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SPAG6在骨髓增生异常综合征患者中的表达及其基因启动子甲基化状态
陈亚, 蒋梅, 罗小华, 王利, 刘林     
400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院血液内科
[摘要] 目的 探讨SPAG6在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中的表达水平与临床参数相关性以及基因启动子甲基化状态对SPAG6转录调控的影响。方法 采用RT-qPCR及Western blot检测18例MDS及MDS-AML患者和20例健康对照者骨髓细胞SPAG6表达水平;甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测MDS患者和对照组(包括初诊缺铁性贫血患者和健康体检人群)SPAG6启动子甲基化状态;分析SPAG6启动子甲基化状态及表达水平与患者临床参数相关性。结果 与健康对照组比较,MDS患者SPAG6表达水平明显升高,且SPAG6启动子区域呈现异常低甲基化(P < 0.01)。SPAG6表达水平与患者年龄、骨髓原始细胞比例、危险分层有相关性(P < 0.05),与患者性别无相关性(P>0.05)。SPAG6基因启动子异常低甲基化状态与患者年龄、疾病危险分层有相关性(P < 0.05),与患者性别、骨髓原始细胞比例无相关性(P>0.05)。结论 SPAG6在MDS患者中高表达,并且与疾病发生、进展以及不良预后相关,表观遗传调控可能是SPAG6转录调控的重要机制之一。
[关键词] SPAG6基因     启动子甲基化     骨髓增生异常综合征    
Expression level of sperm-associated antigen 6 and its gene promoter methylation status in myelodysplastic syndrome patients
CHEN Ya, JIANG Mei, LUO Xiaohua, WANG Li, LIU Lin     
Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
[Abstract] Objective To investigate the association between sperm-associated antigen 6 (SPAG6) expression level and the clinical parameters of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and explore how SPAG6 gene promoter methylation status regulates SPAG6 transcription. Methods Bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) were collected from 18 patients with MDS or MDS-acute myeloid leukemia (MDS-AML) and 20 healthy control subjects for detection of SPAG6 expression using RT-qPCR and Western blotting. The methylation status of SPAG6 promoter in patients with MDS and the healthy controls was assessed using methylation-specific PCR (MS-PCR). The correlation of SPAG6 promoter methylation status and SPAG6 expression level with the clinical parameters of patients were analyzed. Results Compared with the healthy control subjects, the patients with MDS showed significantly increased expression levels of SPAG6 in the BMMNCs with significant abnormal hypomethylation in SPAG6 gene promoter region (P < 0.01). In the patients with MDS, the expression level of SPAG6 in the BMMNCs was significantly correlated with the patients' age, bone marrow blast cell ratio and risk stratification (P < 0.05) but not with the patients' gender (P>0.05). The abnormal hypomethylation of SPAG6 gene promoter was significantly correlated with age and disease risk stratification (P < 0.05) but not with gender or bone marrow blast cell ratio (P>0.05). Conclusion SPAG6 is highly expressed in the BMMNCs of patients with MDS, which is associated with the occurrence, progression and a poor prognosis of the disease. Epigenetic regulation can be an important mechanism for transcriptional regulation of SPAG6.
[Key words] sperm-associated antigen 6 gene     promoter methylation     myelodysplastic syndrome    

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是成人最常见的获得性骨髓衰竭综合征,属于高度异质性的恶性克隆性血液疾病,以骨髓一系或多系发育不良、无效造血以及分化异常为特征[1],约1/3的临床患者最终会转化为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)[2]。MDS的发病机制复杂,通常认为多种遗传学异常及相应基因改变可能在MDS的发生、发展中起作用[3-4],且治疗手段及疗效有限[5],进一步深入研究MDS发病机制及治疗预后等,为精准诊断及靶向治疗提供新的方向和思路非常必要。

精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6, SPAG6)被定义为肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen, CTA)家族成员[6],CTA家族基因通常在正常体细胞组织中有甲基化的CpG岛,而在精子形成过程中经脱甲基化被活化[7]。全基因组低甲基化及部分抑癌基因的异常高甲基化是多种恶性肿瘤中常见的表观遗传改变,基因组的异常低甲基化已被证明会导致染色体不稳定并可引起致癌基因的转录激活[8-10],甲基化沉默基因的重新表达可能与肿瘤发病相关。本课题组前期在细胞和动物实验研究中证实SPAG6在MDS细胞株SKM-1中高表达并参与促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[11-12],提示SPAG6参与了MDS的发生、发展。本研究进一步检测SPAG6在MDS患者中的表达水平与基因启动子甲基化状态并分析其与临床参数相关性,以探讨SPAG6在MDS发生、发展以及预后中的意义。

1 资料与方法 1.1 研究对象

收集2016-2018年重庆医科大学附属第一医院血液科门诊及住院部收治的MDS患者。纳入标准:①成年MDS患者,符合法美英协作组(FAB)及世界卫生组织(WHO)分型诊断标准(2008年版),初诊未治或至少2个月内未经过去甲基化试剂(HMA)治疗者;②危险分层按照2012年版MDS IPSS国际预后评分系统进行划分。排除标准:①合并严重骨髓纤维化、骨髓空抽的患者;②合并难以控制的严重急、慢性感染者;③近期接受过去甲基化试剂(HMA)治疗者;④合并未控制呼吸、循环系统严重疾病,严重肝肾功能不全,其他恶性肿瘤急需治疗,及因脑功能紊乱或者精神因素不理解或不耐受检查者。对照组选取同期初诊缺铁性贫血(iron deficiency anaemia,IDA)患者和健康体检人群。

共收集18例MDS患者(MDS组)和20例健康体检者及IDA患者(对照组)骨髓标本。MDS组年龄27~75岁,其中男性15例,女性3例。根据患者的外周血常规、骨髓穿刺、流式检查、核型分析等检查结果进行诊断分型和危险分层。对照组年龄31~68岁,其中男性15例,女性5例。本研究经本院伦理委员会批准[2015年科研伦理(2015-063)号], 并与患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂

淋巴细胞分离液购于天津灏洋生物制品科技公司;TRIzol试剂购于美国Thermo Fisher公司;PCR及逆转录试剂盒、SPAG6及GAPDH引物均购于大连TaKaRa公司;PVDF膜购于美国Millipore公司;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于苏州碧云天生物技术公司;WB抗体购于美国Abeam公司;亚硫酸盐处理试剂盒购于美国Zymo公司。

1.3 实时荧光定量反转录PCR

抽取MDS患者及对照组骨髓3~5 mL,采用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs),TRIzol法提取总RNA,按照试剂盒要求逆转录为cDNA后进行RT-qPCR检测。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性5 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环。SPAG6引物上游:5′-AGTGCGACATTCTTCCACAGCTTG-3′,下游:5′-GCGTATCCAGTGCTCCACAATCG-3′。内参基因GAPDH引物上游:5′-TGACTTCAACAGCGACA-CCCA-3′,下游:5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。Bio-Rad CFX Manager系统收集数据,2-ΔΔCt法分析SPAG6 mRNA相对表达水平。实验均重复3次以上。

1.4 DNA和蛋白质的提取

无水乙醇沉淀TRIzol法处理样本后中间层和有机相中DNA,含10%乙醇的0.1 mol/L柠檬酸钠和75%乙醇分别洗涤沉淀,溶于8 mmol/L NaOH,并用0.1 mol/L HEPES将pH调至合适值。异丙醇沉淀前述TRIzol处理后样本上清中蛋白质,含0.3 mol/L盐酸胍的95%乙醇溶液及无水乙醇分别洗涤后溶于1%SDS。分光光度仪检测所提取DNA和蛋白质浓度及纯度。

1.5 甲基化特异性PCR

Genome Browser基因数据库查找SPAG6基因上游2 000 bp及第一外显子序列,软件分析SPAG6基因启动子CpG岛后由大连TaKaRa生物公司合成甲基化特异性PCR引物。甲基化引物(M)序列:上游5′-GTAATTTATTCGTTTGGTTGTTTTC-3′,下游5′-AAATTACCGTAATATCCTAACTACGAC-3′,产物长度105 bp;非甲基化引物(U)序列:上游5′-ATTTATTTGTTTGGTTGTTTTTGA-3′,下游5′-CCCAAATTACCATAATATCC-TAACTACA-3′,产物长度105 bp。亚硫酸氢盐修饰:按照试剂盒要求对提取DNA进行亚硫酸盐修饰。原理:DNA的CG中如果C(胞嘧啶)无甲基化,则CG转变为UG,而甲基化的CG则不转变,因此处理后的DNA序列将根据甲基化状态发生相应改变。MS-PCR:反应体系(25 μL),94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃扩增45 s,循环35次,72 ℃延伸8 min。80 V恒压条件下2%琼脂糖凝胶电泳,于凝胶成像仪上检测表达。

1.6 Western blot检测蛋白表达

根据目的蛋白分子量制备10%的凝胶, 提取总蛋白测浓度后按最低浓度配平,上样量50 μg,80 V转100 V SDS-PAGE电泳2 h,200 mA恒流电转1 h到PVDF膜, 封闭液封闭2 h。兔抗人SPAG6及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后羊抗兔二抗室温孵育1 h。避光显影,Image Lab软件分析灰度值,以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件,计量资料以x±s表示,多组间差异比较采用单因素方差分析,两组间差异比较采用t检验,P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MDS患者一般临床资料

两组人群的年龄、性别及白细胞计数差异无统计学意义(P>0.05),但MDS组的血红蛋白(Hb)和血小板计数(PLT)水平均较对照组显著降低(P < 0.01,表 1)。

表 1 两组一般临床资料
组别 n 年龄/岁 性别(男/女) WBC/×109·L-1 Hb/g·L-1 PLT/×109·L-1
对照组 20 53.35±9.07 15/5 6.85±2.98 118.70±20.53 224.60±78.22
MDS组 18 60.39±12.07 15/3 4.82±3.58 91.71±13.69a 110.61±54.22a
a:P < 0.01,与对照组比较

2.2 SPAG6基因在MDS患者中的表达水平

2.2.1 SPAG6基因在MDS患者骨髓中的mRNA表达

RT-qPCR检测两组骨髓细胞中SPAG6基因表达水平,结果显示,MDS组骨髓细胞中SPAG6的mRNA表达水平较对照组显著升高(P=0.000 8,图 1A)。进一步将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,MDS患者样本的扩增产物可见明显条带,提示MDS组的SPAG6 mRNA表达明显高于对照组(图 1B),与RT-qPCR结果一致。

A:RT-qPCR检测SPAG6的表达  a:P < 0.01,与对照组比较;B:琼脂糖凝胶电泳检测两组SPAG6的表达  1~4:4个不同样本 图 1 两组骨髓中SPAG6 mRNA的表达

2.2.2 SPAG6蛋白在MDS患者骨髓中的表达水平

采用Western blot检测骨髓细胞中SPAG6蛋白的表达差异,结果显示MDS组SPAG6蛋白条带明显强于对照组(图 2A)。进一步利用Image J软件提取各样本条带灰度值,以GAPDH为内参,结果显示MDS组的SPAG6蛋白表达较对照组明显增高(P=0.0044,图 2B)。这与SPAG6 mRNA在两组样本中的表达情况一致。

A:Western blot检测结果  1~3:3个不同样本;B:半定量分析结果  a:P < 0.01,与对照组比较 图 2 两组骨髓中SPAG6蛋白的表达

2.3 SPAG6表达水平与MDS患者临床参数相关性

根据MDS患者性别、年龄、骨髓原始细胞比例、IPSS评分危险分层等临床参数,分析SPAG6基因在各参数亚组间的表达差异,结果提示SPAG6基因表达量与患者年龄、骨髓原始细胞比例、IPSS评分明显相关。其中,MDS患者年龄越大SPAG6基因表达量越高(P=0.028 2),患者原始细胞比例越高SPAG6基因表达量越高(P=0.000 4),此外患者IPSS评分也与SPAG6基因表达量呈正相关(P=0.000 1),但在患者性别间未发现明显差异(P>0.05,表 2)。

表 2 SPAG6表达水平与MDS患者各临床参数相关性
临床参数 n SPAG6表达量 P
性别
  男 15 14.919±14.291 0.535 5
  女 3 9.412±9.101
年龄/岁
   < 50 4 11.285±8.201 0.028 2
  50~60 11 10.074±11.757
   > 60 3 32.023±13.096
原始细胞
   < 5% 7 5.498±6.436 0.000 4
  5%~10% 8 13.029±10.362
   > 10% 3 36.433±6.215
IPSS评分
  低危 2 3.449±0.790 0.000 1
  中危-1 8 3.099±1.175
  中危-2 6 18.364±10.165
  高危 2 39.253±5.445

2.4 MDS患者SPAG6基因启动子甲基化状态

以经过亚硫酸盐修饰的DNA为模板,利用甲基化和非甲基化特异性引物通过PCR扩增SPAG6基因启动子区域片段,MS-PCR结果显示MDS组中非甲基化引物(U)扩增阳性,SPAG6启动子大部分处于低甲基化状态,对照组中甲基化引物(M)扩增阳性,SPAG6启动子绝大部分处于高度甲基化状态。其中,MDS组SPAG6基因启动子去甲基化率为83%(15/18),而对照组为20%(4/20),MDS组SPAG6基因启动子去甲基化水平明显高于对照组(P < 0.001,图 3表 3)。

1~6: 6个不同样本  A:对照组非甲基化引物扩增;B:MDS组非甲基化引物扩增;C:对照组甲基化引物扩增;D:MDS组甲基化引物扩增 图 3 MDS患者的SPAG6启动子甲基化水平

表 3 SPAG6启动子区甲基化水平与MDS患者临床参数的关系
临床参数 n 去甲基化[例(%)] χ2 P
性别
  男 15 12(80.0) 0.720 0.369
  女 3 3(100.0)
年龄/岁
   < 50 4 1(25.0) 12.600 0.002
  50~60 11 11(100.0)
   > 60 3 3(100.0)
原始细胞
   < 5% 7 4(57.1) 5.675 0.059
  5%~10% 8 8(100.0)
   > 10% 3 3(100.0)
IPSS评分
  低危 1 0(100.0) 7.174 0.016
  中危-1 7 5(71.4)
  中危-2 8 8(100.0)
  高危 2 2(100.0)

2.5 SPAG6启动子甲基化水平与临床参数相关性

分析MDS患者SPAG6基因启动子甲基化水平与其性别、年龄、骨髓原始细胞比例及IPSS评分等临床特征相关性,结果提示SPAG6基因启动子甲基化水平与患者年龄、IPSS评分危险分层有明显相关性。其中患者年龄越大SPAG6基因启动子去甲基化率越高(P=0.002),类似地,IPSS评分越高其SPAG6基因启动子去甲基化率越高(P=0.016);然而,其与性别、骨髓原始细胞比例间未发现明显相关性(P>0.05,表 3)。

3 讨论

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组具有高异质性的恶性克隆性血液疾病,发病机制尚不完全清楚,其异常克隆过程被认为是起源于单个转化的多能造血干/祖细胞,多种遗传学异常及相应基因改变可能在MDS的发生、发展中起作用,涉及细胞遗传学、分子遗传学、表观遗传学、骨髓微环境及免疫调节紊乱等多种复杂机制的共同作用[13-15]。SPAG6作为肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigens,CTA)家族成员,具有肿瘤早期诊断的前景,并可能成为肿瘤免疫治疗的潜在靶标,被发现在多种血液系统肿瘤及肺癌、乳腺癌、胃癌等实体癌组织中过度表达,而在除睾丸外的正常组织则基本不表达,提示了SPAG6与肿瘤形成的相关性[8],有研究表明SPAG6可能具有促癌效应并可作为急性髓系白血病(AML)微小残留病灶(MRD)监测的新指标[16-17]。本课题组前期实验中表明,SPAG6在SKM-1细胞株中高表达,并且可能通过FADD、TRAIL以及PTEN介导的PI3K/AKT途径抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,然而SPAG6在MDS患者中的表达水平,与疾病进展、分层预后的关系,其在肿瘤细胞中差异性表达的可能调控机制,以及SPAG6基因启动子甲基化状态与MDS诊断分层及预后相关性分析等国内外罕见报道。异常DNA甲基化, 包括全基因组的低甲基化状态以及部分细胞调节基因高甲基化,这些恶性肿瘤中常见的表观遗传改变,导致了一些甲基化沉默基因的重新表达及某些抑癌基因的失活,这些都可能与MDS发病相关。

本研究显示SPAG6在MDS患者中呈高表达,基因启动子异常低甲基化状态,并且与疾病进展及不良预后相关。SPAG6可能作为致癌基因参与MDS的发生、发展,在MDS疾病进程中起重要作用,同时提示SPAG6在MDS患者中的差异性表达可能受表观遗传调控影响,SPAG6基因启动子甲基化状态可能对MDS患者预后分层有提示作用,为继续深入对MDS发病机制的研究和不断完善MDS的诊断及预后评估系统提供了有价值的资料和思路。表观遗传学改变指DNA核苷酸序列不发生改变前提下产生的可遗传性的基因表达的变化,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNAs调控等类型[18]。去甲基化试剂(HMA)治疗是针对MDS表观遗传治疗方案的重大突破,然而对HMA治疗有反应的患者只有40%~50%,有完全反应的更低仅为10%~20%,在临床治疗中大多数患者会逐渐出现反应丧失和疾病进展,最终在2年内复发,预后不良且选择有限[19-21]。生物烷化剂作为最早问世的细胞毒类药物在包括恶性淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的多种恶性肿瘤中有广泛应用[22],其中联合苯达莫司汀的化疗方案对AML/MDS患者可能有积极作用,但目前也无法证明能在细胞毒性可接受的剂量范围内使CR率大于40%[23]。并且HMA引起非特异性全基因组去甲基化,可能导致无法预测的副反应,而这些对MDS预后以及对于HMA治疗敏感性的影响等目前缺乏相关研究。本课题组前期在细胞实验中发现MDS与AML细胞株中DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)和DNMT3a均存在过度表达,结合本次实验结果提示SPAG6基因启动子的甲基化可能是非DNMT依赖性的,有其他途径参与其中。因此在后续实验中,我们将继续扩大样本量,进一步就组蛋白乙酰化对SPAG6基因转录调控的影响,SPAG6相关表观遗传改变对MDS患者化疗敏感性的影响及其机制等进行深入研究。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201904215
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陈亚, 蒋梅, 罗小华, 王利, 刘林.
CHEN Ya, JIANG Mei, LUO Xiaohua, WANG Li, LIU Lin.
SPAG6在骨髓增生异常综合征患者中的表达及其基因启动子甲基化状态
Expression level of sperm-associated antigen 6 and its gene promoter methylation status in myelodysplastic syndrome patients
第三军医大学学报, 2019, 41(18): 1776-1781
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(18): 1776-1781
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201904215

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收稿: 2019-04-29
修回: 2019-07-03

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