2. 550004 贵阳,贵州医科大学:中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室;
3. 550004 贵阳,贵州医科大学:免疫学教研室;
4. 550004 贵阳,贵州医科大学:附属医院呼吸内科;
5. 550004 贵阳,贵州医科大学:附属医院儿童血液肿瘤科
2. Key Laboratory of Adult Stem Cell Translational Research, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China;
3. Department of Immunology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China;
4. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China;
5. Department of Hematology and Oncology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China
肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是一种以肺动脉血管重构、阻力进行性增加和右心衰竭为特征的恶性肺血管性疾病。在PH患者及实验动物模型的肺组织,靠近重构的肺动脉处,均可以见到炎症的浸润,甚至可见由T淋巴细胞、B淋巴细胞和少量树突状细胞造成的三级淋巴滤泡的形成[1-2],靠近肺动脉处,均可见钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)、T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)的活化[3-4]。尽管目前尚不清楚局部的炎症反应是否为肺动脉血管重构的使动因素,抑或仅仅是在血管重构的进程中参与其中。然而至少已经明确,在PH的进程中,血管外周炎症性细胞的沉积对于肺动脉血管重构的形成至关重要[5]。恢复血管的正常结构和功能是治疗PH的关键。当前的治疗无助于解决免疫炎症调节和平滑肌细胞的增殖调控,因此,组织的免疫炎症反应及肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的过度增殖有可能成为该疾病的重要治疗靶点。
人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hu-MSCs),具有较好的免疫调节作用。MSC可以通过分泌与免疫调节相关可溶性因子转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),显著抑制Th1相关炎症性细胞因子的分泌,如TNF-α和IFN-γ[6-7]。有研究表明TNF-α可以明显促进血管平滑肌细胞的增殖[8-9],本课题组前期研究发现:在大鼠肺动脉高压疾病模型,hu-MSCs可以明显改善疾病模型各项指标,同时发现也存在炎症因子TNF-α有促进PH模型PASMCs增殖的作用,且这种作用可以被hu-MSCs有效抑制[10]。但是hu-MSCs是通过什么机制来抑制TNF-α介导的PASMCs增殖?仍有待探讨。本研究拟在体外建立共培养体系,活化T淋巴细胞,使其释放含有TNF-α的炎症因子,模拟肺动脉血管周围的炎症环境,探讨MSC抑制炎症因子TNF-α介导的PASMCs增殖过程中可能的机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 Hu-MSCs、PASMCs复苏与传代Hu-MSCs、PASMCs细胞由本实验室分离、鉴定并保存[11]。实验时取出冻存细胞,快速融化,加入5倍以上体积的DMEM/F12完全培养基混匀并离心去上清,重悬细胞,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养;细胞铺至培养瓶底面积80%~90%时,以0.25%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化,PBS洗涤并离心后加入DMEM/F12完全培养基,1 :3传代培养。本实验中Hu-MSCs、PASMCs均为第4代细胞。
1.1.2 大鼠脾脏T淋巴细胞分离SPF级雌性SD大鼠购自贵州医科大学实验动物中心(体质量100 g),颈椎脱臼处死,分离脾脏,PBS反复冲洗5次,放入洁净的培养皿,注射器针头反复点刺脾脏,冲洗并离心收集细胞;裂解红细胞后调整密度为5.0×108/mL;过2遍尼龙毛柱,收集滤出的细胞悬液,离心后的细胞即为大鼠脾脏T淋巴细胞,调整其密度为1.0×106/mL,备用。
1.2 主要实验试剂包括:DMEM/F12培养基(美国GIBICO公司)、TRIzol(美国Invitrogen公司)、英夫利西单抗(美国强生公司)、TNF-α(美国Prospect Biosystems公司)、TNF-α ELISA试剂盒(美国eBiscience公司)、EZNA总RNA提取试剂盒(美国Omega公司)、实时定量PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)、NFATc2单克隆抗体(美国BD公司)、DAPI(美国Thermo fisher公司)、钙调神经磷酸酶(CaN)测试盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 方法 1.3.1 PASMCs、MSC及T淋巴细胞组成的体外共培养体系及分组共分为5组,每组设3个复孔。取第4代PASMCs,DMEM/F12重悬细胞,加入24孔板中(1.0×104/孔)即为PASMCs组;加入700 μL的T淋巴细胞悬液(1.0×105/孔),含10 μg/mL的刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)即为活化TC刺激组;MSC干预组:在PASMCs+T淋巴细胞组基础上,加入300 μL的MSC细胞悬液接种到孔径为3 μm的插入式培养皿,将培养皿插入24孔板的板孔中培养(1.0×104/孔);英夫利西干预组:在PASMCs+T淋巴细胞组基础上,加入终浓度为1 μg/mL的英夫利西单抗(TNF-α单克隆抗体);TNF-α刺激组:在MSC干预组基础上加入终浓度为10 ng/mL的重组大鼠TNF-α。
1.3.2 TNF-α检测培养3 d后,收集T淋巴细胞刺激组、MSC干预组、英夫利西单抗干预组上清,ELISA法检测每个样本的TNF-α浓度。实验独立进行3次。
1.3.3 PASMCs的增殖检测采用MTS法对共培养体系中各组PASMCs的增殖进行检测。弃各孔上清,PASMCs冲洗3遍。加入300 μL/孔的DMEM/F12、15 μL/孔的MTS,继续培养4 h;收集细胞,1 000 r/min离心5 min,加样至96孔板中,酶标仪检测490 nm处的光密度值D(490)。实验独立进行3次。
1.3.4 PASMCs细胞内钙离子浓度检测培养3 d后去上清,消化细胞,Hanks液重悬细胞并调整密度为1.0×106/mL,接种至96孔板中(0.1 mL/孔),加入终浓度为3 μmol/L的Fura-2/AM,震荡孵育40 min;收集细胞,Hanks液重悬细胞并调整密度为5.0×104/孔,加入96孔板中,用荧光分光光度计检测荧光比值(R值);每孔加入0.1%终浓度的TritonX-100,震荡孵育5 min使Ca2+完全饱和,检测荧光比值(Rmax值);每孔加入5 mmol/L终浓度的乙二醇四乙酸酯(EGTA),内震荡孵育5 min使Ca2+完全游离,检测其荧光比值(Rmin值);利用公式计算细胞内Ca2+浓度:[Ca2+]i=Kd × [(R-Rmin)/(Rmax-R)] × FD/FS。其中Kd为Ca2+解离常数224 nmol/L,FD为Ca2+完全游离状态下于380 nm激发波长处的荧光强度,FS为Ca2+完全饱和状态下于380 nm激发波长处的荧光强度。
1.3.5 实时定量PCR检测提取各组PASMCs细胞内总RNA,鉴定并定量;体外将各组PASMCs细胞mRNA逆转录为cDNA,设计并合成RT-qPCR引物,引物序列见表 1。采用SYBRⒸGreen荧光染料法,用20 μL体系进行扩增,扩增条件为:50 ℃持续2 min,95 ℃持续2 min,40个循环:95 ℃,15 s,60 ℃,30 s扩增反应结束后,进行融解曲线分析来检测产物的特异性,以GAPDH作为内参对各个基因的表达量进行定量分析。
基因 | 引物序列 | 片段长度/bp |
GAPDH | 上游:5′-CCATTCTTCCACCTTTGATGCT-3′ | 98 |
下游:5′-TGTTGCTGTAGCCATATTCATTGT-3′ | ||
CaN | 上游:5′-CAGAGGGTGCTTCGATTCTC-3′ | 156 |
下游:5′-CCCCTAAGAAGAGGTAGCGA-3′ | ||
NFATc2 | 上游:5′-CAGCAGATTTGGGAGATGGAAG-3′ | 180 |
下游:5′-GACTGGGTGGTAAGTAAAGTGC-3′ |
1.3.6 PASMCs的CaN活性检测
培养3 d后去上清,PBS冲洗2遍后,每孔加入300 μL细胞裂解液,10 000 r/min离心20 min,收集上清备用;PASMCs的总蛋白含量进行检测,酶标仪检测562 nm条件下的D(562)值,并利用公式计算总蛋白浓度,总蛋白浓度(μg/mL)=[(测定D值-空白D值)/(标准D值-空白D值)] ×标准品浓度(563 μg/mL)×样品稀释倍数。采用CaN测试盒对PASMCs的CaN活性进行检测。CaN活性=[(测定D值-对照D值)/(标准D值-空白D值)]×标准品浓度(0.1 μmol/L)×反应体系稀释倍数(5倍)×3÷待测样本蛋白浓度(mg/mL)。
1.3.7 NFATc2免疫荧光检测培养3 d后去上清,PBS冲洗2遍后,每孔加入4%多聚甲醛,室温环境下固定1 h,洗3次,每次5 min;滴加200 μL 0.3% Triton X-100室温孵育10 min,PBS洗3次,每次5 min;5%BSA室温封闭10 min,去BAS;滴加200 μL NFATc2单克隆抗体(1 :100, Novus Biologicals,美国),4 ℃过夜;PBS洗3次,每次5 min;滴加200 μL FITC标记的IgG,于4 ℃避光孵育2 h;PBS洗3次后,加入50 μL 1 μg/mL DAPI瞬染10 s,经PBS浸洗3次;4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行核染色,于倒置荧光显微镜下进行观察并拍照。
1.4 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件,以x±s表示正态分布计量数据,组间比较采用LSD法。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 各组培养上清中TNF-α的浓度培养3 d后,T淋巴细胞刺激组中TNF-α浓度较单纯PASMCs对照组显著升高(P < 0.01);MSC干预组中TNF-α浓度较T淋巴细胞刺激组明显下降(P < 0.01);而英夫利西单抗干预组中TNF-α浓度也明显低于T淋巴细胞刺激组(P < 0.01,图 1)。
2.2 MSC对PASMCs增殖的影响
与单纯PASMCs对照组相比,T淋巴细胞刺激组PASMCs的增殖能力增强(P < 0.01);与T淋巴细胞刺激组比较,MSC干预组和英夫利西单抗干预组细胞增殖被明显抑制(P < 0.01);外源重组大鼠TNF-α可有效促进PASMCs的增殖(P < 0.01,图 2)。
2.3 MSC对PASMCs细胞内钙离子浓度的影响
与单纯PASMCs对照组比较,T淋巴细胞刺激组PASMCs胞浆中游离钙离子的浓度明显上升(P < 0.01);MSC干预组、英夫利西单抗组PASMCs细胞浆内游离钙离子的浓度较T淋巴细胞刺激组明显下降(P < 0.01);外源重组大鼠TNF-α可有效促进PASMCs胞浆内游离钙离子浓度升高(P < 0.01,图 3)。
2.4 MSC对PASMCs胞内CaN、NFAT表达的影响
T淋巴细胞刺激组PASMCs胞内CaN的表达较单纯PASMCs对照组明显上调(P < 0.01);MSC干预组CaN表达较T淋巴细胞刺激组明显被抑制,与英夫利西单抗干预组抑制效应基本相当(P < 0.01),这种抑制作用可以被外源性重组大鼠TNF-α明显上调(P < 0.01,图 4A)。T淋巴细胞刺激组NFATc2的表达较单纯PASMCs对照组明显上调(P < 0.01);MSC干预组NFATc2表达较T淋巴细胞刺激组明显被抑制,与英夫利西单抗干预组抑制效应基本相当(P < 0.01),这种抑制作用可以被外源性重组大鼠TNF-α逆转(P < 0.01, 图 4B)。
2.5 MSC对PASMCs胞内CaN活性的影响
T淋巴细胞刺激组CaN的活性较单纯PASMCs对照组明显增强(P < 0.01);MSC干预组、英夫利西单抗干预组CaN活性较T淋巴细胞刺激组明显被抑制(P < 0.01);外源性重组大鼠TNF-α可以显著增强CaN的活性(P < 0.01, 图 5)。
2.6 MSC对PASMCs胞内NFATc2活化的影响
采用FITC荧光染料标记的NFATc2、DAPI染料标记细胞核,结果显示:单纯PASMCs对照组中NFATc2主要分布于细胞浆中,在活化T淋巴细胞的刺激下,NFATc2在细胞核区域明显增多,重叠后显示为青色。MSC干预组和英夫利西单抗干预组NFATc2在细胞核区域明显减少;外源性重组大鼠TNF-α可以在细胞核区域显著增强NFATc2活性(图 6)。
3 讨论
PH患者及疾病模型病理学观察均显示广泛的肺动脉血管平滑肌增厚和肺动脉血管的进行性收缩,而肺动脉血管平滑肌的增殖作用,在体内外的实验中均可以发现其可以被hu-MSCs抑制。可以肯定hu-MSCs有抑制PASMCs增殖和重塑血管的潜力,是PH极具应用前景的治疗措施。
在炎症环境中,某些因子的刺激下,细胞膜上的特异性受体能够与磷脂酶C发生偶联,进而导致平滑肌细胞膜表面钙离子通道的开放以及钙内流的增加,胞浆中高水平的钙离子浓度可以激活CaN/NFAT,NFAT去磷酸化激活后进入细胞核内,通过与相应基因的共同作用启动平滑肌细胞的增殖[12-13]。已有研究发现:TNF-α有促进血管平滑肌细胞增殖的作用[8-9],炎症因子TNF-α能够通过促进细胞外钙内流以及增加线粒体等内源性钙的释放提高内皮细胞胞浆钙离子的浓度[14-15]。尽管机制尚不完全清晰,但作为细胞增殖的关键信号,胞浆钙离子浓度增高介导的CaN/NFAT活化在其中可能发挥一定作用。MSC的免疫调节作用可以通过分泌免疫调节相关因子,如PGE2[16-17]、TGF-β1[18-19]、白介素-6(interleukin 6,IL-6)[20]等调节免疫反应,主要表现为显著抑制Th1相关炎症性细胞因子(如TNF-α和IFN-γ)的分泌[6-7]。基于MSC特有的免疫调节作用,利用MSC对PH动物模型进行移植,也能够获得很好的疗效[21-22],表明炎症性细胞的浸润在肺动脉血管重构中起到了很关键的作用[23-24]。
为了进一步阐释MSC是如何通过其免疫调节作用抑制T淋巴细胞的活化和PASMCs增殖,进而起到阻止肺动脉血管重构的作用,本研究建立了一个由PASMCs、T淋巴细胞和MSC组成的体外共培养体系。实验结果显示:共培养体系中,在ConA的刺激作用下,T淋巴细胞被活化,分泌炎症因子TNF-α的量显著升高,有效刺激了PASMCs增殖,显著增高PASMCs的钙离子内流及细胞浆中的钙离子浓度,CaN磷酸化激活并进而使其下游的NFAT去磷酸化激活,导致PASMCs显著增殖;MSC可以抑制T淋巴细胞的活化,T淋巴细胞分泌TNF-α的量不能显著增加,从而不能有效刺激PASMCs增殖;TNF-α的单抗英夫利西和活化的T淋巴细胞分泌的TNF-α结合,从而导致游离的TNF-α急剧下降,PASMCs的增殖明显减低,与MSC干预效果基本相当;在MSC干预组加用外源性TNF-α,PASMCs的增殖明显增强。本研究在体外还观察了被含有TNF-α的炎症因子刺激增殖时,PASMCs中CaN和NFATc2的活化情况,MSC通过对T淋巴细胞活化和对CaN、NFATc2的调控,进而发挥对PASMCs增殖的抑制作用。该结果与BONNET等[3]和CHEN等[4]的研究互相印证,与MSC参与其他疾病中的免疫调节效应一致[6]。本研究揭示了MSC抑制T淋巴细胞活化,减少炎症因子TNF-α分泌,抑制其导致的PASMCs增殖,为利用MSC对PH进行移植干预提供了基础研究数据支持。
但是PH时炎症介导的PASMCs增殖作用机制是复杂的,相关炎症因子间是否存在协同作用和作用网络,目前尚不完全清楚。需分步敲除相关因子,同时给予挽救实验开展研究,是一项巨大而复杂的工程。MSC对炎症的调节作用也是非常复杂的。本研究仅在体外利用MSC对活化的T淋巴细胞分泌TNF-α的抑制作用和CaN、NFATc2表达、活化进行了研究,实际作用过程中细胞间的接触抑制、受体介导的作用网络等均可起到非常重要的作用,仍需进一步的研究、探索。
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