C-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成员[1],其传导通路对于轴突的形成与生长、突触可塑性以及树突的发育都有着重要作用[2]。JNK相互作用蛋白(JNK interacting protein, JIPs)家族是一系列在JNK信号通路中发挥作用的蛋白,有JIP1、JIP2、JIP3三个家族成员。JIP1作为JIPs家族成员之一,可以与JNK信号通路中的多种分子结合,参与调节JNK通路的激活[3]。在神经系统中,JIP1作为支架蛋白,介导多种物质的轴突转运,例如淀粉样前体蛋白、载脂蛋白E受体-2等。在海马神经元中,JIP1通过JNK信号通路调节海马神经元的突触可塑性和凋亡;在皮层神经元中,JIP1通过多种途径调节轴突生长以及神经元的极性发育,下调JIP1将导致神经元极性紊乱[4-6]。
视网膜由胚胎期的神经外胚叶发育而来,是眼睛中发育最早的组织。成熟的视网膜组织可分为10层,主要有3层神经细胞:外核层(视杆细胞、视锥细胞),内核层(双极细胞、水平细胞、无长突细胞)和神经节细胞层,以及2层突触连接:外网层(视杆细胞、视锥细胞和双极细胞、水平细胞的突触联系)和内网层(双极细胞、神经节细胞的突触联系)[7]。视网膜中各神经元的分化发育以及突触的形成对于视觉信号的传递、视觉的发生具有重要意义,JIP1作为神经发育的重要调节因子,对发育过程中视网膜结构和突触的作用目前尚无报道。因此,本研究拟通过比较C57野生型及JIP1基因敲除(JIP1-KO)小鼠的视网膜形态,神经节细胞特异性蛋白TUJ1、神经元骨架蛋白NF、突触前膜特异性标志SYN和突触后密度蛋白PSD95表达,探讨JIP1对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物1月龄C57BL/6J小鼠12只,雄性,15~20 g,购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心;1月龄JIP1-KO小鼠12只,15~20 g,雄性,购自南京大学模式动物研究所。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.1.2 主要仪器及试剂免疫荧光显微镜购自德国Leica公司,蛋白电转仪、电泳仪购于Bio-Rad公司。蛋白免疫印迹封闭液、抗体稀释液、DAPI染液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物有限公司,封闭用羊血清工作液购于中杉金桥公司,SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白酶抑制剂PMSF购自索莱宝生物技术公司,化学发光(ECL)检测试剂盒购于Thermo公司,TUJ1(ab78078)、PSD95(ab18258)、NF(ab8135)、SYN(ab32127)一抗、HRP标记山羊抗兔IgG(ab6721)、山羊抗鼠IgG二抗(ab6789)均购自Abcam公司,JIP1(sc-25267)购自SANTA CRUZ公司,GAPDH(AP0063)购自Bioworld公司,Cy3标记的山羊抗鼠IgG二抗(#8890)、山羊抗兔IgG二抗(#4412)购自美国CST公司。
1.2 方法 1.2.1 JIP1基因敲除小鼠的基因型鉴定剪取3~4周龄小鼠的尾端约2 mm置于Eppendorf(EP)管中,加入50 μL新鲜组织消化液,剪碎组织,55 ℃金属浴消化15 min,震荡,直至组织块完全消化;12 000 r/min离心10 min,取上清置于98 ℃金属浴中孵育10 min灭活消化液中的蛋白酶活性。制得的DNA模板-20 ℃保存备用。按照Sangon Biotech公司设计的引物:JIP1 A/GJIP1.11 5′-CGCGGTCTCAGGTGAGCAA-3′,JIP1 A/GJIP1.12 5′-CTGACTAGGCCTGTAAGAC-3′,JIP1 C/GKP1 5′-CTCCAGACTGCCTTGGGAAAA-3′,进行聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应体系(20 μL): Premix Taq 10 μL,引物1.5 μL,模板DNA 1.5 μL,加灭菌水补足体积。反应条件为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环,最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存备用。PCR反应终产物8 μL进行1.5%琼脂糖凝胶鉴定JIP1基因敲除小鼠基因型。
1.2.2 JIP1基因敲除小鼠JIP1 mRNA的表达与鉴定选择JIP1-KO小鼠,用野生型C57小鼠作为对照,每组3只小鼠。将小鼠颈椎脱臼处死后,分离视网膜组织。根据Trizol试剂说明书提取两组样本总RNA,紫外分光光度法测定RNA浓度后,用反转录试剂盒(TaKaRa)在PCR仪进行反转录,得到cDNA。qPCR试剂盒(TaKaRa)进行PCR,两步法经Bio-Rad CFX96荧光定量系统进行荧光检测,利用2-△△Ct法对结果进行分析,实验设置3个复孔。引物由Sangon Biotech公司设计合成。JIP1基因上游:5′-GGCCTACCACGCTC- AACCTT-3′,下游: 5′-ACACACGGTCCTGCCAACTG-3′;内参β-actin基因上游: 5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′,下游: 5′-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3′。
1.2.3 免疫荧光观察视网膜中的蛋白表达分布取新鲜眼球于4%多聚甲醛固定24 h,30%蔗糖脱水2 h,冰冻切片机中包埋,切片,厚度8 μm。羊血清封闭液封闭30 min,设立阴性对照后,加入一抗(稀释比例PSD95 1 :1 000,TUJ1 1 :500,NF 1 :2 500)于4 ℃孵育过夜,次日37 ℃恒温箱复温0.5 h,PBS溶液洗3次,每次5 min。加入二抗(1 :300)37 ℃恒温箱孵育1.5 h,PBS溶液洗3次,每次5 min。DAPI染色5 min,PBS清洗30 min。封片后于显微镜下观察。
1.2.4 HE染色观察视网膜组织每组3只小鼠,视网膜冰冻切片PBS洗3次,每次5 min,苏木精染色3 min,水洗5 min,盐酸乙醇分化5 s,至载玻片蓝色消失,水洗5 min,酚红染色40 s,水洗5 min,二甲苯透明2 min,吹干,中性树脂封片。光学显微镜下观察视网膜组织学变化,并用Image J软件测量内、外核层以及视网膜全层厚度。
1.2.5 Western blot检测蛋白水平在不同组(3只小鼠/组)的视网膜中加入RIPA蛋白裂解液,提取总蛋白,用BCA法测定各组蛋白含量,配平浓度后加入蛋白上样缓冲液于100 ℃水浴锅中煮沸15 min。制备10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶,每孔加入等量的蛋白样品,电泳分离后转至PVDF膜,室温下用封闭液封闭1.5 h,4 ℃摇床中一抗(稀释比例分别为GAPDH 1 :1 000,JIP1 1 :300,PSD95 1 :500,TUJ1 1 :1 000,SYN 1 :10 000)孵育过夜。次日,TBST洗膜3次,每次10 min,室温摇床孵育HRP标记二抗(稀释比例1 :5 000)1.5 h。TBST洗膜3次,每次10 min,加入ECL化学发光液曝光显影,Image J软件测量各条带灰度值,以待测蛋白与内参的灰度值比值表示蛋白的相对表达量。
1.3 统计学分析应用SPSS19.0统计软件对实验数据进行分析,每项实验至少重复3次,数据以x±s表示,两组间比较采用t检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 JIP1-KO小鼠的基因型鉴定仅在250 bp处出现条带判断为JIP1-KO纯合子(JIP1-/-)小鼠,在533 bp和250 bp处均有条带判断为JIP1-KO杂合子(JIP1+/-)小鼠,在533 bp处出现条带判断为野生型小鼠(JIP1+/+)(图 1)。
2.2 JIP1-KO小鼠视网膜JIP1蛋白和mRNA的鉴定与表达
与正常野生型C57小鼠相比,JIP1-KO小鼠视网膜JIP1蛋白和mRNA表达量均明显下降,差异具有统计学意义(P < 0.01,图 2)。
2.3 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠视网膜厚度变化
两组视网膜HE染色形态学无明显改变(图 3),正常野生型C57小鼠视网膜全层厚度为(119.60±11.70)μm,ONL厚度为(41.17±3.59)μm,INL厚度为(21.90±2.27)μm;JIP1-KO小鼠视网膜全层厚度为(110.70±7.21)μm,ONL厚度为(36.83±2.26)μm,INL厚度为(20.15±1.89)μm,两组视网膜各层厚度比较均无统计学差异(P>0.05)。
2.4 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠TUJ1蛋白表达
与野生型C57(JIP1+/+)小鼠(1.07±0.11)相比,JIP1-KO(JIP1-/-)小鼠TUJ1蛋白(1.03±0.08)表达水平差异无统计学意义(P>0.05),且均定位于视网膜神经节细胞层(图 4、5)。
2.5 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠PSD-95蛋白表达
与野生型C57小鼠(0.85±0.11)相比,JIP1-KO小鼠PSD-95蛋白(0.83±0.04)表达水平差异无统计学意义(P>0.05);且定位相同,均表达在视网膜外网层(图 6、7)。
2.6 野生型C57小鼠和JIP1-KO小鼠SYN和NF蛋白表达
与野生型C57小鼠(1.03±0.14)相比,JIP1-KO小鼠(1.04±0.15)SYN蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,图 8);两组小鼠NF蛋白均表达于视网膜外网层(图 9)。
3 讨论
视网膜将视觉信息传递至大脑视皮层,是形成视觉的重要组织。光线通过角膜、晶状体到达视网膜,被视锥、视杆细胞吸收,经过换能光信号转换为电信号,再由双极细胞传导至神经节细胞,最后经视神经传入大脑中枢,从而介导视觉的形成;突触是各级神经元之间连接的部位,对于信息的传递尤为关键;视觉的形成依赖于视网膜成熟完整的结构和突触间的信息传递[7]。因此,视网膜的结构、突触蛋白的表达对于视力的产生发展有着决定性的作用。
JIP1作为JIPs家族的重要一员,在大脑中高度表达,既能通过激活JNK信号通路,也可以通过介导神经元内多种物质的轴突转运,从而调节神经元的生长延长、极性发育、凋亡以及突触可塑性,在阿尔茨海默症等多种中枢神经系统疾病中有广泛研究[8-12]。然而,JIP1在眼科的研究还相对较少[13]。为明确JIP1对青年视网膜结构和突触蛋白表达的影响,本研究比较了1月龄JIP1-KO小鼠与C57野生型小鼠视网膜形态和相关突触蛋白的表达。
首先,视网膜形态学改变最直观的就是其厚度变化。因此,本研究选取了视网膜全层、INL、ONL厚度作为检测指标,结果提示:1月龄JIP-KO小鼠与C57野生型小鼠视网膜全层、INL、ONL厚度差异不显著(P>0.05)。TUJ1作为视网膜内神经节细胞的特异性标记物,其表达量可作为判断神经节细胞数量的指标,结果提示,KO小鼠与野生型小鼠TUJ1蛋白表达水平无统计学差异。SYN是定位于突触前囊泡上的糖蛋白,与突触的形成有关,其表达量和定位可准确反映突触的密度和分布,被认为是突触发生和可塑性的标志蛋白[14];PSD95是突触后膜上的骨架蛋白,参与维持视网膜中突触后膜的稳定性,在突触可塑性和蛋白的运送中发挥重要作用,其含量可反映突触的密度和数目[15];NF是构成神经元胞体和轴突的骨架蛋白的指标,可用于检测神经元的生长状态[16]。我们的研究结果表明:JIP-KO小鼠与C57野生型小鼠的SYN、PSD95表达水平无明显变化(P>0.05),且SYN、PSD95、NF均定位于外网层,说明1月龄JIP1-KO小鼠与C57野生型小鼠视杆、视锥细胞和双极、水平细胞的突触数目无明显差异,突触蛋白表达定位一致。综上,我们得出结论:JIP1基因敲除对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达影响不显著。
研究表明,脊椎动物的视网膜发育成熟受多种因素调控。在视网膜发育过程中,多种因子动态调节细胞的增殖、凋亡,最终发育成正常的组织,并具有相应功能。此外,中枢神经系统还具有突触可塑性[17],这些或许是导致单一敲除JIP1基因对青年小鼠视网膜结构和突触蛋白表达影响不显著的原因。尽管如此,这也为我们的研究提供新的思路,在接下来的工作中,我们将选择尽可能多的时间点和功能学指标来进一步探讨JIP1对视网膜发育过程的影响,探究其中是否存在时间效应以及机体是否具有相应的代偿机制。
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