缺血性心脏病是全球死亡的主要原因，其治疗重点是在适当的情况下进行血运重建[1]。然而，恢复冠状动脉血流后引起的缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IR)会加重心肌细胞的死亡。目前认为，缺血再灌注损伤的实质是局部炎症性先天免疫的激活[2]，尤其是巨噬细胞的功能状态起着重要的驱动作用[3]。促进心脏巨噬细胞M2型转化，可以减轻心肌缺血再灌注损伤，而上调巨噬细胞吞噬功能是诱导其M2极化的重要方式[4-5]。
GPR37能够显著增加巨噬细胞吞噬功能，并诱导其M2样细胞因子分泌的增加，而细胞内钙离子增加在该过程中有着重要的作用[6]。钙离子紊乱是引起内质网应激的重要原因；同时，内质网应激在调控巨噬细胞M2型极化中有着重要的意义[7]。内质网应激是指体内过强的非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)引起的内质网功能紊乱状态[8]。内质网应激能够促进巨噬细胞内JNK的活化和PPAR-γ的表达，从而诱导其M2型极化[9]。上述研究结果提示，GPR37介导的巨噬细胞吞噬功能增强有可能经内质网应激途径调控心脏巨噬细胞M2极化，从而促进抗炎因子分泌，减轻心肌缺血再灌注损伤。
保护素(protectin D1, PD1)是一种经生物合成的二十二碳六烯酸来源的欧米伽-3脂肪酸，早期主要用于减轻神经系统疾病引起的疼痛[10]。近年来，PD1被发现对多种细胞内GPR37的表达起调控作用[6]。本实验旨在检测PD1的GPR37调控效应对心脏巨噬细胞吞噬功能、M2型极化以及心脏缺血再灌注损伤中的作用，并对可能的机制进行阐述。
1 材料与方法 1.1 主要材料PD1购于Cayman Chemical公司(美国)；DMEM培养基、ELISA试剂盒购于Abcam公司(美国)；H9c2(2-1)大鼠心肌细胞购自中国科学院细胞库；Liberase TH购于Roche公司(美国)；DNase1购于Sigma公司(美国)；RT-PCR引物由Sangon Biotech公司(上海)合成；GPR37、ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ一抗抗体购于Abcam公司(美国)；红细胞裂解液、GAPDH一抗抗体购于BOSTER Biological Technology公司(上海)。
1.2 方法 1.2.1 实验动物与分组建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，记录Ⅱ导联心电图，在胸左侧第3、4肋间处打开胸腔，暴露心脏，用细小弯针在冠状动脉左前降支下用丝线结扎，以缝线下方心肌色泽变浅、苍白，心电图出现ST段弓背向上明显抬高，为结扎成功。雄性SD大鼠(180~220 g，6~8周，60只)均由重庆医科大学实验动物中心提供，按随机数字表法分为4组，假手术组(n=15)：术前未进行特殊处理，大鼠进行开胸手术后未结扎冠脉左前降支；IR组：术前3 d经腹腔注射给予相等剂量生理盐水，建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型；IR+PD1组：术前3 d每天经腹腔注射给予PD1 100 nmol/L，建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型；IR+PD1+CB组：术前3 d每天经腹腔注射给予PD1 100 nmol/L和细胞松弛素B(cytochalasin B，CB)150 nmol/L，建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型。于再灌注后6 h、24 h、48 h、14 d，各组大鼠随机选择5只分离心脏巨噬细胞，并提取细胞蛋白，收集剩余大鼠心脏和血液标本用于后续实验。
1.2.2 心脏巨噬细胞分离、培养以及功能鉴定参考CARLSON等[11]提出的方法，分离心脏巨噬细胞。具体步骤如下：心脏组织用Hanks平衡盐溶液清洗。剪碎后，以37 ℃的含Liberase TH(5 mg/mL)和DNase1(2 000 U)的消化平衡液消化心脏组织5 min。过滤并以完全培养基终止消化。重复5次后，以红细胞裂解液裂解红细胞并离心(800 r/min)。以含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞团。运用抗CD14的免疫磁珠法筛选心脏巨噬细胞。
将分离后的心脏巨噬细胞接种在含10% FBS的DMEM培养基中，并于37 ℃、5% CO2细胞孵箱中培养。运用F4/80标记的免疫荧光法鉴定心脏巨噬细胞来源；运用吞墨实验检测心脏巨噬细胞吞噬功能。
1.2.3 凋亡心肌细胞制备、细胞共培养参照SUN等[12]的方法诱导早期凋亡细胞，具体方法如下：将H9c2(2-1)大鼠心肌细胞接种在含10% FBS的DMEM培养基中，并于37 ℃、5% CO2细胞孵箱中培养。经40 W的紫外线B(320 nm)间隔40 cm照射10 min后，继续培养3 h。Annexin V/PI流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。心脏巨噬细胞(培养后24 h)、凋亡心肌细胞按照10 :1的比例在上述培养条件下共培养。于共培养后24 h，分别收集上清液中悬浮的剩余凋亡心肌细胞、贴壁心脏巨噬细胞，培养基上清液用于后续实验。
1.2.4 组织病理学检查心脏组织经10%多聚甲醛固定、石蜡包埋后制作成石蜡切片。以伊红和苏木精对石蜡切片进行染色后，利用中性树胶封片。运用倒置显微镜观察各组心脏标本病理改变。
1.2.5 心肌酶谱检查采用全自动生化分析仪(Beckman CX7, Beckman Coulter, CA, USA)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)等心肌酶谱功能指标。
1.2.6 天狼星红染色心脏组织经10%多聚甲醛固定、常规脱水包埋，并制成石蜡切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡，并以不同浓度的乙醇洗脱后，分别用天狼星红染色液和苏木精染色液滴染，常规脱水透明后，以中性树胶封闭石蜡切片。利用倒置显微镜观察各组大鼠心脏标本染色情况。
1.2.7 Masson染色收集各组大鼠心脏标本，按上述方法制成石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡至水，经苏木精染色液染色5 min、酸性乙醇分化液分化10 s、Masson返蓝液返蓝3 min、立春红染色液染色5 min、磷钼酸溶液洗2 min、苯胺蓝染色液染色2 min，常规脱水透明后，以中性树胶封片。利用倒置显微镜观察各组大鼠心脏标本染色情况。
1.2.8 ELISA将抗体血清(100 μL/孔)加入到ELISA孔板中，于37 ℃下反应1 h。将样本(100 μL/孔)加入到ELISA孔板中，于37 ℃下反应1 h。将抗IgG抗体加入到ELISA孔板中，于37 ℃下反应1 h。反应结束后，将工作液加入到ELISA孔板中，于37 ℃下反应30 min。将染色液加入ELISA孔板中，运用ELISA检测仪检测各孔样本中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β水平。
1.2.9 RT-PCR在95 ℃下进行预变性5 min，在94 ℃下进行变性1 min，在58 ℃下退火69 s，72 ℃下延长1 min，重复40个循环。溶解曲线均呈单峰曲线。以β-actin作为内参进行标准化。具体引物序列见表 1。
| 细胞因子 | 引物序列 |
| IL-1β | 前引物: 5′-TGCTGCAGACACACTGCATCTTGGC-3′ |
| 后引物: 5′-CGGTGACCATGAGCTCATTGAATGC-3′ | |
| TNF-α | 前引物: 5′-GAGAGGCCGAGATTCACAGAG-3′ |
| 后引物: 5′-CGGAACAAATCCAGAAGACCAG-3′ | |
| IFN-γ | 前引物: 5′-TGCTACAGCTCGAGACTTCAAGCTC-3′, |
| 后引物: 5′-CGGGAAGGCGTACCATGCTTTGACA-3′ | |
| IL-6 | 前引物: 5′-GCGCCCAGCCTTCCTTAC-3′ |
| 后引物: 5′-GCCCCGGCCTTCCAAATAAATAC-3′ | |
| IL-10 | 前引物: 5′-CACACTTGCTGCAGAGCATCTTGGC-3′ |
| 后引物: 5′-TGAGCTCGGTGACCACATTGAATGC-3′ | |
| β-actin | 前引物: 5′-AGATTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′ |
| 后引物: 5′-CATCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3′ |
1.2.10 免疫荧光
心脏巨噬细胞以4%多聚甲醛固定、Triton X-100通透、1% BSA封闭后，于4 ℃过夜孵育在一抗抗体溶液。PBST清洗后，于室温下孵育在荧光二抗溶液1 h。PBST清洗后，室温下DAPI孵育10 min。以抗荧光淬灭剂封片，运用荧光显微镜观察心脏巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬情况。
1.2.11 流式细胞术心脏巨噬细胞在4 ℃下，300×g离心5 min。在室温下，以BSA封闭巨噬细胞表面受体10 min。避光孵育于抗CD86、Arg1、Annexin V抗体溶液中2 h。经染色缓冲液清洗、重悬后，运用流式细胞仪检测心脏巨噬细胞细胞极性。同时，也用流式细胞术检测剩余凋亡细胞数量。
1.2.12 Western blot各组蛋白样本经电泳、转膜、封闭后，在4 ℃下过夜孵育于兔抗大鼠一抗溶液。在室温下，孵育于二抗溶液1 h。运用凝胶成像系统对信号进行化学发光检测。以β-actin进行标准化。
1.3 统计学分析所有结果均采用SPSS 18.0统计软件进行分析。符合正态分布的数据均以x±s表示。组间差异采用t检验。不符合正态分布的数据以中位数表示，差异采用秩和检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 心脏巨噬细胞来源、吞噬功能、凋亡细胞鉴定如图 1A~C所示，分离后的心脏巨噬细胞呈小圆状、均匀漂浮于DMEM培养基中；培养后24 h，心脏巨噬细胞贴壁状态良好、呈典型条索状；培养后48 h，心脏巨噬细胞生长状态、细胞形态较好。F4/80免疫荧光染色结果示(图 1D)，心脏巨噬细胞F4/80阳性率达到90%以上。吞墨实验结果(图 1E)示，心脏巨噬细胞内可见明显黑色墨水颗粒，表明心脏巨噬细胞吞噬功能良好。流式细胞术检测结果(图 1F)示，早期凋亡的心肌细胞数量，即Annexin V(+)的细胞数量>90%。
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| A~C：分别为分离后2、24、48 h心脏巨噬细胞；D：F4/80标记的免疫荧光鉴定心脏巨噬细胞来源；E：吞墨实验鉴定心脏巨噬细胞吞噬功能；F：Annexin V/PI双标的流式细胞术检测心肌细胞凋亡 图 1 心脏巨噬细胞来源、吞噬功能、凋亡细胞鉴定 |
2.2 HE及全自动生化仪检测心肌酶谱标志物和心肌缺血再灌注损伤
病理组织学检查结果显示(图 2)，在假手术组，心脏组织未见显著病理改变；在IR组，心肌纤维明显肿胀坏死，血管收缩，心肌细胞大量萎缩，间质见大量炎症细胞浸润；在IR+PD1组中，上述病理改变显著下降；而在IR+PD1+CB组，上述病理改变显著加重。血清心肌酶谱标志物检测结果显示(图 3), IR组血清AST、CK、LDH水平显著高于假手术组(P < 0.05)；IR+PD1组中，血清AST水平较IR组显著下降(P < 0.05)；IR+PD1+CB组中，血清AST、CK、LDH水平较IR+PD1组显著升高(P < 0.05)。
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| A:假手术组；B：IR组；C：IR+PD1组；D：IR+PD1+CB组 图 2 各组大鼠心脏组织病理学变化(HE) |
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| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 图 3 各组大鼠血清AST、LDH、CK水平变化(n=10，x±s) |
2.3 天狼星红染色、Masson染色检测心肌缺血再灌注后心肌纤维化
天狼星红染色结果显示，在假手术组，心脏标本未见明显天狼星红染色阳性区域；IR组较假手术组显著增加；IR+PD1组较IR组显著下降；IR+PD1+CB组较IR+ PD1组显著增加。Masson染色结果显示，Masson染色阳性区域呈现与天狼星红染色一致的结果。见图 4。
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| 图 4 再灌注48 h各组大鼠心脏组织纤维化观察 |
2.4 ELISA、RT-PCR检测血清炎症因子表达
ELISA实验结果显示(表 2~4)血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平IR组显著高于假手术组(P < 0.05)；IR+PD1组显著低于IR组(P < 0.05)；IR+PD1+CB组显著高于IR+PD1组(P < 0.05)；IL-10、TGF-β水平结果呈现相反的趋势。RT-PCR实验结果显示(表 5~7)，在各组中，上述炎症因子mRNA水平呈现相同的趋势。
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 78.2±12.5 | 35.6±7.2 | 39.5±9.6 | 52.6±11.7 | 63.8±14.6 |
| IR组 | 194.5±36.7a | 154.7±31.6a | 112.3±23.4a | 19.6±4.2a | 26.3±5.3a |
| IR+PD1组 | 86.6±22.4b | 89.4±18.2b | 76.7±15.2b | 87.6±18.4b | 112.7±22.6b |
| IR+PD1+CB组 | 165.3±32.1c | 167.2±32.7c | 124.3±27.4c | 30.2±6.3c | 45.6±9.6c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 87.4±14.6 | 39.1±8.4 | 42.7±8.7 | 49.8±9.6 | 66.2±16.3 |
| IR组 | 274.3±50.3a | 227.1±46.1a | 202.6±40.9a | 22.3±5.6a | 32.1±6.7a |
| IR+PD1组 | 142.1±30.2b | 146.2±29.6b | 106.9±22.3b | 96.4±22.3b | 129.2±27.4b |
| IR+PD1+CB组 | 265.4±56.7c | 209.6±44.1c | 196.4±36.7c | 34.8±6.9c | 51.2±13.1c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 82.9±13.2 | 44.5±9.6 | 47.2±9.4 | 55.7±13.4 | 65.1±15.3 |
| IR组 | 329.6±61.3a | 324.5±66.8a | 267.4±57.1a | 18.7±4.1a | 36.2±7.5a |
| IR+PD1组 | 184.7±36.7b | 174.8±36.4b | 158.4±67.7b | 106.3±27.4b | 142.3±30.2b |
| IR+PD1+CB组 | 297.1±64.1c | 297.4±66.5c | 249.7±50.4c | 29.7±5.4c | 49.7±12.5c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 1.09±0.19 | 1.13±0.18 | 1.24±0.23 | 1.12±0.17 | 1.12±0.22 |
| IR组 | 3.27±0.55a | 3.96±1.36a | 5.23±1.65a | 0.29±0.08a | 0.32±0.09a |
| IR+PD1组 | 1.33±0.27b | 1.65±0.35b | 2.19±0.59b | 2.13±0.62b | 1.95±0.51b |
| IR+PD1+CB组 | 2.96±0.46c | 3.56±1.37c | 4.68±1.37c | 0.33±0.08c | 0.41±0.33c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 1.23±0.28 | 1.17±0.22 | 1.09±0.19 | 1.23±0.28 | 1.07±0.31 |
| IR组 | 6.05±0.96a | 4.19±1.41a | 4.99±1.44a | 0.25±0.17a | 0.27±0.08a |
| IR+PD1组 | 1.64±0.37b | 1.81±0.51b | 2.07±0.72b | 2.24±0.57b | 2.11±0.62b |
| IR+PD1+CB组 | 5.87±0.74c | 4.08±1.36c | 4.96±1.42c | 0.31±0.21c | 0.39±0.28c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 1.15±0.21 | 1.21±0.27 | 1.31±0.32 | 1.15±0.2 | 1.34±0.25 |
| IR组 | 4.63±0.82a | 4.33±1.47a | 6.02±1.92a | 0.31±0.13a | 0.31±0.11a |
| IR+PD1组 | 1.45±0.36b | 1.99±0.58b | 2.48±0.66b | 2.65±0.53b | 2.11±0.62b |
| IR+PD1+CB组 | 4.35±0.74c | 4.17±1.44c | 5.22±1.53c | 0.29±0.22c | 0.44±0.36c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
| 组别 | IL-1β | TNF-α | IL-6 | IL-10 | TGF-β |
| 假手术组 | 65.7±13.5 | 69.4±17.6 | 96.4±19.2 | 88.2±20.3 | 78.6±17.2 |
| IR组 | 226.3±43.8a | 301.9±63.2a | 341.7±72.4a | 49.6±14.2a | 34.5±9.5a |
| IR+PD1组 | 109.5±21.6b | 95.4±17.8b | 134.2±27.1b | 158.4±31.8b | 149.6±27.6b |
| IR+PD1+CB组 | 193.6±38.8c | 284.7±57.6c | 312.5±62.3c | 47.6±11.2c | 45.1±11.4c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | |||||
2.5 免疫荧光、流式细胞术检测心脏巨噬细胞吞噬功能
免疫荧光检测结果显示(图 5A)，IR组中Annexin V(+)心脏巨噬细胞数量显著低于假手术组；IR+PD1组显著高于假手术组；IR+PD1+CB组显著低于假手术组。流式细胞术检测结果显示(图 5B)，IR组中剩余早期凋亡细胞数量显著高于假手术组；IR+PD1组显著低于IR组；IR+PD1+CB组显著高于IR+PD1组。
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| A：免疫荧光检测各组大鼠Annexin V(+)心脏巨噬细胞；B：流式细胞术检测各组剩余凋亡细胞 图 5 免疫荧光、流式细胞术检测各组大鼠心脏巨噬细胞吞噬功能 |
2.6 流式细胞术、ELISA检测心脏巨噬细胞M2型极化和抑炎因子释放
流式细胞术检测结果显示(图 6), IR组中Arg1(+)、CD86(-)的心脏巨噬细胞数量显著低于假手术组；IR+PD1组显著高于IR组；IR+PD1+CB组显著低于IR+PD1组。ELISA检测结果显示(表 8)心脏巨噬细胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平结果：IR组显著高于假手术组(P < 0.05)；IR+PD1组显著低于IR组(P < 0.05)；IR+ PD1+CB组显著高于IR+PD1组(P < 0.05)；IL-10、TGF-β水平结果呈现相反的趋势。
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| 图 6 流式细胞术检测各组大鼠心脏巨噬细胞M2型极化 |
2.7 Western blot检测JNK/PPAR-γ信号通路蛋白表达
Western blot检测结果显示(图 7、表 9)，IR组心脏巨噬细胞内GPR37、ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ显著低于假手术组(P < 0.05)；在IR+PD1组中，上述各蛋白表达显著高于IR组(P < 0.05)；在IR+PD1+CB组中，GPR37未见明显改变，但ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ显著低于IR+PD1组(P < 0.05)。
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| 1：假手术组；2：IR组；3：IR+PD1组；4：IR+PD1+CB组 图 7 Western blot检测各组大鼠心脏巨噬细胞内GPR37、ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ表达 |
| 组别 | GPR37 | IRE1α | ATF6 | PERK | p-JNK | PPAR-γ |
| 假手术组 | 1.01±0.14 | 1.06±0.21 | 1.13±0.24 | 1.16±0.21 | 1.06±0.16 | 1.04±0.21 |
| IR组 | 0.79±0.08a | 0.84±0.12a | 0.88±0.19a | 0.85±0.12a | 0.42±0.07a | 0.58±0.12a |
| IR+PD1组 | 2.14±0.31b | 2.67±0.44b | 1.97±0.37b | 2.27±0.67b | 1.95±0.39b | 1.87±0.67b |
| IR+PD1+CB组 | 1.89±0.11 | 0.78±0.09c | 0.72±0.12c | 0.74±0.11c | 0.51±0.08c | 0.62±0.13c |
| a：P < 0.05，与假手术组比较；b：P < 0.05，与IR组比较；c：P < 0.05，与IR+PD1组比较 | ||||||
3 讨论
急性心肌梗死是全球发病率和死亡率较高的疾病之一[13]，尽快恢复血供是治疗急性心肌梗死的关键[14]，但恢复血供后可导致缺血再灌注损伤。心脏巨噬细胞是一类极具可塑性的细胞，M1型和M2型是这一连续状态的两个极端表型[15]，促进心脏巨噬细胞M2型极化被认为在心脏缺血再灌注损伤中有着重要的保护性意义[16-17]。巨噬细胞吞噬凋亡细胞后可诱导其细胞极性重塑：①Notch信号通路的活化能够抑制巨噬细胞内信号调节蛋白α(signal regulatory protein α，SIRP)的表达，从而抑制巨噬细胞吞噬功能，促进其向M1型极化[18]；②肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)内LC3相关性吞噬功能的损伤会引起促炎症因子分泌增高，与M1型巨噬细胞相似[19]；③巨噬细胞吞噬凋亡细胞后，其细胞内芳基碳氢化合物受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)被快速激活，引起巨噬细胞抑炎症因子分泌增加，与M2型细胞相似[20]。上述研究结果提示，促进心脏巨噬细胞吞噬功能，可能是诱导其M2型极化，减轻心脏缺血再灌注损伤的关键。
本实验从体内、体外研究了PD1促进心脏巨噬细胞吞噬功能，诱导心脏巨噬细胞M2型转化的机制。实验结果显示，在体内，经PD1处理后，心肌损伤程度，心肌酶谱标志物水平以及血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的表达程度均显著降低，血清中IL-10、TGF-β的表达程度显著增高；而在运用CB阻断心脏巨噬细胞吞噬功能后，上述指标显著好转。在体外，经PD1处理后，心脏巨噬细胞的吞噬功能显著增强，Arg1(+)、CD86(-)的心脏巨噬细胞数量及血清中IL-10、TGF-β表达水平显著升高，血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的表达程度显著降低；而经CB处理后，上述指标均好转。研究结果表明，PD1能够有效地促进心脏巨噬细胞M2型极化，增加抗炎因子分泌，减轻心脏缺血再灌注损伤程度，而这种保护性作用与PD1促进心脏巨噬细胞吞噬功能有着密切关系。
值得注意的是，PD1能够引起巨噬细胞内钙离子浓度增加[6]，而钙离子紊乱被认为是引起内质网应激的重要原因[21]。大量研究发现，内质网应激在巨噬细胞细胞极性重塑方面有着重要的意义[22]，上调JNK/PPAR-γ信号通路是其引起巨噬细胞M2型极化的重要机制[9]。我们推测，巨噬细胞吞噬凋亡细胞诱导其细胞极性改变的重要途径可能是激活了内质网应激，并经上调JNK/PPAR-γ信号通路活性，促进了巨噬细胞M2型极化。因此，我们运用CB阻断了巨噬细胞吞噬功能，即阻断了PD1引起的GPR37介导的巨噬细胞吞噬功能增加，实验结果表明，经PD1处理后，心脏巨噬细胞内GPR37、ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ显著增高；在运用CB阻断巨噬细胞吞噬功能后，心脏巨噬细胞内GPR37的表达未见变化，但ATF6、PERK、IRE1α、p-JNK、PPAR-γ显著降低。实验结果初步证明了PD1经上调GPR37表达促进了心脏巨噬细胞吞噬功能；心脏巨噬细胞在吞噬凋亡细胞后，激活了内质网应激，上调了JNK/PPAR-γ信号通路活性，促进了心脏巨噬细胞M2型极化。
本实验对于PD1调控心脏巨噬细胞吞噬功能、促进其M2型极化、减轻心脏缺血再灌注损伤的研究主要集中在体外实验，在后续实验中，我们会进一步完善体内实验，以便更充分地阐述PD1在减轻心脏缺血再灌注损伤中的作用。
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