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JIP1基因敲除对青年小鼠视网膜形态和突触蛋白表达的影响
张洁琼, 刘闻一, 林森, 叶剑     
400042 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院眼科
[摘要] 目的 探讨JIP1基因对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达的影响。方法 选择1月龄JIP1基因敲除(JIP1-KO)雄鼠和野生型C57雄鼠各12只,通过HE染色观察1月龄野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜厚度变化,采用Western blot和免疫组化方法检测野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜神经节细胞标志物(neuronal class Ⅲ β-Tubulin, TUJ1)、神经丝蛋白(neurofilament, NF)和突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95)、突触素(synaptophysin, SYN)表达。结果 1月龄野生型C57小鼠视网膜全层、外核层(outer nuclear layer,ONL)、内核层(inner nuclear layer,INL)厚度分别为(119.60±11.70)、(41.17±3.59)、(21.90±2.27)μm,JIP1-KO小鼠视网膜全层、ONL层、INL层厚度分别为(110.70±7.21)、(36.83±2.26)、(20.15±1.89)μm,各对应层之间厚度比较均无统计学差异(P>0.05);与野生型C57小鼠相比,JIP1-KO小鼠视网膜中TUJ1、PSD95、SYN表达水平均无统计学差异(P>0.05),TUJ1定位于视网膜神经节细胞层,神经细胞突起NF、PSD95、SYN定位于外网层。结论 JIP1基因敲除对1月龄小鼠视网膜发育影响不显著。
[关键词] JIP1     视网膜结构     突触蛋白    
Effect of JIP1 knockout on retinal structure and synaptic protein expression in young mice
ZHANG Jieqiong, LIU Wenyi, LIN SEN, YE Jian     
Department of Ophthalmology, Daping Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042, China
[Abstract] Objective To investigate the role of JNK interacting protein 1 (JIP1) gene in retinal structure and synaptic protein expression in young mice. Methods Twelve JIP1 knockout (KO) mice (1 month old) were employed in this study. HE staining was used to observe the changes of retinal thickness in 1-month-old wild type C57 mice and JIP1-KO mice. Western blotting and immunohistochemical assay were used to detect the expression of retinal ganglion cells' markers neuronal class Ⅲ β-tubulin (TUJ1), neurofilament (NF), postsynaptic density protein 95 (PSD95) and synaptophysin (SYN) in the 2 groups. Results The thicknesses of the whole retinal layer, the inner nuclear layer (INL) and the outer nuclear layer (ONL) of 1 month old wild type C57 mice were 119.60±11.70, 41.17±3.59 and 21.90±2.27 μm, respectively. And the thicknesses of the 3 layers of the JIP1-KO mice were 110.70±7.21, 36.83±2.26 and 20.15±1.89 μm, respectively. There were no statistical differences in the thickness of the corresponding layers between the 2 kinds of mice (P>0.05). Compared with the wild C57 mice, the expression levels of TUJ1, PSD95 and SYN in the retina of JIP1-KO mice had no significant difference (P>0.05). TUJ1 was located in the retinal ganglion cell layer, while NF, PSD95 and SYN were located in the outer plexiform layer (OPL). Conclusion JIP1 knockout shows no obvious effect on the development of the retina in mice aged 1 month.
[Key words] JIP1     retinal structure     synaptic protein    

C-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成员[1],其传导通路对于轴突的形成与生长、突触可塑性以及树突的发育都有着重要作用[2]。JNK相互作用蛋白(JNK interacting protein, JIPs)家族是一系列在JNK信号通路中发挥作用的蛋白,有JIP1、JIP2、JIP3三个家族成员。JIP1作为JIPs家族成员之一,可以与JNK信号通路中的多种分子结合,参与调节JNK通路的激活[3]。在神经系统中,JIP1作为支架蛋白,介导多种物质的轴突转运,例如淀粉样前体蛋白、载脂蛋白E受体-2等。在海马神经元中,JIP1通过JNK信号通路调节海马神经元的突触可塑性和凋亡;在皮层神经元中,JIP1通过多种途径调节轴突生长以及神经元的极性发育,下调JIP1将导致神经元极性紊乱[4-6]

视网膜由胚胎期的神经外胚叶发育而来,是眼睛中发育最早的组织。成熟的视网膜组织可分为10层,主要有3层神经细胞:外核层(视杆细胞、视锥细胞),内核层(双极细胞、水平细胞、无长突细胞)和神经节细胞层,以及2层突触连接:外网层(视杆细胞、视锥细胞和双极细胞、水平细胞的突触联系)和内网层(双极细胞、神经节细胞的突触联系)[7]。视网膜中各神经元的分化发育以及突触的形成对于视觉信号的传递、视觉的发生具有重要意义,JIP1作为神经发育的重要调节因子,对发育过程中视网膜结构和突触的作用目前尚无报道。因此,本研究拟通过比较C57野生型及JIP1基因敲除(JIP1-KO)小鼠的视网膜形态,神经节细胞特异性蛋白TUJ1、神经元骨架蛋白NF、突触前膜特异性标志SYN和突触后密度蛋白PSD95表达,探讨JIP1对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

1月龄C57BL/6J小鼠12只,雄性,15~20 g,购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心;1月龄JIP1-KO小鼠12只,15~20 g,雄性,购自南京大学模式动物研究所。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要仪器及试剂

免疫荧光显微镜购自德国Leica公司,蛋白电转仪、电泳仪购于Bio-Rad公司。蛋白免疫印迹封闭液、抗体稀释液、DAPI染液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物有限公司,封闭用羊血清工作液购于中杉金桥公司,SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白酶抑制剂PMSF购自索莱宝生物技术公司,化学发光(ECL)检测试剂盒购于Thermo公司,TUJ1(ab78078)、PSD95(ab18258)、NF(ab8135)、SYN(ab32127)一抗、HRP标记山羊抗兔IgG(ab6721)、山羊抗鼠IgG二抗(ab6789)均购自Abcam公司,JIP1(sc-25267)购自SANTA CRUZ公司,GAPDH(AP0063)购自Bioworld公司,Cy3标记的山羊抗鼠IgG二抗(#8890)、山羊抗兔IgG二抗(#4412)购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 JIP1基因敲除小鼠的基因型鉴定

剪取3~4周龄小鼠的尾端约2 mm置于Eppendorf(EP)管中,加入50 μL新鲜组织消化液,剪碎组织,55 ℃金属浴消化15 min,震荡,直至组织块完全消化;12 000 r/min离心10 min,取上清置于98 ℃金属浴中孵育10 min灭活消化液中的蛋白酶活性。制得的DNA模板-20 ℃保存备用。按照Sangon Biotech公司设计的引物:JIP1 A/GJIP1.11 5′-CGCGGTCTCAGGTGAGCAA-3′,JIP1 A/GJIP1.12 5′-CTGACTAGGCCTGTAAGAC-3′,JIP1 C/GKP1 5′-CTCCAGACTGCCTTGGGAAAA-3′,进行聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应体系(20 μL): Premix Taq 10 μL,引物1.5 μL,模板DNA 1.5 μL,加灭菌水补足体积。反应条件为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环,最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存备用。PCR反应终产物8 μL进行1.5%琼脂糖凝胶鉴定JIP1基因敲除小鼠基因型。

1.2.2 JIP1基因敲除小鼠JIP1 mRNA的表达与鉴定

选择JIP1-KO小鼠,用野生型C57小鼠作为对照,每组3只小鼠。将小鼠颈椎脱臼处死后,分离视网膜组织。根据Trizol试剂说明书提取两组样本总RNA,紫外分光光度法测定RNA浓度后,用反转录试剂盒(TaKaRa)在PCR仪进行反转录,得到cDNA。qPCR试剂盒(TaKaRa)进行PCR,两步法经Bio-Rad CFX96荧光定量系统进行荧光检测,利用2-△△Ct法对结果进行分析,实验设置3个复孔。引物由Sangon Biotech公司设计合成。JIP1基因上游:5′-GGCCTACCACGCTC- AACCTT-3′,下游: 5′-ACACACGGTCCTGCCAACTG-3′;内参β-actin基因上游: 5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′,下游: 5′-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3′。

1.2.3 免疫荧光观察视网膜中的蛋白表达分布

取新鲜眼球于4%多聚甲醛固定24 h,30%蔗糖脱水2 h,冰冻切片机中包埋,切片,厚度8 μm。羊血清封闭液封闭30 min,设立阴性对照后,加入一抗(稀释比例PSD95 1 :1 000,TUJ1 1 :500,NF 1 :2 500)于4 ℃孵育过夜,次日37 ℃恒温箱复温0.5 h,PBS溶液洗3次,每次5 min。加入二抗(1 :300)37 ℃恒温箱孵育1.5 h,PBS溶液洗3次,每次5 min。DAPI染色5 min,PBS清洗30 min。封片后于显微镜下观察。

1.2.4 HE染色观察视网膜组织

每组3只小鼠,视网膜冰冻切片PBS洗3次,每次5 min,苏木精染色3 min,水洗5 min,盐酸乙醇分化5 s,至载玻片蓝色消失,水洗5 min,酚红染色40 s,水洗5 min,二甲苯透明2 min,吹干,中性树脂封片。光学显微镜下观察视网膜组织学变化,并用Image J软件测量内、外核层以及视网膜全层厚度。

1.2.5 Western blot检测蛋白水平

在不同组(3只小鼠/组)的视网膜中加入RIPA蛋白裂解液,提取总蛋白,用BCA法测定各组蛋白含量,配平浓度后加入蛋白上样缓冲液于100 ℃水浴锅中煮沸15 min。制备10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶,每孔加入等量的蛋白样品,电泳分离后转至PVDF膜,室温下用封闭液封闭1.5 h,4 ℃摇床中一抗(稀释比例分别为GAPDH 1 :1 000,JIP1 1 :300,PSD95 1 :500,TUJ1 1 :1 000,SYN 1 :10 000)孵育过夜。次日,TBST洗膜3次,每次10 min,室温摇床孵育HRP标记二抗(稀释比例1 :5 000)1.5 h。TBST洗膜3次,每次10 min,加入ECL化学发光液曝光显影,Image J软件测量各条带灰度值,以待测蛋白与内参的灰度值比值表示蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

应用SPSS19.0统计软件对实验数据进行分析,每项实验至少重复3次,数据以x±s表示,两组间比较采用t检验,检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 JIP1-KO小鼠的基因型鉴定

仅在250 bp处出现条带判断为JIP1-KO纯合子(JIP1-/-)小鼠,在533 bp和250 bp处均有条带判断为JIP1-KO杂合子(JIP1+/-)小鼠,在533 bp处出现条带判断为野生型小鼠(JIP1+/+)(图 1)。

1:JIP1-/-;2:JIP1+/-;3:JIP1+/+;4:标准 图 1 PCR反应鉴定JIP1-KO小鼠基因型

2.2 JIP1-KO小鼠视网膜JIP1蛋白和mRNA的鉴定与表达

与正常野生型C57小鼠相比,JIP1-KO小鼠视网膜JIP1蛋白和mRNA表达量均明显下降,差异具有统计学意义(P < 0.01,图 2)。

A:野生型(JIP1+/+)和KO(JIP1-/-)小鼠视网膜JIP1蛋白Western blot检测结果; B : JIP1蛋白半定量分析结果(n=3);C:野生型和KO小鼠视网膜JIP1 qPCR结果(n=3);a:P < 0.01,与JIP1+/+比较 图 2 JIP1-KO小鼠JIP1蛋白和mRNA的鉴定与表达

2.3 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜厚度变化

两组视网膜HE染色形态学无明显改变(图 3),正常野生型C57小鼠视网膜全层厚度为(119.60±11.70)μm,ONL厚度为(41.17±3.59)μm,INL厚度为(21.90±2.27)μm;JIP1-KO小鼠视网膜全层厚度为(110.70±7.21)μm,ONL厚度为(36.83±2.26)μm,INL厚度为(20.15±1.89)μm,两组视网膜各层厚度比较均无统计学差异(P>0.05)。

图 3 HE染色观察野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜组织学变化

2.4 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠TUJ1蛋白表达

与野生型C57(JIP1+/+)小鼠(1.07±0.11)相比,JIP1-KO(JIP1-/-)小鼠TUJ1蛋白(1.03±0.08)表达水平差异无统计学意义(P>0.05),且均定位于视网膜神经节细胞层(图 45)。

图 4 两组视网膜TUJ1蛋白Western blot检测结果

GCL:神经节细胞层;IPL:内网层;INL:内核层;OPL:外网层;ONL:外核层 图 5 免疫荧光检测野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜TUJ1表达情况

2.5 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠PSD-95蛋白表达

与野生型C57小鼠(0.85±0.11)相比,JIP1-KO小鼠PSD-95蛋白(0.83±0.04)表达水平差异无统计学意义(P>0.05);且定位相同,均表达在视网膜外网层(图 67)。

图 6 Western blot检测两组视网膜PSD-95蛋白表达

INL:内核层;OPL:外网层;ONL:外核层 图 7 免疫荧光检测两组小鼠视网膜PSD-95表达情况

2.6 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠SYN和NF蛋白表达

与野生型C57小鼠(1.03±0.14)相比,JIP1-KO小鼠(1.04±0.15)SYN蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,图 8);两组小鼠NF蛋白均表达于视网膜外网层(图 9)。

图 8 Western blot检测两组视网膜SYN蛋白表达

INL:内核层;OPL:外网层;ONL:外核层 图 9 免疫荧光检测两组小鼠视网膜NF表达情况

3 讨论

视网膜将视觉信息传递至大脑视皮层,是形成视觉的重要组织。光线通过角膜、晶状体到达视网膜,被视锥、视杆细胞吸收,经过换能光信号转换为电信号,再由双极细胞传导至神经节细胞,最后经视神经传入大脑中枢,从而介导视觉的形成;突触是各级神经元之间连接的部位,对于信息的传递尤为关键;视觉的形成依赖于视网膜成熟完整的结构和突触间的信息传递[7]。因此,视网膜的结构、突触蛋白的表达对于视力的产生发展有着决定性的作用。

JIP1作为JIPs家族的重要一员,在大脑中高度表达,既能通过激活JNK信号通路,也可以通过介导神经元内多种物质的轴突转运,从而调节神经元的生长延长、极性发育、凋亡以及突触可塑性,在阿尔茨海默症等多种中枢神经系统疾病中有广泛研究[8-12]。然而,JIP1在眼科的研究还相对较少[13]。为明确JIP1对青年视网膜结构和突触蛋白表达的影响,本研究比较了1月龄JIP1-KO小鼠与C57野生型小鼠视网膜形态和相关突触蛋白的表达。

首先,视网膜形态学改变最直观的就是其厚度变化。因此,本研究选取了视网膜全层、INL、ONL厚度作为检测指标,结果提示:1月龄JIP-KO小鼠与C57野生型小鼠视网膜全层、INL、ONL厚度差异不显著(P>0.05)。TUJ1作为视网膜内神经节细胞的特异性标记物,其表达量可作为判断神经节细胞数量的指标,结果提示,KO小鼠与野生型小鼠TUJ1蛋白表达水平无统计学差异。SYN是定位于突触前囊泡上的糖蛋白,与突触的形成有关,其表达量和定位可准确反映突触的密度和分布,被认为是突触发生和可塑性的标志蛋白[14];PSD95是突触后膜上的骨架蛋白,参与维持视网膜中突触后膜的稳定性,在突触可塑性和蛋白的运送中发挥重要作用,其含量可反映突触的密度和数目[15];NF是构成神经元胞体和轴突的骨架蛋白的指标,可用于检测神经元的生长状态[16]。我们的研究结果表明:JIP-KO小鼠与C57野生型小鼠的SYN、PSD95表达水平无明显变化(P>0.05),且SYN、PSD95、NF均定位于外网层,说明1月龄JIP1-KO小鼠与C57野生型小鼠视杆、视锥细胞和双极、水平细胞的突触数目无明显差异,突触蛋白表达定位一致。综上,我们得出结论:JIP1基因敲除对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达影响不显著。

研究表明,脊椎动物的视网膜发育成熟受多种因素调控。在视网膜发育过程中,多种因子动态调节细胞的增殖、凋亡,最终发育成正常的组织,并具有相应功能。此外,中枢神经系统还具有突触可塑性[17],这些或许是导致单一敲除JIP1基因对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达影响不显著的原因。尽管如此,这也为我们的研究提供新的思路,在接下来的工作中,我们将选择尽可能多的时间点和功能学指标来进一步探讨JIP1对视网膜发育过程的影响,探究其中是否存在时间效应以及机体是否具有相应的代偿机制。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201901139
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

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张洁琼, 刘闻一, 林森, 叶剑.
ZHANG Jieqiong, LIU Wenyi, LIN SEN, YE Jian.
JIP1基因敲除对青年小鼠视网膜形态和突触蛋白表达的影响
Effect of JIP1 knockout on retinal structure and synaptic protein expression in young mice
第三军医大学学报, 2019, 41(6): 563-569
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(6): 563-569
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201901139

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收稿: 2019-01-17
修回: 2019-01-20

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