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低强度脉冲超声调控滑膜巨噬细胞极化抑制关节滑膜炎
张斌, 倪振洪, 杨鹏, 旷梁, 欧阳俊杰, 谢杨丽, 蒋宛凌, 刘汨, 杜晓兰, 陈林     
400042 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)野战外科研究所:创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,创伤实验室,战创伤康复研究室,骨代谢与修复中心
[摘要] 目的 探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)抑制关节滑膜炎的作用和可能机制。方法 采用小鼠内侧半月板不稳定(destabilization of medial meniscus,DMM)关节炎模型。21只小鼠按随机数字表法分为3组:对照组、DMM组和DMM+LIPUS组。组织学分析各组膝关节滑膜病理改变,统计滑膜中iNOS或CD206阳性细胞占F4/80阳性巨噬细胞的比例。将体外培养的THP-1细胞系分为对照组、LIPUS组、LPS(lipopolysaccharide)组和LPS+LIPUS组,将Raw 264.7细胞分为LPS组和LPS+LIPUS组。采用荧光定量PCR技术检测IL-1β、TNF-α、IL-10和精氨酸酶1(Arg1)等巨噬细胞极化相关基因的表达, Western blot检测p-JNK和p-NF-κB p65蛋白表达水平;激光共聚焦显微镜观察THP-1细胞NF-κBp65核转位状态。结果 在DMM关节炎模型中,LIPUS处理后的小鼠滑膜的厚度比未处理组变薄(P < 0.05),滑膜中M1型巨噬细胞比例减少(P < 0.05),M2型巨噬细胞比例增加(P < 0.05);在LPS诱导的炎症条件下,LIPUS处理抑制THP-1和Raw 264.7细胞的M1型巨噬细胞相关基因的表达,同时促进M2型巨噬细胞相关基因的表达,抑制了p-JNK和p-NF-κB p65的蛋白表达水平(P < 0.05),LIPUS抑制THP-1细胞NF-κB p65的核转位(P < 0.05)。结论 LIPUS可以缓解关节滑膜炎,该作用可能与JNK和NF-κB通路介导的滑膜巨噬细胞极化有关。
[关键词] 低强度脉冲超声     关节炎     巨噬细胞     极化    
Low-intensity pulsed ultrasound suppresses synovitis by modulating polarization of synovial macrophages in mice with osteoarthritis
ZHANG Bin, NI Zhenhong, YANG Peng, KUANG Liang, OUYANG Junjie, XIE Yangli, JIANG Wanling, LIU Mi, DU Xiaolan, CHEN Lin     
State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Labratory of Trauma, Department of Rehabilitation Medicine for War Injuries, Center of Bone Metabolism and Repair, Institute of Surgery Research, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042, China
[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) on synovitis in a mouse model of osteoarthritis and explore the possible mechanism. Methods We assessed the therapeutic effect of LIPUS on synovitis in a mouse model of destabilization of medial meniscus (DMM). The histopathology of the synovium of the knee joint was examined in 7 mice with DMM (model group), 7 normal mice (control group) and 7 mice with DMM treated with LIPUS. The proportion of iNOS- and CD206-positive cells in F4/80-positive macrophages in the synovium was detected. Cultured THP-1 macrophages were divided into control group, LIPUS group, lipopolysaccharide (LPS) group and LPS+LIPUS group, and Raw 264.7 cells were divided into LPS group and LPS+LIPUS group with corresponding treatments. The mRNA levels of polarization-related indexes (IL-1β, TNF-α, IL-10 and Arg1) were detected using real-time quantitative PCR after the treatments, and the protein levels of p-JNK and p-NF-κB p65 were detected using Western blotting. Confocal laser scanning microscopy was used to observe the nuclear translocation of nuclear factor-κB (NF-κB) in THP-1 cells after LPS or LPS+LIPUS treatment. Results In the mouse models of DMM, treatment with LIPUS significantly reduced the thicknesses of the synovium (P < 0.05), decreased the proportion of M1 macrophages and upregulated the proportion of M2 macrophages in the synovium (P < 0.05). In THP-1 and Raw 264.7 macrophages stimulated with LPS, LIPUS treatment significantly lowered IL-1β and TNF-α levels but increased IL-10 and Arg1 levels (P < 0.05). LIPUS also decreased the protein levels of p-JNK and p-NF-κB p65 in LPS-stimulated macrophages (P < 0.05) and suppressed LPS-induced nuclear translocation of NF-κB (P < 0.05). Conclusion LIPUS produces anti-inflammatory effects on the synovium in the mouse model of osteoarthritis possibly by modulating the polarization of synovial macrophages through the JNK and NF-κB signaling pathways.
[Key words] low-intensity pulsed ultrasound     osteoarthritis     macrophages     polarization    

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的退行性骨关节疾病,其病理发展与机械损伤及炎症反应密切相关[1]。OA患者主要的临床症状有关节肿胀、疼痛以及关节活动度受限等。OA的治疗目的是防止关节软骨进一步退化,缓解疼痛,改善关节活动能力等[2]。目前OA的治疗主要有全身服用非甾体类抗炎药物或者关节局部注射药物等,晚期患者往往需要关节置换[3-4]。此外,物理治疗也广泛应用于临床上缓解关节炎症状,可以改善由于半月板撕裂导致的OA患者的临床症状,甚至可以作为一种替代早期手术的手段用来缓解关节症状[5]。因此,开发新的治疗手段以及建立物理、药物治疗的综合方法对治疗OA有重要意义。

低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一种无创、安全的物理治疗手段,在1994年被PDA批准用于骨折的保守治疗[6]。大量临床和基础研究提示,LIPUS能缓解膝关节软骨退变,是一种潜在的治疗膝关节OA的手段[7]。最新一项荟萃分析提示:LIPUS可以缓解OA患者的疼痛,改善膝关节的功能,并且无明显副作用[8]。进一步研究表明,LIPUS可能通过促进软骨细胞增殖和软骨基质分泌缓解关节炎[7]。此外,在佐剂诱导的小鼠关节炎模型中,LIPUS可以降低滑膜中炎症因子的表达,减少炎症细胞浸润[9-10]。在脂多糖诱导U937巨噬细胞体外炎症模型中,LIPUS能抑制IL-6和IL-8等炎症因子的释放[11]。LIPUS可能通过抗炎作用治疗OA,其具体的细胞、分子机制还有待进一步研究。

本研究采用内侧半月板不稳定(destabilisation of medial meniscus,DMM)手术制作创伤后骨关节炎小鼠模型,实验结果显示LIPUS处理可以缓解关节炎滑膜表型,并进一步探究LIPUS对创伤后骨关节炎滑膜巨噬细胞极化的影响。利用THP-1和Raw 264.7细胞系在体外模型中探究了LIPUS对巨噬细胞极化的影响。文献[12-13]报道,NF-κB和JNK信号通路的激活能调节巨噬细胞的极化,本课题进一步研究LIPUS对这些通路的影响,旨在探索LIPUS治疗OA的新机制。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

雄性3月龄C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物技术有限公司,饲养于陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院实验动物中心。THP-1细胞系和Raw 264.7细胞系购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC);α-MEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;苏木精、DAPI、鼠抗ACTB/β-actin抗体、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)、脂多糖购自美国Sigma公司;伊红试剂购自北京中杉公司;逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;大鼠抗F4/80抗体、兔抗iNOS抗体、兔抗CD206抗体、驴抗兔荧光二抗、驴抗大鼠荧光二抗购自美国Abcam公司;兔抗p-JNK抗体, 兔抗JNK抗体, 兔抗NF-κB p65抗体, 兔抗NF-κB p-p65抗体购自美国CST公司;冰冻切片机、共聚焦显微镜购自德国Leica公司;显微镜购自日本Olympus公司;定量PCR仪器购自美国Agilent公司;低强度脉冲超声波治疗仪为Exogen 4000(美国),参数:频率1.5 MHz,声强30 mW/cm2,占空比20%。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立

DMM手术采用文献[14]报道的常规方法,小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)麻醉,右膝关节备皮,酒精消毒,切开膝关节处皮肤暴露髌韧带,镊子掀开髌韧带暴露髌下脂肪垫,用镊子清除部分脂肪,切断连接内侧半月板胫骨的韧带,髌韧带复位缝合,皮肤缝合。待小鼠苏醒,给予自由活动。小鼠按随机数字表法分为3组:对照组(n=7,不建模)、DMM组(n=7,建立DMM模型)、DMM+LIPUS组(n=7,建立DMM模型后给予LIPUS治疗)。实验过程中,对照组和DMM组分别死亡1只小鼠,未纳入统计学处理。

1.2.2 LIPUS治疗流程

手术后小鼠休息1 d,为了防止小鼠膝关节和LIPUS探头接触不良,LIPUS治疗前麻醉固定小鼠,刮除右膝关节毛发,皮肤涂上耦合胶,LIPUS探头紧贴膝关节。DMM+LIPUS组小鼠每天采用LIPUS治疗20 min,每周6次,具体见图 1A。DMM均在同一时间点和DMM+LIPUS进行麻醉。DMM手术2周后小鼠取材。4%多聚甲醛固定右膝关节12 h,15% EDTA脱钙14 d,30%蔗糖脱水,OCT包埋,冰冻切片。

A:LIPUS治疗流程;B:HE染色观察各组小鼠膝关节滑膜的变化 图 1 LIPUS对DMM手术小鼠膝关节滑膜的影响

1.2.3 HE染色方法

冰冻切片置于37 ℃温箱中30 min,PBS洗2遍后,苏木精染色3 min,自来水浸泡3 min,伊红染色10 s,使用95%乙醇脱色,最后封片并采集图片。选取每只小鼠右膝关节滑膜最厚部位,用Image J软件测量滑膜厚度。

1.2.4 免疫荧光染色方法

冰冻切片放置在37 ℃温箱中30 min,PBS清洗2遍,封闭液封闭1 h后,加入一抗4 ℃过夜,清洗2遍后荧光二抗孵育1 h,PBS清洗3遍后加入DAPI染核,PBS清洗后封片, 共聚焦显微镜下拍照。培养的细胞免疫荧光染色采取相似的方法。

1.2.5 细胞培养和处理

THP-1和Raw 264.7细胞均培养于α-MEM培养基中,培养基中含有10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞放于37 ℃、5% CO2孵育箱培养。THP-细胞使用100 ng/mL PMA处理72 h,诱导分化为成熟的巨噬细胞。100 ng/mL的LPS处理巨噬细胞12 h,使其分化为M1型巨噬细胞。LIPUS探头涂上耦合剂,紧贴培养皿底部,打开LIPUS开关,处理20 min,1 h后收集细胞。将THP-1细胞系分为对照组、LIPUS组、LPS(lipopolysaccharide)组和LPS+LIPUS组,将Raw 264.7细胞分为LPS组和LPS+LIPUS组,分别进行后续研究。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测

依据说明书上使用TRIzol法提取细胞总RNA,反转RNA后用SYBR Green RT-PCR试剂盒进行定量PCR检测。GAPDH引物上游:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′,下游:5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′;IL-1β引物上游:5′-GCCATGGACAAGCTGAGGAAG-3′,下游:5′-GTG-CTGATGTACCAGTTGGG-3′;TNF-α引物上游:5′-CA-GCCTCTTCTCCTTCCTGA-3′,下游:5′-CAGCTTGAGG-GTTTGCTACA-3′;IL-10引物上游:5′-GACTTTAAGG-GTTACCTGGGTTG-3′,下游:5′-TCACATGCGCCTTGA-TGTCTG-3′;Arg1引物上游:5′-ACGGAAGAATCAGCCTGGTG-3′,下游:5′-GTCCACGTCTCTCAAGCCAA-3′。GAPDH作为内参标准化数据。

1.2.7 Western blot检测

细胞蛋白表达水平细胞裂解液提取细胞总蛋白,30 μg的蛋白上样于12%的SDS-PAGE胶进行电泳,电泳后蛋白转移到PVDF膜中,用5%的脱脂牛奶常温封闭PVDF膜1 h,加入一抗4 ℃孵育过夜,PBST清洗3遍后加入二抗37 ℃孵育1 h。PBST洗膜3遍,用ECL化学发光法显影,采用Bio-Rad图像分析系统进行分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 7进行统计学分析,数据以x±s表示,两组间比较使用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Post Hoc检验比较组间差异, 检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 LIPUS缓解DMM手术导致的滑膜异常增生

各组小鼠膝关节滑膜的变化见图 1B。对照组小鼠膝关节滑膜厚度为(14.57±2.48)μm,小鼠DMM手术后2周的滑膜厚度为(73.17±5.83)μm,比未做手术对照组显著增加(P < 0.01),并且可以看到滑膜中有大量巨噬细胞浸润。2周的LIPUS治疗后滑膜厚度为(54.10±4.84)μm,较DMM组显著降低(P < 0.05)。说明LIPUS治疗缓解了DMM手术导致的早期滑膜增生。

2.2 LIPUS调节PTOA小鼠滑膜巨噬细胞的极性

DMM手术增加了小鼠膝关节滑膜F4/80阳性巨噬细胞中iNOS阳性细胞即M1型巨噬细胞的比例(P < 0.05, 表 1图 2A)。与DMM组比较,LIPUS降低了iNOS阳性巨噬细胞比例(P < 0.05)。DMM手术小鼠的滑膜CD206阳性M2型巨噬细胞占总巨噬细胞的比例和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),而LIPUS处理组的滑膜巨噬细胞CD206阳性比例较单纯DMM手术组增多(P < 0.05,表 1图 2B)。结果提示,DMM手术2周后的滑膜巨噬细胞大部分极化为M1型巨噬细胞,而2周的LIPUS治疗处理可降低M1型巨噬细胞比例,增加了M2型巨噬细胞的比例。

M:半月板;T:胫骨;S:滑膜;虚线为滑膜组织的边界线;白框为局部放大区域A:小鼠右膝关节F4/80和iNOS共染;B:小鼠右膝关节F4/80和CD206共染 图 2 免疫荧光检测LIPUS对DMM小鼠滑膜巨噬细胞极化的影响

表 1 各组小鼠膝关节滑膜F4/80阳性巨噬细胞中iNOS和CD206阳性细胞比例 [n=4, (x±s)%]
组别 iNOS阳性细胞比例 CD206阳性细胞比例
对照组 46.44±2.00 51.39±6.94
DMM组 76.68±4.75a 44.86±2.86
DMM+LIPUS组 41.39±3.39b 65.00±2.50b
a: P < 0.05, 与对照组比较;b: P < 0.05, 与DMM组比较

2.3 LIPUS对THP-1和RAW264.7巨噬细胞极化相关基因表达的影响

PMA诱导分化72 h后的THP-1细胞中,LIPUS处理组的IL-1β和TNF-α mRNA表达量和对照组相比有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,LIPUS处理组的IL-10和Arg1 mRNA表达量增加(P < 0.05)。LPS处理PMA诱导分化的THP-1细胞12 h后,和LPS组相比,LIPUS+LPS组的IL-1β和TNF-α的mRNA表达量减少(P < 0.05),而IL-10和Arg1的mRNA表达量增加(P < 0.05)。LPS处理Raw 264.7细胞12 h,LIPUS+LPS组的IL-1β和TNF-α mRNA表达量比LPS组减少(P < 0.05),IL-10和Arg1的表达量较LPS组增加(P < 0.05, 图 3)。

A:THP-1细胞IL-1β mRNA水平的变化  1:对照组;2:LIPUS组;3:LPS组;4:LPS+LIPUS组;a:P < 0.05,与LPS组比较;B:THP-1细胞TNF-α mRNA的变化  1:对照组;2:LIPUS组;3:LPS组;4:LPS+LIPUS组;a:P < 0.05,与LPS组比较;C:THP-1细胞IL-10 mRNA的变化  1:对照组;2:LIPUS组;3:LPS组;4:LPS+LIPUS组;a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.05,与LPS组比较;D:THP-1细胞Arg 1 mRNA的变化  1:对照组;2:LIPUS组;3:LPS组;4:LPS+LIPUS组;a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.05,与LPS组比较;E:Raw264.7细胞IL-β、TNF-α、IL-10和Arg1的mRNA的变化  a:P < 0.05,与LPS组比较 图 3 LIPUS对THP-1和Raw264.7巨噬细胞系极化相关基因的mRNA水平影响

2.4 LIPUS抑制活化巨噬细胞JNK和NF-κB信号通路

与对照组比较,LIPUS处理对小鼠腹腔来源的Raw 264.7细胞的磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白表达量没有显著影响(P>0.05), 而LIPUS能显著下调LPS导致的p-JNK和p-NF-κB p65的高蛋白表达水平(P < 0.05,图 4)。PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞中,LIPUS组与对照组比较,p-JNK和JNK蛋白表达量的比值差异无统计学意义,而LPS+LIPUS组与LPS组比较,p-JNK和JNK蛋白表达量的比值有下降趋势(P>0.05, 图 4)。说明LPS炎症刺激条件下,LIPUS抑制了JNK信号通路,同时也抑制了NF-κB p65的磷酸化。利用免疫荧光染色,发现DMM手术增加了小鼠滑膜组织中p-JNK和p-NF-κB p65的表达水平;而LIPUS治疗后的小鼠,p-JNK和p-NF-κB p65在滑膜中的表达水平较DMM组显著降低(P < 0.05,图 5, 表 2)。

A、B:Raw 264.7细胞的Western blot检测及半定量分析结果  1:对照组;2、3:LIPUS组;4:LPS组;5、6:LPS+LIPUS组a:P < 0.05,与LPS组比较;C、D:THP-1细胞的Western blot检测及半定量分析结果   1:对照组;2:LIPUS组;3:LPS组;4:LPS+LIPUS组 图 4 Western blot检测各组p-JNK和p-NF-κB p65蛋白的表达

M:半月板;T:胫骨;F:股骨;S:滑膜;白色虚线为滑膜组织边界线A:小鼠右膝关节F4/80和p-JNK共染;B:小鼠右膝关节F4/80和p-NF-κB p65共染 图 5 LIPUS对各组p-JNK和p-NF-κB p65蛋白表达的影响

表 2 各组小鼠膝关节滑膜F4/80阳性巨噬细胞中p-JNK和p-NF-κB p65阳性细胞比例 [n=4, (x±s)%]
组别 p-JNK阳性细胞比例 p-NF-κB p65阳性细胞比例
对照组 15.05±1.01 18.87±1.58
DMM组 53.17±2.47a 54.48±2.67a
DMM+LIPUS组 22.58±1.43b 14.51±1.59b
a: P < 0.05, 与对照组比较;b: P < 0.05, 与DMM组比较

2.5 LIPUS抑制LPS诱导的THP-1细胞NF-κB p65入核

共聚焦显微镜观察可见,LPS+LIPUS组核内NF-κB p65阳性THP-1细胞数(36.50±2.33)较LPS组(74.08±3.35)显著减少(P < 0.01)。说明在LPS诱导的炎症环境下,LIPUS可以抑制THP-1细胞NF-κB p65进入细胞核,见图 6

:示典型核内NF-κB p65阳性细胞 图 6 LIPUS对THP-1细胞NF-κB p65入核的影响

3 讨论

骨性关节炎患者在临床上表现为关节疼痛、活动受限等,晚期患者只能行关节置换术,可导致劳动力丧失,给社会带来严重的经济负担。因此OA的预防以及延缓早期OA进程显得尤为重要[1]。临床上的非手术治疗包括非甾体类药物、激素、生物因子等[15]。研究表明无创的物理治疗也可有效缓解创伤导致的关节炎症状,如疼痛和关节活动受限[5]。LIPUS是临床上常用的非侵入性物理治疗方法,临床研究提示其可缓解OA患者症状[8]。OA患者的疼痛症状与滑膜炎密切相关,滑膜炎是治疗OA的靶向组织[16]。本研究利用DMM手术小鼠模型模拟创伤后骨关节炎,发现2周的LIPUS处理可缓解OA引起的小鼠膝关节滑膜的厚度,提示LIPUS的治疗对OA的滑膜炎有一定的抑制作用。

滑膜炎表现为滑膜肥厚、畸形生长,血管增生与炎症反应,89%的膝关节OA患者有严重的滑膜炎[17]。膝关节的滑膜组织中主要有两种细胞:成纤维细胞和巨噬细胞。在OA患者关节局部可以看到大量活化的巨噬细胞聚集[18]。活化的巨噬细胞可分泌大量可溶性促炎因子,如IL-1β,TNF-α等,加速了OA的病理进程[19]。F4/80是巨噬细胞的特异性标志物,本研究中也发现DMM手术2周后的小鼠滑膜中,有大量F4/80阳性的巨噬细胞浸润。巨噬细胞具有异质性,在不同的微环境刺激下,巨噬细胞可以被极化为经典活化的巨噬细胞(即M1型巨噬细胞)和替代性活化的巨噬细胞(即M2型巨噬细胞)[20]。近期研究提示OA患者的滑膜中聚集着大量的M1型巨噬细胞,而M2型巨噬细胞在滑膜中的比例较少[21]。M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例与OA的严重程度正相关[22]。促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化可能是缓解OA滑膜炎的一种新策略[23]。研究报道,在急性肌肉组织损伤的大鼠模型中,LIPUS处理减少了损伤肌肉部位M1型巨噬细胞,而增加了M2型巨噬细胞的数量[24]。iNOS是M1型巨噬细胞的标志物,CD206是M2型巨噬细胞标志物。本研究发现,LIPUS可减少DMM手术后2周滑膜中iNOS阳性的巨噬细胞数量,增加CD206阳性巨噬细胞数, 提示LIPUS抑制OA滑膜中M1型巨噬细胞的极化,而促进M2型巨噬细胞极化可能是LIPUS缓解OA的一种重要机制。

本研究进一步用体外细胞模型探究LIPUS对巨噬细胞极化的影响,发现在正常培养条件下,LIPUS对THP-1和Raw 264.7巨噬细胞的M1型标志物IL-β和TNF-α没有明显影响,但可以促进巨噬细胞M2型标志物IL-10和Arg1的表达。LPS是激活巨噬细胞向M1型极化的刺激因子[25]。本研究进一步利用LPS诱导巨噬细胞极化,结果提示LIPUS抑制了M1型标志物的表达,而促进了M2型标志物的表达,在炎症刺激条件下,LIPUS对巨噬细胞的极化作用和体内实验的结果吻合。总之,研究的结果提示LIPUS可能通过促进滑膜M2型巨噬细胞和M1型巨噬细胞的比例缓解了OA的进程。

巨噬细胞的极化和JNK通路密切相关,使用JNK的抑制剂可以抑制巨噬细胞M1相关标志物的蛋白表达而促进M2型巨噬细胞的标志物表达[26]。NF-κB信号通路的活化也能促进M1型巨噬细胞的活化,导致炎症反应[27]。LIPUS调节巨噬细胞极化的具体分子机制并不完全清楚。本研究发现,在巨噬细胞中,LIPUS可以下调LPS诱导的磷酸化JNK和磷酸化p65蛋白的高表达,提示LIPUS抑制了炎症条件下JNK和NF-κB信号通路。有研究表明LIPUS能抑制LPS诱导成骨细胞的NF-κB核转位[28],本研究同样发现LIPUS抑制了LPS处理THP-1巨噬细胞所致的NF-κB p65入核,进一步提示LIPUS能抑制炎症条件下NF-κB信号通路的活化。总之,在炎症条件下,LIPUS可能通过抑制JNK和NF-κB信号通路的活化,进而抑制M1型巨噬细胞的极化,而促进巨噬细胞向M2型极化。

本研究在DMM手术模型中验证了LIPUS抑制滑膜炎,进一步用新的动物模型证实了LIPUS具有抗炎的功能。以往有研究表明LIPUS可以调控急性肌肉组织损伤部位巨噬细胞的极化[24],本研究在DMM手术模型中发现LIPUS能调控滑膜中巨噬细胞的极化状态,这可能也是LIPUS治疗OA的一种新的机制。本课题在体外水平研究了LIPUS对活化的巨噬细胞极化的影响,发现LIPUS能减少M1型巨噬细胞的标志物表达,而增加M2型巨噬细胞的标志物表达。在机制研究方面,本课题在体内外水平发现LIPUS能抑制炎症状态下的JNK和NF-κB信号通路,与之前在肌肉损伤模型中的报道结果一致[29],而文献[26-27]报道这两条通路均可以调控巨噬细胞的极化,因此LIPUS可能通过该机制调控巨噬细胞的极化。综上所述,LIPUS可通过抑制滑膜巨噬细胞向M1型极化,促进向M2型极化而抑制OA滑膜炎,该调控作用可能与LIPUS抑制JNK和NF-κB信号通路有关,该研究为LIPUS在临床上治疗OA提供了理论基础。

本研究存在一定局限性:本课题发现LIPUS可以降低炎症状态下巨噬细胞中JNK和NF-κB p65的磷酸化水平,抑制NF-κB p65入核,但LIPUS调控JNK和NF-κB信号通路具体分子机制需要下一步研究。LIPUS采用治疗骨折的临床参数,而LIPUS治疗OA的最优参数(频率、强度、占空比、处理时间)组合需要进一步研究,以达到最佳治疗效果。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201901091
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

张斌, 倪振洪, 杨鹏, 旷梁, 欧阳俊杰, 谢杨丽, 蒋宛凌, 刘汨, 杜晓兰, 陈林.
ZHANG Bin, NI Zhenhong, YANG Peng, KUANG Liang, OUYANG Junjie, XIE Yangli, JIANG Wanling, LIU Mi, DU Xiaolan, CHEN Lin.
低强度脉冲超声调控滑膜巨噬细胞极化抑制关节滑膜炎
Low-intensity pulsed ultrasound suppresses synovitis by modulating polarization of synovial macrophages in mice with osteoarthritis
第三军医大学学报, 2019, 41(8): 747-756
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(8): 747-756
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201901091

文章历史

收稿: 2019-01-11
修回: 2019-02-15

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