在低温环境中有效调节体温是哺乳动物进化出的重要功能，其中棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)激活所导致非颤栗性产热增加对于核心体温的维持发挥了重要作用[1]。近年研究通过断层摄影成像在成年人中发现有生物活性的棕色脂肪组织，使得BAT成为治疗肥胖和代谢性疾病的一个极具吸引力的靶标[2-3]。除了经典的棕色脂肪，以脂质形式储存能量的白色脂肪细胞(white adipose tissue，WAT)也会响应寒冷刺激而发生棕色化，转化为米色脂肪细胞[4-5]，啮齿动物腹股沟白色脂肪(inguinal white fat adipose tissue，WATi)是棕色化最常见的发生部位[6]。
研究表明，在高脂饮食的诱导下，体内脂肪过度积累可伴随一系列代谢综合征的发生，其中包括以胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病为特征的葡萄糖稳态异常[7-8]。而冷暴露或β3肾上腺素能受体激动剂等因素则可导致脂肪细胞内脂滴分解动员增加[9]，同时刺激棕色脂肪以及棕色化的白色脂肪加速燃烧从胞浆内或从血液中摄取[8]的游离脂肪酸产生更多的热量[10]。事实上，活体动物实验表明β3受体激动剂可显著降低肥胖表型，并改善其糖尿病症状[11]。直接向啮齿类动物移植0.05 g的BAT后，也可导致动物体质量明显降低，葡萄糖耐量和胰岛素敏感性显著改善[12-13]。近期几项人体研究表明，短期连续冷暴露可以显著增强棕色脂肪对葡萄糖的摄取[14]，改善全身胰岛素敏感性[15]。然而，BAT移植和使用β3受体激动剂都属于非生理性操作，导致超常升高的解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)，并忽略了生理条件下的反馈性调节[16]。连续冷暴露几乎不具有实际可操作性，并可能对机体产生不可逆转的副作用。因此，本研究探索了长期间歇性冷暴露——一种人体感知外界环境更为常见的方式对机体葡萄糖耐量和胰岛素敏感性产生的影响，并探讨了其对高脂饮食诱导葡萄糖稳态异常的预防作用。有鉴于脂肪组织与糖代谢的密切关系，而且其可以被冷暴露活化，本研究利用全转录组测序分析探讨BAT和WATi在冷暴露对机体葡萄糖代谢调控中发挥的作用，旨在为葡萄糖稳态异常提供新的临床治疗思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组雄性C57BL/6J小鼠购买和饲养于陆军军医大学实验动物中心(SPF级)，温度为23~25 ℃，湿度为55%~61%，昼夜按12 h :12 h循环。待小鼠生长到8周后，按体质量排序后分组进行实验。
实验分2批进行。第1批设2组，分别为对照组和冷暴露组，每组6只小鼠，观察冷暴露对正常小鼠的影响。第2批设2组，分别为高脂对照组和高脂+冷暴露组，每组6只小鼠，进一步观察冷暴露对糖耐量异常小鼠模型的影响。其中，第1批实验动物采用正常普通饲料；第2批实验动物采用高脂饲料，为D12492(research diets, USA)，脂肪能量占比60%。冷暴露在4 ℃通风冰箱内进行，每天上午9点开始，进行2 h。对照组和高脂对照组保持常规温度饲养。
1.2 腹膜内葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐量实验(IPITT)在1、8、16、22周冷暴露后进行IPGTT测定。在进行IPGTT之前，小鼠更换垫料，禁食过夜，在称取体质量和初始血糖后，按2 g/kg剂量给予腹膜内葡萄糖注射，从尾静脉收集血液标本，在30、60、90、120 min分别采用血糖仪(Roche, USA)测量血糖水平。
在22周冷暴露后进行IPITT测定，实验时间与IPGTT间隔72 h。小鼠更换垫料，禁食2 h，在称取体质量和初始血糖后，按0.75 U/kg剂量给予腹膜内胰岛素注射，从尾静脉收集血液标本，在30、60、90、120 min分别采用血糖仪(Roche, USA)测量血糖水平。
1.3 组织收集分组饲养22周后对小鼠各个部位的脂肪组织进行收集，实验时间与IPITT间隔72 h。小鼠禁食4 h后，腹腔给予2%戊巴比妥溶液麻醉，处死后抽取血液，在冰上小心收集棕色脂肪(BAT)和皮下白色脂肪(WATi)，称量记录后，置于液氮瓶内。
1.4 转录组测序实验根据标准操作流程，采用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)试剂抽提之前所收集的棕色脂肪和皮下白色脂肪的总RNA，抽提所得总RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific, USA)及Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies, USA)质检，合格后使用RNAClean XP Kit(Beckman Coulter, USA)和RNase-Free DNase Set(QIAGEN, Germany)纯化总RNA。总RNA经文库构建，基因蔟生成后利用illumina Hiseq 2500测序仪(Illumina, USA)上机测序。
1.5 统计学分析对于转录组测序结果，使用R语言程序包FactoMineR进行主成分分析(PCA)，利用R语言程序包GOstats进行GO富集分析。IPGTT和IPITT的数据采用计算其曲线下面积(area under curve, AUC)的方法进行统计。使用SPSS 21.0统计软件，数据以x±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，使用GraphPad软件绘图。
2 结果 2.1 间歇性冷暴露对小鼠体质量以及皮下白色脂肪质量的影响冷暴露组小鼠的体质量在整个间歇性冷刺激期间都与对照组小鼠的体质量保持一致(图 1A)，然而，冷暴露却使得WATi的质量较对照组降低了34.91%，BAT的质量较对照组提高了20.25%，差异均有统计学意义(P < 0.05，图 1B)。
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| A:各组小鼠体质量变化趋势；B:各组小鼠脂肪组织的质量a：P < 0.05，与对照组比较 图 1 间歇性冷暴露后小鼠体质量及脂肪质量变化趋势(n=6) |
2.2 间歇性冷刺激对小鼠葡萄糖稳态的影响
IPGTT和IPITT实验结果显示，与对照组比较，1周的间歇性冷暴露就可以提升小鼠葡萄糖耐受水平12.8%以及提升胰岛素敏感度6.4%。而当冷暴露时间延长到22周时，这两个指标的提升程度可以分别达到54.4%和43.5%。并且这种改善的程度与时间的长短正相关，冷暴露22周时的葡萄糖耐受水平和胰岛素敏感度分别较冷暴露1周时的数据提升16.6%和39.4%(图 2)。
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| A、B:葡萄糖耐受实验；C、D:胰岛素耐受实验；A、C：血糖；B、D：曲线下面积a：P < 0.01，与对应周龄对照组小鼠比较；b：P < 0.01，与1周龄冷暴露组小鼠比较；c：P < 0.01，与8周龄冷暴露组小鼠比较；d：P < 0.01，与16周龄冷暴露组小鼠比较 图 2 间歇性冷暴露对小鼠葡萄糖稳态的影响(n=6) |
2.3 间歇性冷刺激对高脂喂养小鼠体质量以及葡萄糖稳态的影响
进一步探讨冷暴露对高脂饮食诱导葡萄糖稳态异常的预防作用。结果显示，间歇性冷暴露成功阻止了高脂饮食的增重作用，甚至使得小鼠的体质量基本与普通饮食的对照组保持一致。而对小鼠解剖后的观察也表明，22周的间歇性冷暴露显著降低了高脂饮食带来的皮下脂肪堆积现象，其中WATi的质量较高脂对照组下降了63.40%，BAT的质量较高脂对照组增加了29.50%，差异均有统计学意义(P < 0.05), 见图 3。
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| A:各组小鼠体质量变化趋势；B:各组小鼠脂肪组织的质量a：P < 0.01，b：P < 0.05，与高脂对照组小鼠比较 图 3 间歇性冷暴露对高脂喂养小鼠体质量及脂肪质量变化的影响(n=6) |
同样的，在1、8、16、22周这4个时间点分别进行IPGTT和IPITT实验研究冷暴露对高脂饮食小鼠葡萄糖稳态的干预作用。数据显示，长期高脂饮食可以显著损害小鼠的葡萄糖代谢，而间歇性冷暴露则可以有效阻止这种损害(图 4)。尽管小鼠在高脂喂养的同时给予冷暴露没有继续提高其糖耐量，但2组的差异依然具有时间依赖性。在实验第1周，2组糖耐量和胰岛素敏感性的差异分别为5.8%和10.0%，而到22周时这两个指标的差异已经达到36.6%和25.2%。另外，高脂+冷暴露组小鼠的糖耐量与普通饮食的对照组基本一致，而其胰岛素敏感性在22周时较对照组还进一步增强了9.6%。
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| A、B:葡萄糖耐受实验；C、D:胰岛素耐受实验；A、C：血糖；B、D：曲线下面积a：P < 0.05，与对应周龄高脂对照组小鼠比较 图 4 间歇性冷暴露对高脂喂养小鼠葡萄糖稳态的影响(n=6) |
2.4 间歇性冷暴露对小鼠脂肪组织基因表达谱的影响
在明确间歇性冷暴露对机体葡萄糖稳态的显著影响后，对BAT和WATi进行转录组测序，分析这两种在冷暴露条件下活化的脂肪组织对该过程发挥的调控作用。使用EdgeR工具分别分析两种脂肪组织的转录组测序数据，在棕色脂肪共发现458个差异基因(P < 0.01)，其中124个基因表达升高，334个基因表达下降，在皮下白色脂肪共发现249个差异基因(P < 0.01)，其中102个基因表达升高，147个基因表达下降。通过GO数据库归纳分析发现，关于葡萄糖稳态变化最大的几个生物学过程分别是“葡萄糖代谢反应”“甘油酯代谢反应”“胰岛素分泌”和“胰岛素反应性”。具体地讲，葡萄糖摄取相关蛋白，葡萄糖转运蛋白Ⅳ(GLUT4)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在两种脂肪组织中表达增加。糖酵解相关酶，包括6-磷酸果糖激酶(Pfkl)、己糖激酶2(HK2)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶1(Pgk1)和苹果酸脱氢酶(MDH1/2)的表达在两种脂肪组织中都升高，但苹果酸-天冬氨酸穿梭酶系中的谷氨酸草酰乙酸转氨酶(Got1/2)的表达没有变化。糖原合成酶(GYS1/2)的表达在棕色脂肪中没有受到冷暴露的影响，但是在白色脂肪中显著提高。甘油合成相关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1)只在白色脂肪中表达升高，但丙酮酸羧化酶(PCX)则在两种脂肪表达都有升高。乳酸合成相关的乳酸脱氢酶(Ldhα/β)在两种脂肪中表达增加。另外，与胰岛素反应相关的PI3K-Akt通路蛋白和胰岛素信号通路蛋白在两种脂肪中表达也有所增加。在这些代谢途径中，棕色脂肪和白色脂肪的差异基因并不完全一致(图 5)，这可能反映了两种组织在这些特定通路所拥有的限速酶不一样。
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| 图 5 间歇性冷暴露后棕色脂肪或皮下白色脂肪的差异基因表达热力图(n=3) |
2.5 间歇性冷暴露对高脂喂养小鼠脂肪组织基因表达谱的影响
同样的方法分析高脂对照组和高脂+冷暴露组小鼠脂肪组织的转录组测序数据，在棕色脂肪共发现209个差异基因(P < 0.01)，其中76个基因表达升高，133个基因表达下降，在皮下白色脂肪共发现567个差异基因(P < 0.01)，其中448个基因表达升高，119个基因表达下降。高脂喂养后，小鼠的基因表达谱发生很大的变化，白色脂肪与棕色脂肪基因表达差异明显增大。具体而言，表达上调的葡萄糖摄取相关蛋白由GLUT4变成GLUT3，上调的6-磷酸果糖激酶由Pfkl变成Pfkm。糖酵解相关的其他酶，GAPDH、Got1/2和MDH1/2的表达在棕色脂肪中表达上升，而在白色脂肪中表达下降，出现较大分歧。糖原合成相关的GYS1/2在白色脂肪中表达下降，在棕色脂肪中保持不变。甘油合成相关的PCK1和PCX表达在两种脂肪组织表达均有所上升，乳酸合成相关的Ldhα/β表达则没有显著变化。另外，与胰岛素反应相关的PI3K-Akt通路蛋白和胰岛素信号通路蛋白在白色脂肪中表达也有所增加，而在棕色脂肪中变化不够显著(图 6)。总之，与普通饮食下冷暴露的小鼠相比，高脂饮食下给予冷刺激后小鼠白色脂肪组织葡萄糖代谢相关基因表达变化不够明显。
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| 图 6 高脂喂养条件下间歇性冷暴露后棕色脂肪或皮下白色脂肪的差异基因表达热力图(n=3) |
3 讨论
近年来一系列关于棕色脂肪的研究让我们重新认识了棕色脂肪的起源、功能以及其在人体内的分布。而相对应的，广泛存在的白色脂肪棕色化使得这些研究变得更加具有应用前景。同时，脂肪组织作为人体最大的内分泌器官，其深度参与了全身的能量和物质代谢[17]。本研究构建的冷暴露模型表明长期间歇性冷暴露对机体葡萄糖稳态有着重要的调控作用，其调控机理与激活的棕色脂肪以及棕色化的白色脂肪密切关联。
小鼠在接受间歇性冷刺激后，其体质量相对于对照组没有发生变化，与之前研究相似[18-20]。而先前进行的一系列的研究中，如进行棕色脂肪移植[12]、β3受体激动剂治疗[21]，小鼠体质量都出现了显著下降。一般而言，体质量受到能量摄入和能量耗散两个方面的影响，在能量摄入只有轻微增加的前提下，体质量没有显著变化可能表明间歇性冷暴露是一种相对轻微的影响因素，只有在肥胖模型上才能观察到其对体质量的效应。另一方面，间歇性冷暴露在不影响体质量的前提下，仍然显著地降低了皮下白色脂肪的含量，提高了棕色脂肪的含量，则暗示脂肪组织可能是冷暴露最大的效应器官。
针对机体葡萄糖稳态，本研究主要从糖耐量和胰岛素敏感性来进行探讨。间歇性冷暴露对葡萄糖稳态的提升是立竿见影的，只要进行1周的刺激，小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性就明显改善了。这意味着短期的，甚至偶尔的冷暴露对于改善机体葡萄糖代谢都是有意义的，与之前的大部分短期冷暴露研究所展现的结果一致[15]。冷暴露时间越长，改善葡萄糖稳态的程度就越大，意味着如果坚持在寒冷的户外进行活动，甚至坚持冷水沐浴、冬泳等一些生活习惯，对于机体葡萄糖代谢的提升是会有累积效应的。但是这也会提出一个新的问题，如果长期间歇性冷暴露会不断提升机体葡萄糖稳态，那么这种提升是否会有一个极限？如果有，这个界限会出现在哪个时间点，还需要后续继续研究。
此外，在高脂饮食的同时接受间歇性冷暴露可以完全避免高脂摄入对机体葡萄糖稳态造成的损害，提示间歇性冷暴露是一种非常有效的预防措施。但是与普通饮食条件下情况不同的是，小鼠葡萄糖稳态并没有随着冷暴露时间的延长得到进一步的改善。这一方面可能是因为高脂饮食的时间越长对机体葡萄糖稳态的危害越大，而冷暴露在整个实验周期内都维持了机体葡萄糖代谢稳定，从另外一个角度表明高脂饮食条件下长期冷暴露的效应依然显著。另一方面，转录组测序分析表明，高脂喂养条件下冷暴露对白色脂肪组织葡萄糖代谢相关基因表达的改变变得不够明显，可能导致冷暴露对小鼠葡萄糖稳态的提升效果有限。当然，这个实验也引出了另一个问题，在高脂饮食已经引起了葡萄糖稳态损害的情况下再给予冷暴露能否逆转这种损害，也就是冷暴露是否具有治疗效果，还有待下一步探索。
鉴于脂肪组织在冷暴露过程中有着显著的表型变化，上述葡萄糖稳态的改善可能要归功于脂肪组织自身代谢水平发生的改变。应当指出的是，棕色脂肪的产热作用抑或是白色脂肪棕色化与糖代谢并不是截然分开的两个过程，其复杂地交织在一起，甚至共用了一些信号分子和通路。PGC1α，PPARγ的辅助因子，在活化的棕色脂肪细胞内高表达，同时也是诱导白色脂肪棕色化的关键分子[22]，而在脂肪组织特异性敲除PGC1α则会导致对肝脏葡萄糖输出的抑制减少[23]。另一方面，AMPK则通过异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)诱导Prdm16去甲基化来促进棕色脂肪细胞的分化[24]。而PGC1α的另一种刺激因子——FGF21[25]，可以被冷暴露诱导表达[26]，同时通过增加白色脂肪中的GLUT4表达来改善葡萄糖稳态[12, 27]。
葡萄糖的代谢主要由葡萄糖摄取、糖酵解途径、进入三羧酸循环这几个步骤决定，而脂肪组织转录组测序的结果也证实这几个步骤在冷刺激的作用下活性会有所增强。对于活化的棕色脂肪来说，游离脂肪酸才是主要的供能物质[28-29]，那么超量摄入的葡萄糖可能并没有直接用来产生热量。对葡萄糖进行14C标记可以清晰地发现冷暴露时棕色脂肪内葡萄糖向甘油三酯的C转移增加了30倍，其中71%分布在甘油[30]。转录组分析已经表明，冷暴露下棕色脂肪和皮下白色脂肪的葡萄糖分解和甘油合成增加，提示这些摄入的葡萄糖更多地参与甘油的合成，并且通过糖酵解途径产生中间代谢产物参与到三羧酸循环辅助脂肪酸的β氧化，甚至还会影响到甘油三酯和乳酸的合成。
越来越多的研究在不断挖掘棕色脂肪以及白色脂肪棕色化后对人类能量代谢的潜在重要功能。本研究表明冷暴露通过作用于棕色脂肪和白色脂肪改善啮齿动物的葡萄糖稳态来预防代谢疾病，这个过程与脂肪组织活化后葡萄糖代谢通路发生变化密切相关，可能对发现潜在的治疗靶标有帮助价值。
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