2. 400016重庆，重庆医科大学基础医学院:分子肿瘤研究中心
2. Molecular Medicine and Cancer Research Center, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
糖尿病已经成为重大的公共卫生问题[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者的严重微血管并发症，约占糖尿病发病人数的1/3，是终末期肾脏病的主要原因[2]。由于DN疾病过程中受到多种遗传及环境因素的调控，一旦发展为终末期肾病，往往比其他肾脏疾病更为棘手，严重影响了糖尿病患者的预后和生存。据报道，慢性肾脏病的病死率增加了26.8%，其中DN是主要病因(69.1%)[3]。DN的发病机制与多种因素密切相关，包括肾小球系膜病变。目前研究发现，DN早期就出现的系膜细胞增殖伴随细胞外基质合成增多，其调控机制与多种细胞因子，miRNAs及蛋白相关，然而，系膜细胞增殖的机制尚未完全阐明。
miRNA是一类在真核生物高度保守的内源性非编码小分子RNA，目前研究发现在多种疾病包括DN的过程中发挥重要作用, 如miR-675抑制前列腺癌转移[4]，miR-148a/c参与胃癌转移[5]，miR-125b延缓膀胱癌的进展[6]，miR-451抑制DN系膜细胞增殖[7]。miR-449a作为miR-34/449家族中新发现的miRNA，有研究报道作为肿瘤抑制因子参与肝癌和前列腺肿瘤的细胞增殖、迁移、分化和凋亡[8-9]。应用生物信息学方法发现：miR-449a的多个靶基因, 包括三结构域蛋白11(tripartite motif containing 11，Trim11)、肿瘤坏死因子受体超家族21(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 21，Tnfrsf21)、含有ARID结构域的蛋白质4A(ARID domain-containing protein 4A，Arid4a)、低密度脂蛋白受体A类结构域3(low density lipoprotein receptor class A domain containing 3，Ldlrad3)等。结合课题组前期二代测序结果发现Trim11在DN小鼠肾脏组织中差异表达，本研究拟利用高糖和低糖培养的系膜细胞作为细胞模型，探讨miR-449a是否通过Trim11参与调控DN的系膜细胞增殖。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠系膜细胞系(SV40-MES14)保存于本实验室。高糖和低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，冰冻胎牛血清购自上海生工生物工程有限公司。miR-449a mimics，inhibitor和其对照购自上海吉玛基因公司。转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。TRIzol试剂、RNA逆转录试剂盒及SYBR Green购自日本TaKaRa公司。EdU试剂盒购自广州锐博生物科技公司。RIPA裂解液及10%SDS-PAGE购自上海碧云天生物技术公司，0.45 μm的PVDF膜及ECL显影液购自美国Millipore公司。研究中使用的一抗如下：Trim11抗体(1 :500)，购自武汉三鹰生物科技公司，GAPDH抗体(1 : 5 000)购自美国Abcam公司。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学预测利用生物信息学在线软件RAIDv2.0(http://www.rna-society.org/raid/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/mmu_71/)和RNAv22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)预测miR-449a的潜在靶基因及结合位点。
1.2.2 细胞培养系膜细胞使用含有15%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO2、37 ℃的环境中培养。将细胞分为两组，高糖组细胞用含有25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养，低糖组细胞用含有5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L甘露醇的DMEM培养基培养[10]。高糖条件模拟糖尿病环境，而低葡萄糖条件模拟正常生长状态。
1.2.3 miR-449a mimics及inhibitor的转染将低糖组细胞分为3组，转染miR-449a inhibitor的细胞命名为低糖inhibitor组，转染miRNA inhibitor阴性对照的细胞命名为低糖对照组，未经处理被命名为低糖空白组。此外，将高糖组分为3组，转染miR-449a mimics的细胞命名为高糖mimics组，转染miRNA mimics阴性对照的细胞命名为高糖对照组，未经处理被命名为高糖空白组。后续实验都按此分组。根据说明书，使用lipofectamine 2000试剂将miR-449a mimics或inhibitor转染到细胞中。序列如下：miR-449a mimics：正义链5′-UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3′, 反义链5′-CAGCUAACAAUACACUGCCAUU-3′；mimics NC：正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′, 反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-449a inhibitor：5′-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3′；inhibitor NC：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。
1.2.4 总RNA提取和实时定量PCR使用TRIzol提取细胞总RNA，采用茎环法以及使用逆转录试剂盒逆转录，具体操作严格按说明书进行。茎环法引物：miR-449a: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCAGCTA-3′; U6：5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′。以cDNA为模板，配制10 μL PCR反应体系，进行qPCR实验。qPCR引物：mmu-miR-449a：上游5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTATTGTTA-3′，下游5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，产物大小为88 bp；U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AAC-GCTTCACGAATTTGCGT-3′，产物大小为94 bp。PCR程序如下：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s，72 ℃ 60 s，40个循环。以U6为内参，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。所有实验至少进行3次。
1.2.5 双荧光素酶实验为了构建用于双荧光素酶报告载体，野生型Trim11和突变体Trim11(突变的miR-449a结合位点)由上海吉玛基因公司克隆到GP-miRGLO载体中。用lipofectamine 2000将Trim11wt，Trim11 mut，miR-449a mimics或mimics阴性对照转染到HEK 293细胞。根据制造商的说明，细胞转染后48 h，用双荧光素酶报告系统(Promega)检测荧光素酶活性。
1.2.6 Western blot检测RIPA裂解液加入1%PMSF混合，冰上分组提取转染的系膜细胞的总蛋白。在10%SDS-PAGE上分离定量蛋白质，转移到0.45 μm PVDF膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育2 h。使用ECL系统检测蛋白质印迹的条带强度，并使用GAPDH抗体作为对照。通过Image Lab软件定量蛋白质条带的灰度值。
1.2.7 细胞增殖实验将转染miR-449a mimics的高糖组或转染inhibitor的低糖组系膜细胞换为50 μmol/L EdU标记的培养基，在37 ℃、5%CO2条件下培养2 h。用4%多聚甲醛固定30 min后，用0.5%Triton X-100渗透细胞并用PBS洗涤3次。随后，加入100 μL DAPI(5 μg/mL)在室温下孵育30 min，然后用PBS洗涤3次。甘油封片后用荧光显微镜采集图像。阳性细胞率为EdU阳性细胞(红色)与总DAPI阳性细胞(蓝色)的百分比。
1.3 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件。结果均以x±s表示。使用t检验进行两组比较，单向方差分析与多重比较检验来分析组间差异的显著性。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 miR-449a在高糖和低糖培养的系膜细胞中的表达RT-qPCR检测结果显示：高糖组miR-449a的相对表达量较低糖组下降[(0.639±0.060) vs (1.000±0.141), P < 0.01]。
2.2 miR-449a调控系膜细胞增殖的能力在低糖组中转染miR-449a inhibitor抑制miR-449a后，EdU检测系膜细胞增殖效率。结果显示：与空白组比较，转染miR-449a inhibitor的低糖组细胞增殖增加，表明抑制miR-449a对低糖培养的系膜细胞增殖有促进作用(P < 0.01，图 1，图 2A)。
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| 图 1 EdU检测转染miR-449a inhibitor后低糖组系膜细胞增殖 |
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| A：转染miR-449a inhibitor后低糖组阳性细胞率1：低糖空白组；2：低糖对照组；3：低糖inhibitor组；a: P < 0.01, 与低糖空白组比较；B：转染miR-449a 1：高糖空白组；2：高糖对照组；3：高糖mimics组；a: P < 0.01, 与高糖空白组比较 图 2 抑制或过表达miR-449a后高糖组或低糖组系膜细胞EdU半定量分析结果 |
高糖组转染miR-449a mimics后，EdU检测系膜细胞增殖效率。结果显示：与空白组比较，转染miR-449a mimics模拟过表达miR-449a后，高糖组细胞增殖减少，表明过表达miR-449a对高糖培养的系膜细胞增殖有抑制作用(P < 0.01, 图 3，图 2B)。
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| 图 3 EdU检测转染miR-449a mimics后高糖组系膜细胞增殖 |
2.3 Trim11是miR-449a的靶基因
运用生物信息学方法预测miR-449a的潜在靶基因。结果显示：miR-449a有68个潜在靶基因，包括Trim11、Tnfrsf21、Arid4a等。结合前期对DN小鼠肾脏组织二代测序发现的差异mRNA表达谱，Trim11为上调，提示DN中Trim11可能是miR-449a的潜在靶基因。
生物信息检测显示：Trim11 3′-UTR区的157~176 nt片段与miR-449a“种子序列”互补配对。为明确miR-449a与Trim11的关系，在预测结果的基础上设计和转染Trim11的突变型和野生型载体(图 4A)并进行荧光素酶检测。与突变型比较，野生型的相对活性降低了30%(P < 0.01，图 4B)。以上结果都证明miR-449a与Trim11具有靶向直接结合关系。
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| A：miR-449a与Trim11 3′-UTR区的结合位点及突变位点；B：双荧光素酶报告检测miR-449a与Trim11 3′-UTR的结合关系；a:P < 0.01, 与mimics NC组比较 图 4 miR-449a与Trim11的靶向结合关系 |
2.4 miR-449a抑制Trim11蛋白表达
采用Western blot检测过表达或沉默miR-449a后各组细胞中Trim11蛋白水平的变化。结果显示：低糖组沉默miR-449a，Trim11表达显著高于空白组；在高糖组过表达miR-449a，Trim11表达显著低于空白组(P < 0.01)，提示Trim11可能参与DN的发生、发展。miR-449a调控Trim11的表达。见图 5。
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| A、C: Western blot检测miR-449a过表达后Trim11表达及半定量分析结果1：低糖空白组；2：低糖对照组；3：低糖inhibitor组；B、D: Western blot检测miR-449a抑制后Trim11表达及半定量分析结果1：高糖空白组；2：高糖对照组；3：高糖mimics组；a: P < 0.01, 与空白组比较 图 5 Western blot检测miR-449a过表达或抑制后Trim11蛋白表达 |
2.5 miR-449a通过Trim11影响增殖
在高糖组中抑制miR-449a的同时沉默Trim11，EdU检测系膜细胞增殖效率。结果显示：与空白组比较，在系膜细胞中抑制miR-449a的表达后，细胞增殖能力增强，而敲低Trim11后，细胞增殖能力降低。沉默miR-449a和Trim11后，系膜细胞增殖能力较抑制miR-449a组降低。表明抑制miR-449a后对系膜细胞增殖的促进作用被Trim11的siRNA拮抗(P < 0.01, 图 6)。
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| A: EdU检测细胞增殖; B: EdU半定量分析1：空白组；2：inhibitor组；3：siTrim11组；4：siTrim11+inhibitor组；a: P < 0.01, 与空白组比较；b: P < 0.01, 与inhibitor组比较 图 6 EdU检测转染miR-449a inhibitor及Trim11 siRNA后高糖组系膜细胞增殖 |
3 讨论
DN作为糖尿病主要并发症之一，严重影响患者的生命质量，为患者及家庭带来了沉重的经济和精神负担。肾小球系膜病变是DN最突出的病理改变之一。目前，有研究提出，DN系膜细胞增殖受到miRNA及其靶基因的相互作用的调控。miRNA可与靶mRNA的3′或5′非编码区形成不完全的碱基互补，调控靶基因的表达，从而影响疾病的进程。有多项研究报道miRNA沉默基因调节细胞过程参与DN的发生，如miR-21对db/db DN小鼠肾小球系膜增生有抑制作用[11]；miR-34a-5p调节lincRNA 1700020I14Rik与靶基因Sirt1，介导HIF-1α信号途径，改善糖尿病肾病肾系膜细胞纤维化及增殖[10]。但miRNA具体机制仍不完全清楚。
miR-34/449家族参与DN的发生目前广受关注。miR-34/449家族包括具有种子序列相似性的6个同源基因：miR-34a，miR-34b，miR-34c，miR-449a，miR-449b和miR-449c [12]，在DN中发挥重要作用。miR-34a和miR-34c的过表达抑制高葡萄糖诱导的足细胞凋亡[13-14]，miR-34a的下调减轻高糖培养的系膜细胞的增殖[15]。以上均提示miR-34/449家族可能是一个DN相关的重要分子家族。新近研究发现，过表达miR-449a抑制肝癌细胞增殖和细胞迁移，同时诱导肝癌细胞凋亡[16]；E2F1激活miR-449a可靶向并抑制癌基因CDK6和CDC25A的表达，抑制细胞增殖[17]。以上研究提示miR-449a是一个重要的细胞增殖相关的miRNA，可能在DN系膜细胞增殖中发挥作用。我们的结果显示，miR-449a在高糖培养的小鼠系膜细胞中低表达, 提示miR-449a可能参与DN。进一步，EdU细胞增殖实验发现在系膜细胞中过表达miR-449a后细胞增殖能力降低，而沉默miR-449a后细胞增殖能力增强，提示miR-449a调控系膜细胞增殖，可能在DN发生、发展中扮演重要角色。
为进一步探索miR-449a影响系膜细胞增殖的机制，本研究运用生物信息学分析其潜在靶基因。结果显示Trim11、Tnfrsf21、Arid4a、Ldlrad3等68个基因为其预测靶基因。结合课题组前期二代测序结果，我们发现Trim11在DN组织表达增高，因此Trim11受到我们的关注。Trim家族蛋白被报道在多种肿瘤的细胞增殖、迁移、分化和凋亡中发挥重要作用；有研究发现Trim11促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT以及体内肿瘤生长[18]；Trim11还可以直接结合miR-24-3p促进细胞增殖并抑制结肠癌中的细胞凋亡[19]；在敲低Trim11的肺癌细胞系中，细胞生长、运动性和侵袭性显著降低[20]，提示Trim11在细胞生长、增殖中发挥作用。但Trim11在DN中少见报道。荧光素酶结果显示miR-449a的种子序列可直接结合Trim11的3′UTR区调控Trim11，证实Trim11是miR-449a的靶基因。此外，Western blot检测发现过表达miR-449a后, Trim11蛋白质减少，而沉默miR-449a后Trim11蛋白质显著增加。这些结果显示miR-449a可通过靶向结合Trim11 3′UTR，从而抑制Trim11蛋白表达。并且，在同时使用miR-449a inhibitor及Trim11的siRNA，miR-449a inhibitor对系膜细胞增殖的促进作用减弱。结合上述研究结果，可推测miR-449a可能是通过抑制靶基因Trim11表达，调控系膜细胞增殖，参与DN的疾病过程。后续将进一步研究miR-449a通过Trim11参与DN系膜细胞增殖的具体机制。
本研究利用生物信息学技术和荧光素酶检测探索miR-449a与DN相关的Trim11的靶向结合关系，通过分子生物学实验验证miR-449a通过与Trim11相互作用可以调控DN的系膜细胞增殖，为DN的系膜细胞增殖机制研究提供新的实验依据。以miR-449a通过Trim11参与调控高低糖培养的肾小球系膜细胞增殖的研究为基础，为DN早期诊治寻找突破口和重要靶点。
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