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基于代谢组学的百合知母汤治疗抑郁症的作用研究
刘职瑞1, 杨波1, 刘芳1, 郭延磊2, 夏培元1     
1. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院药剂科;
2. 400065 重庆,重庆市中药研究院
[摘要] 目的 观察抑郁大鼠模型血清中内源性代谢物的变化,分析百合知母汤对异常代谢物的调节作用。方法 40只雄性SD大鼠(SPF级)按随机数字表法分为4组,每组10只,分别是正常对照组、模型组、氟西汀+模型组和百合知母汤+模型组。采用慢性不可预见性轻度应激联合孤养的方法建立抑郁大鼠模型,利用代谢组学方法寻找抑郁模型大鼠血清中改变的内源性代谢物及其相关代谢通路,从内源性代谢物的角度评价百合知母汤的抗抑郁作用。结果 百合知母汤可显著增加抑郁模型大鼠的体质量、糖水偏好度以及行为学得分(P < 0.05),并使模型大鼠血清中水平异常的23个差异代谢物回调至正常水平,主要涉及脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸代谢和脂质代谢;而氟西汀仅能纠正甘氨酸代谢和脂质代谢2条代谢通路中17个代谢物的水平异常。结论 与氟西汀相比,百合知母汤可影响更多的代谢通路而发挥抗抑郁作用。
[关键词] 百合知母汤     抑郁症     代谢组学     代谢通路    
A metabolomic study of Baihe Zhimu decoction in a rat model of depression
LIU Zhirui1, YANG Bo1, LIU Fang1, GUO Yanlei2, XIA Peiyuan1     
1. Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
2. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing, 400065, China
[Abstract] Objective To investigate the changes in endogenous metabolites in a rat model of depression and the modulatory effect of Baihe Zhimu decoction (BZD) on the abnormal metabolites through a metabolomic approach. Methods Forty rats were randomly divided into normal control group, depression model group, fluoxetine treatment group and BZD treatment group. In all but the control group, rat models of depression were established by keeping the rats in separate cages combined with exposure to chronic unpredictable mild stress. A metabolomic approach was used to identify the endogenous metabolites and metabolic pathways that were related to the antidepressive effects of BZD. Results BZD could significantly increase the body weight, sucrose preference and behavioral scores in the rat models of depression (P < 0.05). BZD treatment resulted in the recovery of normal levels for 23 metabolites that showed abnormal serum levels in the depressive rats, and these metabolites were associated with fatty acid amide metabolism, phenylalanine metabolism, glycine metabolism and lipid metabolism. By comparison, fluoxetine treatment only restored the normal levels for 17 abnormal metabolites, which were related with glycine metabolism and lipid metabolism. Conclusion BZD can modulate more metabolic pathways than fluoxetine for treatment of depression.
[Key words] Baihe Zhimu decoction     depression     metabolomics     metabolic pathways    

抑郁症是一种以情绪低落、兴趣感缺失为主要症状的精神障碍性综合征。目前,临床常用的抗抑郁药大多是基于“单胺假说”的化学合成药物,包括三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等[1]。这些药物建立在目前的单胺递质失衡、神经内分泌失调等对抑郁症病理机制的理解之上,虽取得了显著的治疗效果,仍然有20%~40%的患者未能从中获益,并且常见药物不良反应[2]。值得注意的是,在抑郁症的治疗中,包括百合知母汤在内的一些传统中药方剂也被证实具有显著的疗效。中药方剂的作用机理通常有别于化学药物,对其深入的研究,有助于理解和丰富现有的抑郁症治疗理论[3]

百合知母汤首载于汉代医家张仲景著述的《金匮要略》,由百合、知母两味药材组成,其药简力宏,疗效确切,是沿用至今的抑郁症治疗的经典方剂之一[4]。百合知母汤中的化学成分复杂,已有的研究大多只针对某个靶点或某条通路进行[5-7],而中药方剂的作用发挥通常不局限于单个(条)靶点或通路,更可能是方剂中有效成分网络对机体疾病状态下生物分子网络调节的综合结果[8],这些都非常适合以“组学”的手段系统性地开展进一步的研究。

代谢组学是定量描述生物整体内源性代谢物及其对内因和外因变化应答规律的科学。中药方剂作用在机体不同层次的不同靶标上会引起一系列内源性代谢物的组成和浓度发生变化,通过测定这些相互关联的变化有利于从全局上把握中药方剂的作用机理[9]。此外,抑郁症是一种系统性综合病症,其发病主要与单胺类递质系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴等复杂的信号网络改变有关[10],同时伴有氨基酸、糖代谢紊乱和血脂代谢异常[11],因此非常适合在分子代谢水平上深入研究。基于此,本研究将在证实百合知母汤抗抑郁作用的基础上,进一步采用代谢组学的研究方法,分析抑郁引起的血清代谢物变化,并使用MetaboAnalyst软件构建代谢通路,从代谢组学角度评价百合知母汤的抗抑郁作用。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

LC-30AD超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);Triple TOF 4600飞行时间质谱(美国AB Sciex公司),含Analyst、PeakView、MarkerView等软件;Legend Micro 17R型冷冻离心机(美国Thermo公司);Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司);超纯水机(美国Millipore公司);CPA225D型电子天平(德国Sartorius公司);HPLC级甲醇和乙腈(美国Fisher Scientific公司)。

1.2 药物

百合药材(重庆慧远药业有限公司,批号150301)、知母药材(重庆慧远药业有限公司,批号130801)均由陆军军医大学高宁教授鉴定,分别为百合科植物百合Lilium browni的干燥肉质鳞叶和百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides的干燥根茎;盐酸氟西汀对照品(美国Sigma公司)。

1.3 百合知母汤提取液的制备

百合知母汤的提取参考课题组前期文献报道[4],将药材粉碎后,分别取百合粉末270 g、知母粉末90 g用10倍量70%乙醇浸泡1 h后回流提取2次,每次2 h,合并提取液后静置并过滤,将滤液旋转浓缩为2.4 g/mL的百合知母汤提取液,4℃冰箱保存备用。

1.4 动物分组与给药

40只雄性SD大鼠(SPF级),体质量180~200 g,由陆军军医大学实验动物中心提供。饲养房内温度控制在(24±2)℃,湿度控制在(60±10)%,明/暗周期设置为12 h/12 h(开灯时间为8:00 AM~8:00 PM)。

在实验开始前,所有大鼠进行适应性饲养1周。将大鼠按随机数字表法分成4组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、氟西汀+模型组和百合知母汤+模型组,正常对照组5只/笼饲养,其余3组均每只单笼饲养。参照HARRO等[12]方法并结合本实验前期研究[4],使后3组大鼠接受以下7种刺激因子:①禁食24 h;②禁水24 h;③潮湿垫料和倾斜45°;④夹尾5 min;⑤昼夜颠倒24 h;⑥束缚应激2 h;⑦冰水中游泳5 min。实验持续6周,每日给予1种刺激,顺序随机,使动物不能预料刺激的发生。

实验期间,氟西汀+模型组给予10 mg/kg氟西汀,百合知母汤+模型组给予12 g/kg百合知母汤提取液,正常对照组和模型组给予同等体积的水。

1.5 模型评估

1.5.1 体质量变化

于实验第1和第42天,分别称取4组大鼠的体质量。

1.5.2 糖水偏好实验

造模42 d后,第1天:给予每只大鼠2瓶1%蔗糖水;第2天:给予每只大鼠1瓶装有1%蔗糖水,另1瓶纯净水;第3天:所有大鼠均禁食禁水;第4天:给予每只大鼠2瓶定量的水(1瓶1%蔗糖水,1瓶纯净水),1 h后交换2瓶位置,计算大鼠在2 h内的糖水消耗量,糖水偏爱率=糖水摄入量/(糖水摄入量+纯净水摄入量)×100%。

1.5.3 旷场实验

造模42 d后,将大鼠放入高40 cm,长宽均为100 cm,内壁涂黑,底部平均分为25个小方格的箱内底面中心,同时进行摄像和计时。开始时,将大鼠放置于中心的方格中,记录10 min内大鼠在旷场中移动的总距离和移动的平均速率。每只大鼠测试完毕后,用75%乙醇清洁旷场装置并于干燥后进行下一次旷场实验。

1.6 血清样本收集、预处理

最后一次给药后,从大鼠眼眶后静脉丛取血,室温静置30 min,4 ℃下3 500 r/min离心10 min,取上清于-80 ℃保存待分析。

血清样品于LC-MS分析前室温解冻,每份取50 μL置于1.5 mL离心管内,加入150 μL甲醇,涡旋混匀2 min,4 ℃下13 000 r/min离心5 min,取上清液进行LC-MS分析。质量控制(quality control, QC)样品通过合并等量来自不同的血清样品制备得到。为保证数据的可靠性,在数据采集过程中,每间隔6个样品使用QC样品进样1次,以监测采集系统的稳定性。

1.7 LC-MS分析条件

1.7.1 色谱条件

HILIC分析:色谱柱为TSKgel NH2-100 (2.0×150 mm, 3 μm),流动相A为含5 mmol/L的乙酸铵溶液,流动相B为含10%水的乙腈溶液。梯度设置如下:0~12 min, 100% B; 12.1~15 min, 100% B~70% B; 15.1~20 min, 100% B。流速为0.3 mL/min, 进样量:2 μL,柱温:35 ℃。

RPLC分析:色谱柱为Poroshell 120 EC-C18 (3.0×150 mm, 2.7 μm),流动相A为含0.01%甲酸的水溶液,流动相B为含0.01%甲酸的乙腈溶液,梯度设置如下:0~10 min, 5% B~80% B; 10.1~15 min, 80% B~100% B; 15.1~20 min, 100% B; 20.1~25 min, 5% B。流速为0.2 mL/min, 进样量:2 μL,柱温:30 ℃。

1.7.2 质谱条件

采用正、负离子模式进行检测,检测参数:正、负离子模式下离子源电压分别为5 500 V和4 500 V,去簇电压分别为40 eV和30 eV;气帘气、雾化气和辅助加热气分别为25、55 psi和55 psi,质量扫描范围m/z 50~1 000,离子源温度为600 ℃。设定子离子扫描以获得高分辨的MS/MS谱图。

1.8 数据分析

原始数据经MarkerView软件进行识别处理,经过去同位素峰后,导出包括质荷比、保留时间和峰强度的三维数据矩阵。采用修正80%规则来去除缺失值,即去除在某一组中出现频率(非零值)低于80%的质谱离子。采用每个样品的总峰强度进行归一化,以Excel文件格式保存,用于多变量数据分析。将归一化的数据导入到SIMCA-P 11.5软件中经过中心化和标度化预处理后,再进行偏最小二乘法-判别分析(partial least square-discriminate analysis,PLS-DA)以获取各组之间的分离趋势[13-14]。应用曼-惠特尼U检验对各组间变量重要性投影值(variable importance in the projection,VIP)>1离子的峰强度进行检验,获得的差异性代谢物与Metlin(http://metlin.scripps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)和KEGG(http://www.genome.jp/k:egg)等数据库进行匹配,并参考相关文献最终确定潜在的代谢标记物。

1.9 统计学分析

体质量变化、糖水偏好和旷场实验的原始数据用SPSS 18.0软件进行方差分析,当P<0.05时,采用SNK法进行两两比较。

2 结果 2.1 百合知母汤对大鼠体质量增加值的影响

图 1A所示,实验结束后,正常对照组大鼠体质量增加最多,模型组体质量增加最少,百合知母汤+模型组和氟西汀+模型组大鼠体质量增加程度显著高于模型组(P<0.05),但仍比正常组增加缓慢。

1:正常对照组;2:模型组;3:氟西汀+模型组;4:百合知母汤+模型组;a:P<0.05,与正常对照组比较;b:P<0.05,与模型组比较 图 1 百合知母汤对抑郁症模型大鼠体质量增加(A)、糖水偏好度(B)、旷场实验中移动总距离(C)和速率(D)的影响  (n=10)

2.2 百合知母汤对糖水偏好度的影响

图 1B所示,模型组大鼠糖水偏好度值低于正常组(P<0.05),而氟西汀+模型组与百合知母汤+模型组的糖水偏好度值均显著高于抑郁症模型组(P<0.05),百合知母汤+模型组与氟西汀+模型组两者无统计学差异。

2.3 百合知母汤对大鼠行为学得分的影响

2.3.1 旷场移动总距离

结果显示,模型组大鼠的旷场移动总距离较正常对照组明显降低(P<0.05);氟西汀+模型组和百合知母汤+模型组大鼠的移动总距离显著高于模型组(P<0.05),两者间无统计学差异(图 1C)。

2.3.2 旷场移动速率

旷场移动速率结果与旷场移动总距离结果一致,即与正常对照组相比,模型组大鼠的旷场移动速率明显降低(P<0.05);氟西汀+模型组和百合知母汤+模型组大鼠的移动速率显著高于模型组(P<0.05),两者间无统计学差异(图 1D)。

2.4 多元统计分析

为了检测本研究中4组间大鼠血清代谢轮廓是否存在差异,我们建立了4个PLS-DA模型,模型参数R2X表示构建的模型对不同分组的区分能力,R2Y表示模型与Y数据的匹配程度,Q2表示模型的预测能力,三者的数值应接近于1,从表 1可知所构建的PLS-DA模型具有较好的可信度和预测能力。

表 1 PLS-DA模型的可信度和预测能力
组别 R2X R2Y Q2
模型组vs正常对照组 0.897 0.771 0.882
氟西汀+模型组vs模型组 0.738 0.941 0.814
百合知母汤+模型组vs模型组 0.758 0.964 0.946
正常对照组vs模型组vs氟西汀+模型组vs百合知母汤+模型组 0.703 0.719 0.805

图 2A~C显示构建的模型能够将不同的分组很好地区分开来,图 2D显示百合知母汤+模型组和氟西汀+模型组则主要位于正常对照组和模型组之间,说明百合知母汤和阳性对照药氟西汀对抑郁症有不同程度的治疗作用。

A:模型组vs正常对照组;B:百合知母汤+模型组vs模型组;C:氟西汀+模型组vs模型组;D:正常对照组vs模型组vs氟西汀+模型组vs百合知母汤+模型组 图 2 不同组间的PLS-DA得分

2.5 差异代谢物分析

为寻找差异性代谢物,首先通过SIMCA-P软件得到各组间VIP值>1的内源性代谢物,再对其峰强度进行曼-惠特尼U检验,保留P<0.05的代谢物。同时满足VIP>1和P<0.05这2个条件即视为差异性代谢物。

本研究共筛选出37种与抑郁症发生密切相关的代谢物,包括28种甘油磷脂、3种中链酰基卡尼丁、2种脂肪酸酰胺、2种甘氨酸衍生物、乙醇胺和L-苯丙氨酸;此外还分别筛选出23个和17个与百合知母汤和氟西汀抗抑郁作用相关的代谢物。这些代谢物的种类和数量与文献[15-16]报道的差别较大,这可能是给予药物和模型的差异造成的。所鉴别出的差异性代谢物见图 3表 2

A:磷脂酰胆碱;1:PC(20:3/P-18:1);2:PC(18:1/18:1);3:PC(18:2/22:6);4:PC(22:6/18:0);B:溶血磷脂酰胆碱;1:LysoPC(P-18:0);2:LysoPC(20:2);3:LysoPC(22:5);4:LysoPC(16:1);C:溶血磷脂酰乙醇胺;1:LysoPE(16:0/0:0);2:LysoPE(18:3/0:0);3:LysoPE(22:1/0:0);4:LysoPE(22:0/0:0);D:脂肪酸酰胺、甘氨酸和卡尼汀衍生物;1:Palmitic amide;2:Glycine;3:3-Dehydroxy carnitine;4:Propionyl carnitine;5:Ethanolamine;a: P<0.05,b:P<0.01,与正常对照组比较;c:P<0.05,d:P<0.01,与模型组比较 图 3 部分代谢物在各组中的离子强度图

表 2 百合知母汤对模型大鼠差异代谢物的影响
代谢物 HMDB ID VIP值 FC (M/N) FC (B/M) FC (F/M) 代谢通路
3-Dehydroxy carnitine HMDB06831 1.90 1.35 ↑a 1.10 ↑ 0.92 ↓ 脂肪酸β氧化
Propionyl carnitine HMDB00824 1.43 0.53 ↓b 1.79 ↑ 1.49 ↑ 脂肪酸β氧化
Vaccenyl carnitine HMDB06351 1.62 0.52 ↓b 1.29 ↑ 1.34 ↑ 脂肪酸β氧化
Oleamide HMDB02117 1.57 0.47 ↓b 2.24 ↑d 1.23 ↑ 脂肪酸酰胺代谢
Palmitic amide HMDB12273 1.04 0.26 ↓b 3.25 ↑d 1.33 ↑ 脂肪酸酰胺代谢
Glycine HMDB00123 1.08 0.75 ↓a 1.48 ↑d 1.26 ↑c 甘氨酸代谢
Alanyl glycine HMDB06899 1.20 0.45 ↓b 1.10 ↑ 1.15 ↑ 甘氨酸代谢
Ethanolamine HMDB00149 1.16 1.92 ↑b 0.50 ↓d 0.47 ↓d 乙醇胺代谢
L-Phenylalanine HMDB00159 1.78 1.55 ↑b 0.73 ↓c 0.85 ↓ 苯丙氨酸代谢
LysoPC(15:0) HMDB10381 1.57 0.70 ↓b 1.39 ↑c 1.17 ↑ 脂质代谢
LysoPC(16:0) HMDB10382 1.64 0.52 ↓b 1.24 ↑c 1.06 ↑ 脂质代谢
LysoPC(17:0) HMDB12108 1.43 0.67 ↓b 1.15 ↑ 1.46 ↑c 脂质代谢
LysoPC(16:1) HMDB10383 1.67 1.32 ↑b 0.88 ↓c 0.93 ↓ 脂质代谢
LysoPC(18:2) HMDB10386 1.33 1.10 ↑a 0.95 ↓ 0.84 ↓c 脂质代谢
LysoPC(18:4) HMDB10389 1.20 1.44 ↑a 0.77 ↓c 0.81 ↓c 脂质代谢
LysoPC(20:2) HMDB10392 1.33 1.12 ↑a 0.96 ↓ 0.97 ↓ 脂质代谢
LysoPC(20:4) HMDB10396 1.85 0.78 ↓a 1.39 ↑c 1.09 ↑ 脂质代谢
LysoPC(22:5) HMDB10403 1.53 1.14 ↑a 0.93 ↓ 0.90 ↓ 脂质代谢
LysoPC(22:6) HMDB10404 1.07 1.22 ↑a 0.95 ↓ 0.92 ↓ 脂质代谢
LysoPC(P-18:0) HMDB13122 1.89 1.60 ↑a 0.78 ↓c 0.81 ↓c 脂质代谢
LysoPE(22:0/0:0) HMDB11490 1.97 0.33 ↓b 1.93 ↑c 1.61 ↑ 脂质代谢
LysoPE(22:1/0:0) HMDB11491 1.49 0.33 ↓b 1.13 ↑ 1.32 ↑ 脂质代谢
LysoPE(16:0/0:0) HMDB11503 1.71 0.50 ↓b 1.19 ↑ 1.50 ↑ 脂质代谢
LysoPE(18:3/0:0) HMDB11509 1.26 0.36 ↓b 1.26 ↑ 1.71 ↑ 脂质代谢
PC(14:1/22:2) HMDB07921 1.20 0.70 ↓b 1.23 ↑ 1.11 ↑ 脂质代谢
PC(18:1/18:1) HMDB00593 1.25 0.55 ↓a 1.09 ↑ 1.45 ↑d 脂质代谢
PC(18:2/22:6) HMDB08156 1.84 0.28 ↓b 2.11 ↑d 2.30 ↑d 脂质代谢
PC(20:3/22:6) HMDB08387 1.88 0.48 ↓b 1.54 ↑c 1.86 ↑d 脂质代谢
PC(20:3/P-18:1) HMDB08392 1.83 0.49 ↓b 1.72 ↑d 1.83 ↑d 脂质代谢
PC(22:4/14:0) HMDB08623 1.88 0.66 ↓b 1.5 ↑d 1.22 ↑c 脂质代谢
PC(22:4/16:0) HMDB08626 1.55 0.41 ↓b 1.86 ↑d 1.65 ↑d 脂质代谢
PC(22:5/16:0) HMDB08692 1.79 0.57 ↓b 1.54 ↑d 1.38 ↑d 脂质代谢
PC(22:6/16:0) HMDB08725 1.63 0.50 ↓b 1.57 ↑d 1.41 ↑d 脂质代谢
PC(22:6/18:0) HMDB08727 1.2 0.50 ↓b 1.49 ↑c 1.67 ↑c 脂质代谢
PC(22:6/18:1) HMDB08729 1.21 0.42 ↓b 2.37 ↑d 1.68 ↑ 脂质代谢
PC(22:6/20:4) HMDB08740 1.63 0.27 ↓b 2.77 ↑d 3.34 ↑d 脂质代谢
PC(P-18:1/18:3) HMDB11279 1.77 1.47 ↑a 0.79 ↓c 0.45 ↓d 脂质代谢
FC:改变倍数;N:正常对照组;M:模型组;B:百合知母汤+模型组;F:氟西汀+模型组;a:P<0.05,b: P<0.01,与正常对照组比较;c:P<0.05,d:P<0.01,与模型组比较

2.6 代谢通路分析

代谢物在网络关键位置的显著改变会触发整体代谢网络的变化,因此我们使用Metaboanalyst 4.0中MetPA模块进行代谢通路拓扑分析并绘制图。将代谢通路的影响值(pathway impact)界定在0.05,当某一条代谢通路的影响值大于0.05时,即认定其为潜在的靶标代谢通路。图中圆圈代表了所有匹配的代谢通路,圆圈的颜色和大小是分别依据代谢通路的P值和通路影响值确定的。图 3A表明百合知母汤主要影响的代谢通路有脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸代谢和脂质代谢,图 3B表明氟西汀主要对甘氨酸代谢和脂质代谢通路有影响。

A:百合知母汤主要影响的代谢通路;1:脂肪酸酰胺代谢;2:苯丙氨酸代谢;3:甘氨酸代谢;4:脂质代谢;B:氟西汀主要影响的代谢通路;1:甘氨酸代谢;2:脂质代谢 图 4 差异代谢物MetPA通路分析

3 讨论 3.1 大鼠抑郁症模型的建立与评价

应激是抑郁症重要的发病原因之一,本研究采用慢性不可预见性轻度应激联合孤养方式建立抑郁症大鼠模型,将7种不同的应激因子在实验过程中随机应用,使应激多变和不可预测,相较其他的动物模型能更真实地模拟出抑郁症的环境诱因,此外该抑郁症大鼠模型的行为学和神经内分泌等改变可持续数周,因此被广泛用于抑郁症发病机制和抗抑郁药物药效评价的研究[17]

本研究通过测定体质量增加值、糖水偏好度和旷场实验行为学改变等指标,评价模型是否成功建立[18]。其中体质量变化反映动物饮食水平和机体生理代谢状态;糖水偏好度反映大鼠对食物的欣快感;旷场实验行为被用于评定大鼠在新异环境中的自主和探究行为。

相较正常对照组,模型组大鼠体质量增加量、糖水偏好度、旷场实验中的移动总距离和速率均显著减少(P<0.05)。此外在行为学实验中,模型组大鼠还表现出明显的蜷缩、僵硬和回避行为,与抑郁症患者临床表现出的反应迟钝、活动减少等症状相似。以上的结果提示模型构建成功,可作为可靠的抑郁症模型进行后续研究。

3.2 百合知母汤治疗抑郁症的疗效评价

本研究选择每天1次,连续6周给予大鼠百合知母汤(12 g/kg),同时以经典抗抑郁药氟西汀(10 mg/kg)为阳性对照。结果显示,百合知母汤和阳性对照药氟西汀均能明显改善模型组的前述效应指标值(P<0.05),但百合知母汤+模型组的各项效应指标值与氟西汀+模型组均无统计学差异。

值得注意的是,无论是百合知母汤+模型组还是氟西汀+模型组,除了糖水偏好度值与正常组无差异外,其余各项指标值均略低于正常组,但差异并无统计学意义。可能因为抑郁症是一种慢性疾病,且易反复发作,需要长期给药治疗[19],而本次实验考察的药物疗程(6周)并不充分。

3.3 百合知母汤对抑郁症模型大鼠血清差异代谢物的干预作用

3.3.1 脂质代谢

甘油磷脂(glycerophospholipid)是构成细胞膜并参与对蛋白质识别和信号转导的一类磷脂,具有重要的生物学效应,主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)两大类。PC在体内可代谢为饱和或不饱和LysoPC,正常生理状态下,体内不饱和LysoPC与饱和LysoPC处于平衡状态,抑郁状态下,磷脂酶A2活性增强,使不饱和LysoPC生成增多,平衡受破坏[20],而不饱和LysoPC可通过5-脂氧合酶通路进一步活化氧化应激水平,加重抑郁程度[21]。本研究发现了28个与抑郁症相关的甘油磷脂类标志物,包括11个溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidyl choline, Lyso PC)、13个磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline, PC)和4个溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidyl ethanolamine, Lyso PE),其中,11个LysoPC包括7个不饱和Lyso PC和4个饱和Lyso PC。与正常对照组相比,模型组大鼠中大部分不饱和Lyso PC的含量显著升高(P<0.05),而大部分饱和Lyso PC的含量显著降低(P<0.05),变化趋势与文献[11]报道一致。百合知母汤可通过下调部分不饱和LysoPC如LysoPC(18:4)、LysoPC(16:1)和回调饱和LysoPC如LysoPC(15:0)和LysoPC(16:0)水平,发挥抗抑郁作用。由此,脂质代谢通路是百合知母汤发挥抗抑郁作用的重要通路之一。此外,本研究还发现模型组大鼠血浆中LysoPE显著降低,而百合知母汤可一定程度回调LysoPE水平,但与模型组相比,没有统计学差异,提示LysoPE可能不是百合知母汤发挥作用的主要靶点。

3.3.2 脂肪酸β氧化

卡尼汀循环是脂肪酸β氧化的第一步。卡尼汀循环中脂酰CoA通过卡尼汀转运进入线粒体内形成脂肪酰基卡尼汀[22]。已有研究表明机体内中链酰基卡尼汀的含量越低,抑郁程度越重[11],补充左卡尼汀能够改善抑郁症状[23]。本研究筛选出卡尼汀家族中的2种中链酰基卡尼汀——丙酰卡尼丁(Propionyl carnitine)和Vaccenyl carnitine在模型组大鼠体内的含量显著低于正常对照组(P<0.01),表明脂肪酸β氧化可能受到限制,提示该两种中链酰基卡尼汀为抑郁症疾病的潜在标志物。给予百合知母汤治疗后,大鼠血清内中链酰基卡尼汀水平略有回调,但与正常组大鼠无明显差异,提示百合知母汤对抑郁症大鼠体内脂肪酸β氧化的紊乱无明显作用。

3.3.3 脂肪酸酰胺代谢

脂肪酸酰胺是哺乳动物体内具有多种中枢调节功能的脂质,其中脂肪酸伯酰胺类的油酸酰胺(Oleamide)具有很强的镇静催眠作用。睡眠障碍是抑郁症患者的常见症状,已有研究证实在抑郁患者体内油酸酰胺的含量显著降低[24],给予适量油酸酰胺可改善母婴分离产后抑郁症动物模型的睡眠障碍[25]。本研究筛选出2种脂肪酸酰胺类成分—油酸酰胺和Palmitic amide在模型组大鼠体内含量显著低于正常对照组(P<0.01)。其中油酸酰胺已有相关报道,而Palmitic amide为本研究发现。百合知母汤能显著上调抑郁症大鼠体内脂肪酸酰胺的浓度(P<0.01),使其代谢水平达到或接近正常组。提示脂肪酸酰胺代谢通路是百合知母汤发挥抗抑郁作用的重要环节通路之一。

3.3.4 甘氨酸代谢

甘氨酸是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的竞争性配体,当甘氨酸结合到选择性甘氨酸结合位点时,可间接增强NMDA受体激动后所产生的生理效应,而NMDA受体的过度激活被认为是抑郁症发生的重要原因之一[26]。本研究结果显示,模型组大鼠血浆中甘氨酸的含量与正常对照组相比显著降低(P<0.05),这一结果与早前临床研究显示的结果相吻合[27]。此外,本研究还发现甘氨酸衍生物Alanyl glycine在抑郁症模型大鼠体内显著降低(P<0.01),2种甘氨酸衍生物在模型组大鼠体内变化趋势一致。因此,我们推测抑郁症可能涉及甘氨酸的代谢异常。百合知母汤可显著上调模型组大鼠体内脂肪酸酰胺的浓度(P<0.01),使其达代谢水平达到或接近正常对照组。

3.3.5 苯丙氨酸代谢

苯丙氨酸能够促进胆囊收缩素的释放,产生饱腹感而抑制食欲,最终减少食物的摄入[28]。本研究结果显示,模型大鼠血清中苯丙氨酸的含量与正常对照组相比显著增高(P<0.01),这与先前文献报道一致[29]。我们推测模型组大鼠食欲下降、日常饮食摄入量的减少可能与苯丙氨酸含量升高有关,而百合知母汤可显著下调苯丙氧酸的含量(P<0.05),使其代谢水平达到或接近正常对照组,提示苯丙氨酸代谢通路是百合知母汤发挥抗抑郁作用的重要环节通路之一。

综上,本研究成功建立了大鼠抑郁症模型,百合知母汤(12 g/kg)和氟西汀(10 mg/kg)的抗抑郁效果无统计学差异。此外,我们利用代谢组学方法鉴别了与抑郁症相关的37种潜在的血清代谢物,其中卡尼汀类的Propionyl carnitine、Vaccenyl carnitine,脂肪酸酰胺类的Palmitic amide以及甘氨酸衍生物Alanyl glycine属于首次报道。百合知母汤可纠正其中23个生物标志物的水平异常,通过作用于脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸代谢和脂质代谢4条代谢通路协同发挥抗抑郁作用,而阳性药物氟西汀经分析,只能纠正其中17个生物标志物的水平异常,对甘氨酸代谢和脂质代谢通路的影响较大。本研究从内源性代谢物的角度为探索百合知母汤的作用机制提供了证据,但各差异性代谢物与抑郁症的内在联系以及相关代谢通路的验证仍需要进一步考察。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201905065
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

刘职瑞, 杨波, 刘芳, 郭延磊, 夏培元.
LIU Zhirui, YANG Bo, LIU Fang, GUO Yanlei, XIA Peiyuan.
基于代谢组学的百合知母汤治疗抑郁症的作用研究
A metabolomic study of Baihe Zhimu decoction in a rat model of depression
第三军医大学学报, 2019, 41(20): 1917-1925
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(20): 1917-1925
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201905065

文章历史

收稿: 2019-05-12
修回: 2019-06-20

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