自噬导致胞内脂质蓄积加重(P < 0.01),而激活自噬可以减轻胞内脂质的蓄积(P < 0.01);此外,外源补充三醋酸甘油酯促进宿主细胞脂质代谢速率能明显降低类鼻疽杆菌胞内存活量(P < 0.01)。结论 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,通过诱导自噬抑制调控HepG2细胞胞内脂质代谢。
[关键词] 类鼻疽杆菌     HepG2细胞     自噬     脂代谢    
Burkholderia pseudomallei regulates lipid metabolism in HepG2 cells by inducing autophagy suppression
TANG Mengling1,2, HU Zhiqiang2, YUAN Siqi1,2, RAO Chenglong2, ZHANG Yu2, XIE Jianping1, LI Qian2, MAO Xuhu2     
1. Institute of Modern Biopharmaceuticals, State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environment and Bio-Resource of the Three Gorges Area, Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region of Ministry of Education, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing, 400715;
2. Department of Clinical Microbiology and Immunology, Faculty of Pharmacy and Medical Laboratory, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
[Abstract] Objective To investigate the regulatory effect of Burkholderia pseudomallei (B. pseudomallei)-induced autophagy suppression on lipid metabolism in HepG2 cells. Methods HepG2 cells infected by B. pseudomallei were observed for changes in intracellular lipid droplets and GFP-autophagy spots using confocal laser microscopy at 6, 12, 24 h following the infection. The levels of triglyceride and cholesterol in the cells were determined using a quantitative detection kit, and the expression levels of autophagy-related proteins LC3Ⅱ and p62 were detected with Western blotting. The effects of pretreatment with the autophagy inhibitors 3-MA and Baf-A1 or the autophagy activator Rapa prior to B. pseudomallei infection were examined on lipid metabolism in HepG2 cells. The changes in the intracellular survival of B. pseudomallei in response to exogenous free fatty acid triacsin C were examined by counting the viable bacteria in the cells. Results B. pseudomallei infection resulted in significantly increased number of intracellular lipid droplets at 6, 12 and 24 h after the infection and progressively increased levels of triglyceride and cholesterol in HepG2 cells over time, which reached the highest level at 24 h after the infection (P < 0.01). The cells infected by B. pseudomallei showed progressively lowered expression of LC3Ⅱ protein and increased expression of p62 protein over time with gradually decreased number of autophagosomes, which reached the lowest level at 24 h after the infection (P < 0.01), suggesting suppressed autophagy in HepG2 cells after B. pseudomallei infection. Inhibition of autophagy by pretreatment of the cells with 3-MA and Baf-A1 caused significantly increased intracellular lipid accumulation (P < 0.01), whereas activation of autophagy by Rapa obviously reduced the accumulation of intracellular lipids (P < 0.01). The addition of exogenous triacsin C significantly reduced the intracellular survival of B. pseudomallei (P < 0.01). Conclusion B. pseudomallei infection regulates intracellular lipid metabolism in HepG2 cells by inducting autophagy inhibition.
[Key words] Burkholderia pseudomallei     HepG2 cells     autophagy     lipid metabolism    

类鼻疽是由类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)引起的一种新型传染病,广泛流行于东南亚和澳洲北部,我国海南、广东、香港等也是主要的疫源地[1]。类鼻疽临床表现多样,主要引起肺、肝、脾、脑、皮下等多脏器脓肿,死亡率高达40%[2]。类鼻疽杆菌耐药性强、易变异且无有效疫苗。因此,深入研究类鼻疽杆菌感染致病机理为将来寻找类鼻疽杆菌新的有效的防治策略提供重要理论依据[3]

众所周知,脂质代谢参与细胞许多重要的生命活动,为各种细胞器形成、扩展以及蛋白质降解等提供所需要的能量[4-5]。其中脂滴(lipid droplets,LDs)是细胞内存贮中性脂肪的亚细胞器,存在于大多数真核细胞中,LDs内的脂质是细胞主要的能源物质[6]。研究显示,宿主脂质代谢与多种病原微生物的感染致病密切相关,在结核杆菌休眠期间宿主细胞释放的脂肪酸和甾醇是其唯一的碳源,而在肝炎病毒装备和复制进程中宿主细胞的脂质也是其必不可少的能量来源[7-8]。越来越多的研究发现自噬(autophagy)作为一种大分子物质降解机制,在调节脂质代谢方面发挥重要作用[9-10]。作为一种胞内菌,类鼻疽杆菌可以侵入多种细胞,而肝脏是该菌感染后最常受累及的靶器官之一[11-12]。因此,本研究以人肝癌HepG2细胞为模型,以本室鉴定的国内标准菌株BPC006感染HepG2细胞后,检测宿主细胞脂质代谢和自噬水平的变化以及脂质代谢对类鼻疽杆菌胞内存活的影响,初步探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,自噬在HepG2细胞脂质代谢中的调控作用,为进一步研究类鼻疽杆菌持续性感染和致病机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 质粒、菌株及细胞系

GFP-LC3质粒由日本大阪大学细胞生物系Tamotsu Yoshimori教授惠赠;BPC006菌株分离自海南省三亚市人民医院,并由本实验室保存[13];人肝癌HepG2细胞购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;甘油三酯定量检测试剂盒、胆固醇定量检测试剂盒、尼罗红(Nile red)、DAPI、chloroquine(CQ)、3-methyladenine(3-MA)、Bafilomycin A1(Baf-A1)、rapamycin(Rapa)、DMSO、PBS、Triton-X100、三醋酸甘油酯(triacsin C)购自美国Sigma公司;BCA试剂盒、WB试剂盒、辣根酶标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG购自碧云天生物技术研究所;封闭蛋白干粉、4%多聚甲醛购自武汉博士德公司;兔抗MAP1LC3B、p62、β-actin单克隆抗体购自美国CST公司;LipofectamineTM 3000购自美国Invitrogen公司。

1.3 细胞培养及类鼻疽杆菌感染

HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于37 ℃、饱和湿度5% CO2培养箱中培养,待细胞生长至80%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞以5×105/mL接种于6孔板培养皿中,贴壁培养24 h。挑取单克隆阳性BPC006菌落于5 mL LB培养基中,200 r/min振荡培养12 h,按感染复数10 :1加入类鼻疽杆菌悬液,感染时间分别为0(未感染组)、6、12、24 h。其中根据实验设计分组,在感染之前分别用3-MA、Baf-A1、Rapa、CQ、triacsin C提前预处理细胞1 h,药物终浓度分别为10 mmol/mL、10 nmol/mL、200 nmol/mL、10 μmol/mL、100 nmol/mL。

1.4 Western blot检测

收集不同实验组样品,提取蛋白,测定蛋白浓度。取20 μL蛋白样品进行SDS-PAGE,80 V恒压模式电泳180 min,250 mA电转70 min,5%脱脂奶粉封闭2 h,与一抗4 ℃孵育过夜。TBST清洗3遍,再与相应二抗室温孵育2 h,TBST清洗3遍,化学发光底物室温作用1 min,化学发光分子成像仪曝光。每组实验重复3次。

1.5 激光共聚焦观察

将HepG2细胞转染GFP-MAP1LC3B质粒24 h,然后感染类鼻疽杆菌,共孵育至相应时间点。收集细胞并用PBS洗涤3次,以4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗涤3次后用0.1%的Triton-X 100透膜10 min。根据实验设计分别进行以下处理:①用类鼻疽杆菌兔抗血清室温孵育细胞1 h,PBS洗涤后与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG共孵育1 h。②以0.1 μg/mL浓度的尼罗红染料室温孵育细胞10 min。最后均用PBS洗涤3次,DAPI染细胞核10 min,PBS洗涤后用抗荧光淬灭封片剂进行封片。实验重复3次,图像由激光共聚焦显微镜(Laica-SP8)采集。

1.6 定量试剂盒检测细胞内甘油三酯及胆固醇水平

待细胞生长约80%时,以0.25%胰酶消化收集细胞并用PBS洗涤3次,按照定量试剂盒说明书检测细胞内甘油三酯及胆固醇水平。每组至少测定3次。

1.7 细菌胞内增殖实验

待细胞生长至80%左右,感染类鼻疽杆菌,分别收取培养6、12、24 h后的细胞,去培养基上清,用无菌PBS清洗细胞3次,每孔加入1 mL的0.1% Triton-X 100裂解细胞。然后按10倍的梯度倍比稀释溶液后,取50 μL稀释裂解液涂布于LB平板上,37 ℃孵箱恒温培养36 h,进行菌落计数。

1.8 统计学分析

使用Image J 1.4对每组各100个细胞进行图像分析,计算每个细胞中脂滴和自噬小体的数量,数据以x±s表示。使用SPSS 17.0统计软件,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检测水准:α=0.05。

2 结果 2.1 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后导致宿主细胞脂质蓄积

类鼻疽杆菌感染人肝癌HepG2细胞(MOI=10 :1) 6、12、24 h后,通过激光共聚焦显微镜观察胞内脂滴数量(图 1)。对每组各100个细胞进行图像分析,计数每个细胞中脂滴数量,与未感染组比较,随着感染时间的延长,感染组胞内脂滴数量明显增加,且在感染24 h后数量最多,差异有统计学意义(P < 0.01,图 2A)。

图 1 激光共聚焦显微镜观察类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后胞内细菌(A)及脂滴(B)形态

A:Image J定量分析细胞脂滴数量;B:胞内胆固醇含量;C:胞内甘油三酯含量;a:P < 0.01,与0 h(未感染组)比较 图 2 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞不同时间点后脂质代谢的变化

利用ELISA试剂盒检测类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后蓄积的脂滴中甘油三酯和胆固醇含量的变化,结果显示随着感染时间的延长,胆固醇和甘油三酯含量均明显增加(图 2BC)。提示类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后导致宿主细胞脂质蓄积。

2.2 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后宿主细胞自噬受抑

Western blot检测结果显示,与未感染组比较,类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达随感染时间延长逐渐减少,而p62蛋白的表达逐渐蓄积(图 3A)。此外,使用自噬流阻断剂氯喹(CQ)阻断自噬流后,与未感染组比较,LC3Ⅱ的表达明显减少(图 3B)。同时,采用激光共聚焦观察宿主细胞GFP-自噬点数量可知,类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h后,胞内GFP-自噬点数量逐渐减少,且在感染24 h后降到最低,与未感染组比较,差异有统计学意义(P < 0.01,图 3CD)。以上结果提示类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后宿主细胞自噬受抑。

A:类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平;1:未感染组; 2~4:分别为感染6、12、24 h组;B:Western blot检测CQ处理后HepG2细胞LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平1:PBS;2:PBS+Bp;3:CQ;4:CQ+Bp;C:共聚焦观察类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后胞内GFP-自噬体形态;D:Image J定量分析每个细胞GFP-自噬点数量  a:P < 0.01,与0 h(未感染组)比较 图 3 类鼻疽杆菌感染HepG2细胞不同时间点后自噬水平的变化

2.3 激活自噬促进宿主细胞脂质代谢

为探索自噬调节类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后引起的脂质代谢紊乱的机制,采用自噬抑制剂3-MA、Baf-A1以及自噬激活剂Rapa预处理细胞1 h,Western blot检测类鼻疽杆菌感染HepG2细胞12 h后细胞胞内自噬水平的变化,激光共聚焦和ELISA试剂盒检测宿主细胞脂质代谢的改变。Western blot检测结果显示,与对照组(DMSO)比较,3-MA和Baf-A1处理组宿主细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少,p62蛋白表达增加;而Rapa处理组LC3Ⅱ表达增加,p62蛋白表达明显减少(图 4B)。提示类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,使用3-MA和Baf-A1处理宿主细胞可导致胞内自噬水平进一步受抑,而Rapa处理可明显增强宿主细胞自噬。

1: DMSO; 2: 3-MA; 3: Baf-A1; 4: Rapa; A:共聚焦观察类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后胞内脂滴形态;B:Western blot检测类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后LCⅡ、p62蛋白表达水平;C:Image J定量分析每个细胞脂滴数量;D:胞内甘油三酯含量;E:胞内胆固醇含量;a:P < 0.01,与对照组(DMSO)比较 图 4 激活自噬宿主细胞脂质代谢的变化

激光共聚焦结果显示,与对照组(DMSO)比较,3-MA和Baf-A1处理组宿主细胞脂滴数量明显增加(P < 0.01),而Rapa处理组脂滴数量明显减少(P < 0.01,图 4AC)。3-MA和Baf-A1处理组甘油三酯和胆固醇含量进一步增加(P < 0.01);而Rapa处理组甘油三酯和胆固醇含量显著降低(P < 0.01,图 4DE)。表明类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,抑制自噬可导致宿主细胞脂质代谢进一步受阻,而激活自噬可以明显促进宿主细胞脂质代谢。

2.4 激活宿主脂质代谢有利于类鼻疽杆菌的清除

为探究脂质代谢在类鼻疽杆菌胞内生存中的作用,外源补充三醋酸甘油酯促进胞内脂质代谢速率,观察类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h后胞内细菌载量。结果显示,与对照组(PBS)比较,外源补充三醋酸甘油酯可以显著降低类鼻疽杆菌胞内载量(P < 0.01,图 5)。表明激活宿主细胞脂质代谢速率可以增强宿主细胞对类鼻疽杆菌的胞内清除能力。

a:P < 0.01,与PBS组比较 图 5 脂质代谢对类鼻疽杆菌胞内存活的影响

3 讨论

作为一种胞内寄生、严重危害公共卫生安全的细菌,类鼻疽杆菌逃逸宿主免疫清除为其持续性感染提供了先决条件,也是其致病和治疗的关键。类鼻疽杆菌能够快速地侵入多种细胞,并使受感染的宿主细胞之间发生融合,形成多核巨细胞,而这些受感染的细胞则充当细菌寄居场所和营养能量的提供者[14]。正因如此,类鼻疽杆菌的临床治疗十分困难,深入研究类鼻疽杆菌的致病机制,对控制类鼻疽杆菌的发病和传播至关重要。

脂滴存在于所有细胞类型中,虽然在不同生物体和细胞类型之间存在功能、外观和组成上的差异,但所有的脂滴都因为一种独特的结构被识别,即中性脂质[6]。早期认为这些细胞器主要与脂质储存有关,现在研究发现这些富含脂质的细胞器参与了细胞多种功能,如细胞信号转导和物质运输等。脂滴中储存的脂质作为细胞能量来源的主要物质,因为与人类疾病如肥胖、炎症性疾病和癌症有密切联系而备受关注[15-16]。在不同类型细胞内,感染不同的病原体,如细菌、寄生虫和病毒等,都会诱导一定程度的脂质蓄积,而抑制宿主细胞脂质的代谢也能改变病原菌的生存能力。研究表明在HepG2细胞内使用三磷酸肌醇抑制长链酰辅酶A合成酶的活性,能够防止脂质的生物合成并明显减弱沙眼衣原体的生长速率;而在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中使用脂肪酸合成酶抑制剂C75预处理细胞后,不仅能够抑制结核分枝杆菌诱导的脂质形成,而且能够抑制细胞中细菌的活性[17-18]。除了能量来源,宿主脂质代谢还可向病原菌输送其他营养物质以供其生长,如铁等。在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞内伴随着脂质的积累会产生大量的脂性铁载体,从而促进铁运输到含结核分枝杆菌的吞噬体内,为病原菌的生长提供铁来源[19]。此外,宿主脂质代谢在病原菌感染与免疫进程中也具有重要影响。在感染过程中由于脂质的形成以及脂质内信号的区域化和类花生酸等物质的生成,宿主细胞产生炎症介质的能力增强,也有助于宿主对病原体的清除。例如,在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中脂质的产生可激活宿主细胞肌动蛋白的组装、吞噬体和溶酶体的融合以及吞噬体的成熟;从而导致吞噬体滞留酶等物质的产生并介导细菌的死亡[20]。而在类鼻疽杆菌的感染进程中,脂质代谢有何作用仍未阐明。因此,本研究建立类鼻疽杆菌感染人肝癌HepG2细胞模型,探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,宿主细胞脂质代谢的变化。结果发现类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后会导致宿主细胞脂质明显蓄积,而外源加入游离脂肪酸激活宿主细胞脂质代谢的速率,能够显著减弱类鼻疽杆菌的胞内存活率。这提示类鼻疽杆菌感染宿主细胞以后,导致脂质的大量蓄积,可能是类鼻疽杆菌获取能量并逃避宿主免疫清除的一种策略。正如结核分枝杆菌感染引起的泡沫状巨噬细胞一样,这种含脂、含细菌的空泡是由于脂质持续产生和补充而形成的,并为细菌休眠活化提供契机[21]

自噬作为一种大分子物质降解机制,可以吞噬细胞器和蛋白质等多种细胞成分。近年来研究发现,脂质也是自噬的降解底物之一[22]。细胞内的脂质能够通过自噬体转运至溶酶体进行分解,并且自噬活性异常可能引起脂肪肝、2型糖尿病等代谢综合征疾病[9, 23]。脂质作为潜在的营养物质通过自噬体介导进行的降解对于病原微生物的生存也意义重大。研究表明脂质-自噬体的相互作用有利于病原菌的感染与复制,在克鲁兹锥虫(Trypanosoma cruzi)感染过程中,脂质-自噬体的相互作用可导致脂质内化进入含有寄生虫的自噬体中[24]。在沙眼衣原体感染实验中发现自噬介导了在Hep2或HeLa细胞内含细菌空泡(称为“包涵体”)表面停留的脂质穿过包涵体膜,与衣原体的复制形式网状体密切相连[25]。为了探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后导致宿主细胞脂质蓄积的机制,本研究检测类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,宿主细胞自噬水平的变化以及自噬对脂质代谢的调节作用,表明类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后是通过自噬受抑导致宿主细胞脂质的蓄积。而关于自噬是如何影响类鼻疽杆菌感染后宿主细胞脂质代谢的具体机制尚未被认识和研究,深入研究三者之间的关系可为类鼻疽杆菌的防控提供靶标。

综上所述,类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后导致宿主细胞脂质代谢的抑制,其机制可能是通过诱导HepG2细胞自噬受抑而引起细胞脂质代谢的紊乱,但具体机制还有待进一步阐明。本研究为类鼻疽杆菌感染后细胞自噬对脂质代谢的调控机制提供了新的思路,也为类鼻疽杆菌持续性感染致病机制和治疗提供了一定的理论依据。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201906061
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

唐梦灵, 胡治强, 袁思琪, 饶承龙, 张雨, 谢建平, 李倩, 毛旭虎.
TANG Mengling, HU Zhiqiang, YUAN Siqi, RAO Chenglong, ZHANG Yu, XIE Jianping, LI Qian, MAO Xuhu.
类鼻疽杆菌通过抑制自噬调控HepG2细胞胞内脂质代谢
Burkholderia pseudomallei regulates lipid metabolism in HepG2 cells by inducing autophagy suppression
第三军医大学学报, 2019, 41(18): 1722-1729
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(18): 1722-1729
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201906061

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收稿: 2019-06-11
修回: 2019-08-01

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