疏水性毒物和药物大多数是低水溶性[1]。使用适当的载体溶剂来辅助溶解难溶或低水溶解性试剂，从而提高生物利用率保证适当的暴露浓度[2]。二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)是一种常用的有机溶剂，被称作“万能溶剂”。根据2002/2012年OECD(Organization for Economic Co-operation and Develop-ment)的建议，DMSO用于溶解低水溶性物质的浓度不应超过100 mg/L(体积比0.01%)。实际DMSO的使用浓度远远大于这一数值。有研究指出，DMSO耐受浓度最高可达10%[3]。但最近一些报道表明低剂量的DMSO(0.1%~2.0%)可诱导小鼠淋巴细胞、大鼠视网膜细胞、体外耳蜗细胞、神经细胞系等多种体外细胞凋亡[4-7]。向BALB/c小鼠腹腔注射DMSO，观察到小鼠各器官的淋巴细胞凋亡情况不同，各亚型淋巴细胞的DMSO耐受剂量不同[4]，使用载体溶剂时应审查对特定细胞的阈值。本实验在利用斑马鱼进行神经退行性疾病研究过程中需要DMSO助溶配制试剂，目前关于DMSO在斑马鱼体内的神经毒性报道很少，使用时参考体外神经细胞系的使用浓度(≤0.5%)，发现DMSO浓度为0.3%时对斑马鱼间脑细胞增殖有明显影响，而0.1%时没有影响，这与文献推荐的神经细胞系的安全使用浓度不一致。为避免其神经毒性对实验的干扰，建立DMSO在斑马鱼中枢神经系统的阈值剂量尤为重要。在本研究中我们观察不同浓度梯度的DMSO对斑马鱼胚胎及DA神经元发育的影响，包括对斑马鱼形态特征、运动及间脑细胞增殖、凋亡的影响，从而确定DMSO在斑马鱼中枢神经系统研究中的使用阈值，为以后在斑马鱼实验中使用DMSO提供参考浓度。
1 材料与方法 1.1 动物模型制备本实验使用Tg(Vmat2:GFP)转基因斑马鱼(中科院上海神经科学研究所杜九林教授馈赠)，北京爱森公司净水系统，在室温28.5~29.5 ℃，pH值7.2~7.6，盐度0.03%~0.04%，光照黑夜(14 h :10 h)条件下喂养。于前一晚20:00选取性成熟斑马鱼1 :1雌雄配对，次日8:00给予光照后，取出挡板，斑马鱼交配自然产卵，受精后1 h(hourspost fertilization，hpf)内收集胚胎，剔除死胚。同亲代斑马鱼单次产卵200~300枚，简单随机化分为10组：①空白对照组；②0.1%DMSO组；③0.3%DMSO组；④0.5%DMSO组；⑤0.8% DMSO组；⑥1.0%DMSO组；⑦1.5%DMSO组；⑧2.0% DMSO组；⑨2.5%DMSO组；⑩3.0%DMSO组。每组30枚胚胎，6 hpf后加DMSO，28.5 ℃培养箱中培养，每隔24 h观察胚胎并拍照记录。
1.2 主要试剂及仪器试剂：DMSO(Sigma-Aldrich)，MPTP(美国Sigma)，抗体PH3(GeneTex，gtx79055)，抗体TH(Millipore，AB152)，In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red (Roche，12156792910)。仪器：体视荧光显微镜(Olymapus SZX16)，激光共聚焦显微镜(Olympus FV-1000)。
1.3 方法每个实验组3个复孔，进行3次独立的实验。按以下浓度梯度将DMSO原液稀释到培养基中：0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%(体积比)。6 hpf时将斑马鱼胚胎移到6孔板中，每孔30个胚胎。在不同的浓度梯度下培养胚胎，生化培养箱里(28.0±0.5) ℃条件下孵育72 h。
1.3.1 斑马鱼胚胎发育观察以受精卵凝固、缺乏体节、尾芽没有脱离卵黄囊、缺乏心跳等4个致死条件的任何1个发生为胚胎死亡标准。在24、48、72 hpf使用体视荧光显微镜，分别记录胚胎死亡数。72 hpf时，记录孵化数量；观察斑马鱼胚胎心包水肿、脊椎弯曲、色素沉着减少等，记录畸形数量。对于需要进行共聚焦拍照观察的胚胎，当发育到24 hpf时，加入0.003%(200 μmol/L)的1-苯基-2硫脲(PTU)，抑制黑色素生长。
1.3.2 斑马鱼的胚胎行为学观察对于斑马鱼胚胎发育至24 hpf，从黑暗条件下(28.0±0.5)℃饲养的胚胎中随机挑选出8个胚胎，整个过程使用顶置摄像机拍摄60 s，分析其尾部摆动次数，并统计。
1.3.3 整胚免疫组化4%PFA固定72 hpf胚胎24 h，1×PBS洗3次，4 ℃下PBTN固定1 h，anti-PH3 1 :100、anti-TH 1 :50稀释，4 ℃孵育过夜，PT洗5次，每次1 h，Goat anti-Rabbit二抗1 :600稀释，4 ℃孵育过夜。PT洗5次，每次1 h，共聚焦拍照观察。
1.3.4 TUNEL凋亡检测本实验利用In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red标记凋亡细胞，收集72 hpf斑马鱼胚胎，4%PFA固定过夜；PBST洗3次，每次5 min；10 μg/mL蛋白酶K处理9 min；PBST快洗2次，慢洗3次，每次5 min；加入新鲜配制的丙酮:无水乙醇(1 :2)放于-20 ℃，40 min。移除上清，PBST洗3次，每次5 min；4%PFA室温下后固定20 min，PBST洗3次，每次5 min；加入36 μL底物label solution 37 ℃避光孵育1 h，加入4 μL Enzyme solution 37 ℃避光孵育1.5 h；2×SSCT 37 ℃洗2次，室温洗1次，每次20 min；PBST洗3次，每次5 min，共聚焦拍照观察。
1.4 统计学分析采用Graphpad 5软件，数据以x±s表示，不同时间点各组的存活率使用双因素方差分析结合Turkey检验；多组间均数比较采用单因素方差分析结合Turkey检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 不同浓度DMSO对斑马鱼存活率、孵化率的影响重复实验取平均值，0~24 hpf，DMSO浓度≥2.5%时斑马鱼胚胎存活率明显下降；>24~48 hpf空白对照组胚胎基本可存活，但DMSO浓度≥2.5%时斑马鱼胚胎存活率下降；>48~72 hpf DMSO浓度为2.0%时斑马鱼胚胎存活率下降，3%DMSO浓度组胚胎全部死亡。使用双因素方差分析，与空白对照组比较，72 hpf时实验组浓度为2.5%时，斑马鱼胚胎死亡率明显增加(P < 0.01, n=30)。表明DMSO浓度≥2.5%会增加72 hpf内斑马鱼胚胎的死亡率。见表 1。
| 组别 | 0~24 hpf | >24~48 hpf | >48~72 hpf |
| 空白对照组 | 65.6±1.6 | 99.0±1.1 | 96.6±2.4 |
| 0.1%DMSO组 | 61.1±5.7 | 99.2±1.4 | 96.1±2.8 |
| 0.5%DMSO组 | 58.9±6.9 | 98.4±1.7 | 96.5±2.5 |
| 1.0%DMSO组 | 61.1±6.9 | 98.8±1.5 | 95.8±5.9 |
| 1.5%DMSO组 | 58.9±6.9 | 98.8±1.9 | 93.7±5.5 |
| 2.0%DMSO组 | 55.5±8.8 | 97.4±3.6 | 71.8±10.3b |
| 2.5%DMSO组 | 28.9±4.2a | 66.0±4.7a | 41.1±6.9a |
| 3.0%DMSO组 | 12.2±4.2a | 53.3±4.7a | 0a |
| a：P < 0.01，b：P < 0.05，与空白对照组比较 | |||
正常胚胎在>48~72 hpf完成孵化。72 hpf时，空白对照组斑马鱼胚胎孵化率(96.6±2.4)%；2.0%DMSO组斑马鱼孵化率(74.6±6.8)%，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05，n=30)，说明DMSO浓度≥2.0%会影响胚胎的孵化率，这可能与斑马鱼胚胎畸形、出膜动力降低有关。
2.2 不同浓度的DMSO对斑马鱼畸形的影响实验记录了斑马鱼胚胎发育至24、48、72 hpf时的发育情况；胚胎发育至24 hpf，3.0%DMSO浓度组及48、72 hpf时，2.0%浓度组均出现脊柱畸形。斑马鱼胚胎发育明显滞后：卵黄较大、吸收缓慢、头部伸直延迟。3.0%DMSO组出现明显心包水肿。72 hpf时，空白对照组畸形率为(1.85±2.62)%，1.5%DMSO组畸形率(6.00±1.12)%，与空白对照组比较差异没有统计学意义。2.0%DMSO组畸形率(48.70±4.34)%，与空白对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)，2.5%DMSO组畸形率达100%。说明当DMSO浓度达2.0%时斑马鱼胚胎畸形率升高。见图 1。
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| 红色箭头示：头部伸直延迟；黑色箭头示：脊柱弯曲；白色箭头示：卵黄囊较大；黄色箭头示：心包水肿 图 1 受精后不同时间各组斑马鱼胚胎发育形态学观察 |
2.3 不同浓度DMSO对斑马鱼运动行为的影响
24 hpf时观察斑马鱼胚胎的尾部摆动次数，当DMSO浓度>0.5%时可观察到胚胎一过性的爆发运动，空白对照组没有这种行为，与空白对照组比较，差异无统计学意义。当DMSO浓度＞2.5%时，胚胎尾部摆动次数明显减少，与空白对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05，n=7)。见图 2。
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| 1：空白对照组；2~6分别为：0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%DMSO组；a：P < 0.01，与空白对照组比较 图 2 不同浓度DMSO对各组斑马鱼胚胎运动行为的影响(n=7，x±s) |
2.4 不同浓度DMSO对斑马鱼间脑DA神经元的影响
当WT型及Tg(Vmat2:GFP)转基因斑马鱼发育到72 hpf，分别使用激光共聚焦显微镜观察胚胎间脑DA神经元发育的情况。斑马鱼间脑相当于哺乳动物的“黑质区”，可观察到大量的DA神经元。当DMSO浓度为0.5%、0.8%时，间脑部位的TH荧光减弱、数量减少(P < 0.05)；同样，0.5%、0.8%DMSO浓度组的Vmat2荧光减少更明显(P < 0.01)。说明DA神经元对DMSO敏感的浓度较低，0.5%DMSO可导致间脑DA神经元明显减少。见图 3。
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| A：免疫荧光检测结果虚线框示间脑区；B：各组TH(+)数量统计(n=5，x±s)；C：各组Vmat2(+)数量统计(n=5，x±s) 1：空白对照组；2~5：分别为0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.8% DMSO组；a：P < 0.01，与空白对照组比较；b：P < 0.01，与0.3%DMSO组比较 图 3 激光共聚焦显微镜观察各组斑马鱼间脑多巴胺能神经元数量 |
2.5 不同浓度DMSO对斑马鱼间脑细胞增殖的影响
当DMSO浓度>0.3%时，72 hpf间脑细胞增殖受到抑制(P < 0.05，图 4、5)，当DMSO浓度增大时，间脑细胞增殖受影响越大(P < 0.01)。0.8%DMSO与0.3%DMSO比较，间脑细胞增殖明显减少(P < 0.05)，说明间脑DA神经元增殖在DMSO浓度为0.3%即受到影响。低浓度DMSO(0.5%)影响间脑DA神经元的数量，可能是通过调控间脑细胞增殖影响间脑DA神经元发育。
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| 1：空白对照组；2：0.1%DMSO；3：0.3%DMSO；4：0.5%DMSO；5：0.8%DMSO；a：P < 0.05，b：P < 0.01，与空白对照组比较；c：P < 0.05，与0.3%DMSO组比较 图 4 不同浓度DMSO对各组斑马鱼间脑细胞增殖的影响(n=5，x±s) |
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| 虚线框内显示间脑区 图 5 激光共聚焦显微镜观察72 hpf时各组斑马鱼间脑多巴胺神经元增殖 |
2.6 不同浓度DMSO对斑马鱼间脑腹侧DA神经元凋亡的影响
为了分析DMSO处理后，间脑运动神经元发育缺陷是否由细胞凋亡导致，在胚胎发育至72 hpf时，使用TUNEL染色法检测间脑细胞凋亡情况。结果显示，72 hpf时，当DMSO浓度>0.3%时，斑马鱼端脑前部或眼球周围即会出现少许凋亡，随着浓度增高，凋亡增多，DMSO浓度为0.8%时，可见间脑区域出现少许凋亡(图 6)，靠近底板区、端脑及后脑凋亡明显增加。这可能与不同部位的组织暴露浓度及其敏感性不同相关。
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| 虚线框示多巴胺神经元凋亡 图 6 激光共聚焦显微镜观察72 hpf时各组斑马鱼间脑多巴胺神经元凋亡情况 |
3 讨论
近年来斑马鱼被广泛用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中[8]，实验中的疏水性毒物和药物等化学试剂大多数是低水溶性，而DMSO作为“万能溶剂”在这些实验中应用较广。在实验过程中，为避免DMSO对斑马鱼神经系统的影响，需要弄清楚DMSO的安全使用浓度。不同浓度的DMSO发挥不同的作用，包括抗炎[9]、抗氧化[10]、神经保护[11]及促进坏死/凋亡[12]。DMSO可通过调节前凋亡细胞应激反应来延长原代肝细胞的存活[13]。任何药物的毒性都取决于其浓度，DMSO浓度在1%或5%以上可能通过破坏细胞膜导致细胞死亡；而浓度较低时，抗氧化和其他有益的作用可能占主导地位，但其安全浓度是多少仍不清楚。有报道指出斑马鱼胚胎在2%DMSO浓度下未观察到溶剂暴露后的孵化延迟[14]。有研究提出DMSO浓度为0.005%~0.1%时有利于肝细胞增殖，浓度≥0.5%时细胞增殖数目减少。作者推测可能是通过诱导自噬减少肝细胞脂质的累积，从而影响细胞增殖[15]。
仓鼠卵巢细胞DMSO的阈值剂量为0.5%[16]；绒毛膜乳头内皮细胞的阈值剂量为1.0%[17]；胚胎干细胞的阈值剂量为0.1%[18]。2009年HANSLICK等[19]首次发现DMSO在0.3 mL/kg低剂量下，小鼠大脑发育过程中即产生广泛的凋亡; 同时体外培养的大鼠海马细胞在0.5%DMSO浓度下神经元出现丢失。对于体外培养的神经元，0.5%的DMSO会显著破坏神经形态，降低生存能力，0.5%的DMSO可诱导星形胶质细胞反应性增生[20]。在此研究中，明确了斑马鱼胚胎在0.5%DMSO浓度下暴露3 d，可导致斑马鱼间脑DA数量明显减少，细胞增殖明显减少。0.8%DMSO会导致斑马鱼间脑细胞凋亡增多。
综上所述，本研究通过分析不同浓度梯度的DMSO对斑马鱼胚胎发育及间脑多巴胺神经元数量的影响，提出DMSO在斑马鱼胚胎上的安全使用浓度：在研究药物对死亡率、孵化率、畸形率的影响时，DMSO的最大推荐浓度是2.0%；研究斑马鱼DA神经元数目、细胞增殖时推荐DMSO最大浓度是0.3%，以及DMSO浓度在0.8%时间脑细胞出现凋亡。但DMSO对行为学及认知方面的影响还需要进一步研究，以完善DMSO对斑马鱼综合的影响。
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