尖锐湿疣是由于人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染造成的患者肛门和生殖器增生为主要表现的性传播疾病[1]，疾病以中青年为主，疾病潜伏期平均为3个月[2]。人体感染HPV后的免疫平衡机制能避免过度的T细胞免疫反应导致的严重炎症和组织破坏。而调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)在下调免疫反应中充当了重要角色。在病毒感染中，Tregs的参与可能维持了机体对病毒的免疫耐受，从而导致了病毒感染的持续状态。外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBLC)的转录因子叉头蛋白(forkheadbox protein 3, FOXP3)是调节性T细胞中的重要标志性分子，FOXP3作为转录调控因子，可直接作用于调节性T细胞活性，进而达到调节患者免疫功能的作用。有研究报道[3]，FOXP3的基因突变可引发患者的严重自身免疫性疾病。而HPV感染导致的尖锐湿疣很可能存在Tregs异常。同时，外周血中的树突状细胞(DC)中的干扰素调节因子(interferon regulation factor, IRF-7)通过诱导患者的干扰素(TNF-α)分泌[4]，在胸腺细胞的分化中起着决定性作用，Toll样受体9(TLR9)是巨噬细胞识别CpGDNA的模式识别受体[5]，可通过激活吞噬细胞系统信号转导，活化患者的炎性反应，对于患者的疾病进展具有一定的预测作用。本研究对尖锐湿疣患者PBLC的Foxp3与DC的TLR9、IRF-7水平变化的特征分析，为研究尖锐湿疣疾病的发生、进展和复发机制提供参考。
1 资料与方法 1.1 基本资料选取2017年2月至2018年2月期间的120例尖锐湿疣患者为疾病组，其中男性69例，女性51例，年龄54-82(30.01±5.42)岁，体质量指数为(24.12±2.33)kg/m2，病程(3.52±1.33)个月，疣体数目为(6.25±1.33)个，其中初发尖锐湿疣患者59例，既往经过对患者的治疗3个月后，在患者的原发皮损或者邻近部位出现新的疣体，则为复发。复发尖锐湿疣患者61例，复发次数为(2.31±0.85)次，另选取同期健康体检患者120例作为对照组(健康组)，其中男性72例，女性48例，年龄52~81(30.45±6.01)岁，体质量指数为(24.55±2.98)kg/m2。两组受试者的性别、年龄、体质量指数之间的差异无统计学意义(P>0.05)，详见表 1。
| 组别 | TLR9(%) | IRF-7(%) | |||||||
| DC培养3 d | DC培养5 d | DC培养7 d | DC成熟1 d | DC培养3 d | DC培养5 d | DC培养7 d | DC成熟1 d | ||
| 健康组(n=120) | 2.35±0.23 | 2.72±1.27 | 10.68±1.33 | 20.13±3.63 | 3.14±1.13 | 4.77±1.24 | 20.04±4.24 | 31.77±2.26 | |
| 疾病组(n=120) | 4.69±2.37 | 4.85±1.03 | 14.67±0.22 | 26.44±3.68 | 6.39±3.62 | 7.27±2.94 | 24.88±4.17 | 42.03±2.27 | |
| 初发组(n=59) | 3.39±1.09 | 3.89±0.36 | 12.36±1.52 | 23.75±4.03 | 5.36±1.29 | 6.03±2.22 | 22.27±2.31 | 39.27±6.72 | |
| 复发组(n=61) | 4.87±1.13 | 4.90±0.35 | 15.39±2.33 | 27.73±4.12 | 8.22±2.26 | 1.02±0.37 | 29.77±3.27 | 51.27±5.73 | |
| F值 | 11.341 | 12.089 | 9.221 | 6.77 | 13.098 | 12.098 | 11.09 | 8.277 | |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | |
| LSD-t (初发/复发) | 29.342 | 11.09 | 8.999 | 14.093 | 11.213 | 12.34 | 11.009 | 9.881 | |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | |
| LSD-t (初发/对照) | 19.368 | 12.008 | 11.903 | 10.09 | 8.741 | 12.078 | 11.003 | 12.007 | |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | |
| LSD-t (复发/对照) | 46.392 | 51.023 | 12.098 | 11.23 | 6.235 | 16.87 | 12.065 | 15.06 | |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | |
纳入标准：①符合尖锐湿疣诊断标准[6]；②患者均签署知情同意书。排除标准：①合并HIV感染患者；②合并心、脑、肾、肝以及血液疾病患者；③合并结核以及肿瘤疾病患者；④一年内使用过免疫制剂患者；⑤月经期、哺乳期以及妊娠期妇女。
1.2 研究方法 1.2.1 两组患者DC的TLR9、IRF-7水平对比分别对两组患者空腹抽血4 mL，3 500 r/min，离心15 min。用羟乙基淀粉(HES)分离各组的外周血单个核细胞(PBMC), 通过重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养树突状细胞(DC), 在流式细胞仪上用特异性单克隆抗体检测不同成熟阶段的DC的TLRq及IRF-7表达, 用流式细胞荧光分选技术进行分析，并比较各组差异，此外分析树突状细胞TLR9及IRF-7表达水平与尖锐湿疣不同病程的相关性。
1.2.2 两组患者PBLC的Foxp3水平对比实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA1和RORγt视董酸相关孤儿受体rt(retinoid-related orphan, mRNA)的表达水平；流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的表达及CD4+、CD8+T淋巴细胞计数和比例，比较各组间的差异。
1.2.3 相关性分析两组患者的患者PBLC的Foxp3与DC的TLR9、IRF-7水平的相关性。
1.3 统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以 ±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。相关分析使用Spearman秩相关，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 两组DC的TLR9、IRF-7水平对比两组DC的TLR9、IRF-7水平随着患者DC的成熟情况的升高，其阳性表达水平显著升高，且疾病组患者DC的TLR9、IRF-7水平显著高于健康组，复发组患者DC的TLR9、IRF-7水平显著高于初发组，差异存在统计学意义(P < 0.05)，详见表 1。
2.2 两组的PBLC的Foxp3水平对比疾病组PBLC的Foxp3 mRNA、PD-1、PD-L1、CD8+水平高于健康组，疾病组PBLC的RORγt mRNA、CD4+水平低于健康组，且疾病组中，复发组患者的Foxp3 mRNA、PD-1、PD-L1、CD8+水平高于初发组，RORγt mRNA、CD4+水平低于健康组，详见表 2。
| 组别 | Foxp3 mRNA | RORγt mRNA | PD-1 | PD-L1 | CD4+ | CD8+ |
| 健康组(n=120) | 1.27±0.24 | 0.84±0.24 | 7.77±2.26 | 3.03±1.22 | 871.27±110.31 | 539.27±96.72 |
| 疾病组(n=120) | 4.27±1.94 | 0.38±0.17 | 9.03±2.27 | 4.02±1.37 | 759.77±99.27 | 631.27±95.73 |
| 初发组(n=59) | 3.14±1.11 | 0.34±0.19 | 8.19±2.57 | 3.74±1.98 | 726.54±94.96 | 601.13±94.16 |
| 复发组(n=61) | 7.95±1.45 | 0.41±0.56 | 11.54±2.98 | 5.24±1.73 | 795.99±94.67 | 724.15±94.56 |
| F | 7.402 | 13.146 | 12.957 | 6.736 | 12.514 | 7.402 |
| P | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 |
| LSD-t (初发/复发) | 7.849 | 12.465 | 5.272 | 7.792 | 9.964 | 11.893 |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 |
| LSD-t (初发/对照) | 12.564 | 17.295 | 23.707 | 11.217 | 12.904 | 10.345 |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 |
| LSD-t (复发/对照) | 10.537 | 10.004 | 12.362 | 9.892 | 7.957 | 8.201 |
| P值 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.05 |
2.3 PBLC的Foxp3与DC的TLR9、IRF-7相关性分析
患者的PBLC的Foxp3与DC的TLR9、IRF-7呈现显著相关性。详见表 3。
| Foxp3 | TLR9 | IRF-7 | ||
| Foxp3 | r值 | - | 1.231 | 1.203 |
| P值 | - | 0.000 | 0.000 | |
| TLR9 | r值 | 1.231 | - | 1.298 |
| P值 | 0.000 | - | 0.000 | |
| IRF-7 | r值 | 1.203 | 1.298 | - |
| P值 | 0.000 | 0.000 | - |
3 讨论
尖锐湿疣是由人乳头状病毒感染引起的性传播性疾病，该病持续感染的关键环节是由于患者的免疫逃逸造成的病毒清除障碍[7]，进而造成患者的反复感染。研究显示，患者的免疫逃逸机制与患者T细胞为主的细胞免疫功能障碍有关。机体的T细胞活化不仅需要患者的组织相容性复合体的抗原肽呈递信号，同时也需要细胞表面刺激性分子的协同传递作用[8]。而在信号转导过程中，PD-1主要在CD4+、CD8+等T细胞表面表达，对T细胞的调控以及耐受性具有一定的作用。而PD-L1主要在患者的T细胞和B细胞上表达[9]，同时在机体免疫耐受性的调节中起关键作用。当机体的PD-1、PD-L1信号通路形成后，对于炎性因子分泌以及疫功能的调控均具有一定的抑制性作用[10]。
本研究显示，疾病组PBLC的Foxp3 mRNA、PD-1、PD-L1、CD8+水平高于健康组，疾病组PBLC的RORγt mRNA、CD4+水平低于健康组，且疾病组中复发患者的Foxp3 mRNA、PD-1、PD-L1、CD8+水平高于初发患者，RORγt mRNA、CD4+水平低于健康组，提示T细胞表面的PD-L1表达水平与患者的免疫细胞水平呈负相关[11]，同时PD-L1对于患者的CD8+淋巴细胞的凋亡以及细胞因子的分泌均具有一定的抑制作用，提升患者的免疫功能[12]。而PD-1、PD-L1信号通路也被证实参与患者T淋巴细胞的免疫调节。本研究发现，尖锐湿疣患者的CD4+水平低于健康组，提示，虽然在疾病的早期，患者的CD4+水平已经得到了一定的抑制，随着患者的疾病进展，CD4+抑制水平呈现显著升高趋势，患者的病毒清除功能受到抑制，造成疾病反复复发[13]。综上所述，在尖锐湿疣患者中，通过对患者外周血T淋巴细胞的PD-1、PD-L1信号的不断上调，患者T淋巴细胞增殖显著抑制，患者人乳头状病毒的清除受到抑制，免疫功能失调，导致了尖锐湿疣患者的反复发作。
在免疫系统中，患者DC细胞不断成熟，TLR9、IRF-7水平显著升高。本研究中，两组DC的TLR9、IRF-7水平随着患者DC的不断成熟，其阳性表达水平显著升高，且疾病组患者DC的TLR9、IRF-7水平显著高于健康组，复发组患者DC的TLR9、IRF-7水平显著高于初发组。有学者认为，随着患者DC细胞的不断成熟，TLR9、IRF-7阳性表达水平显著升高，但是随着患者的疾病进展，患者通过对DC的不同信号途径进行IFN的诱导作用[14]，以启动患者的信号级联反应，诱导患者的局部炎性因子，上调患者的转导蛋白和应答蛋白水平，从而促进患者的免疫应答，调动淋巴细胞的全身性作用，进行病毒清除作用[15]。分析认为，随着患者的疾病进展，患者的TLR9、IRF-7水平显著上升。
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