骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的退行性骨关节疾病，其病理发展与机械损伤及炎症反应密切相关[1]。OA患者主要的临床症状有关节肿胀、疼痛以及关节活动度受限等。OA的治疗目的是防止关节软骨进一步退化，缓解疼痛，改善关节活动能力等[2]。目前OA的治疗主要有全身服用非甾体类抗炎药物或者关节局部注射药物等，晚期患者往往需要关节置换[3-4]。此外，物理治疗也广泛应用于临床上缓解关节炎症状，可以改善由于半月板撕裂导致的OA患者的临床症状，甚至可以作为一种替代早期手术的手段用来缓解关节症状[5]。因此，开发新的治疗手段以及建立物理、药物治疗的综合方法对治疗OA有重要意义。
低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一种无创、安全的物理治疗手段，在1994年被PDA批准用于骨折的保守治疗[6]。大量临床和基础研究提示，LIPUS能缓解膝关节软骨退变，是一种潜在的治疗膝关节OA的手段[7]。最新一项荟萃分析提示：LIPUS可以缓解OA患者的疼痛，改善膝关节的功能，并且无明显副作用[8]。进一步研究表明，LIPUS可能通过促进软骨细胞增殖和软骨基质分泌缓解关节炎[7]。此外，在佐剂诱导的小鼠关节炎模型中，LIPUS可以降低滑膜中炎症因子的表达，减少炎症细胞浸润[9-10]。在脂多糖诱导U937巨噬细胞体外炎症模型中，LIPUS能抑制IL-6和IL-8等炎症因子的释放[11]。LIPUS可能通过抗炎作用治疗OA，其具体的细胞、分子机制还有待进一步研究。
本研究采用内侧半月板不稳定(destabilisation of medial meniscus，DMM)手术制作创伤后骨关节炎小鼠模型，实验结果显示LIPUS处理可以缓解关节炎滑膜表型，并进一步探究LIPUS对创伤后骨关节炎滑膜巨噬细胞极化的影响。利用THP-1和Raw 264.7细胞系在体外模型中探究了LIPUS对巨噬细胞极化的影响。文献[12-13]报道，NF-κB和JNK信号通路的激活能调节巨噬细胞的极化，本课题进一步研究LIPUS对这些通路的影响，旨在探索LIPUS治疗OA的新机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂雄性3月龄C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物技术有限公司，饲养于陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院实验动物中心。THP-1细胞系和Raw 264.7细胞系购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)；α-MEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；苏木精、DAPI、鼠抗ACTB/β-actin抗体、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、脂多糖购自美国Sigma公司；伊红试剂购自北京中杉公司；逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；大鼠抗F4/80抗体、兔抗iNOS抗体、兔抗CD206抗体、驴抗兔荧光二抗、驴抗大鼠荧光二抗购自美国Abcam公司；兔抗p-JNK抗体, 兔抗JNK抗体, 兔抗NF-κB p65抗体, 兔抗NF-κB p-p65抗体购自美国CST公司；冰冻切片机、共聚焦显微镜购自德国Leica公司；显微镜购自日本Olympus公司；定量PCR仪器购自美国Agilent公司；低强度脉冲超声波治疗仪为Exogen 4000(美国)，参数：频率1.5 MHz，声强30 mW/cm2，占空比20%。
1.2 实验方法 1.2.1 动物模型的建立DMM手术采用文献[14]报道的常规方法，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)麻醉，右膝关节备皮，酒精消毒，切开膝关节处皮肤暴露髌韧带，镊子掀开髌韧带暴露髌下脂肪垫，用镊子清除部分脂肪，切断连接内侧半月板胫骨的韧带，髌韧带复位缝合，皮肤缝合。待小鼠苏醒，给予自由活动。小鼠按随机数字表法分为3组：对照组(n=7，不建模)、DMM组(n=7，建立DMM模型)、DMM+LIPUS组(n=7，建立DMM模型后给予LIPUS治疗)。实验过程中，对照组和DMM组分别死亡1只小鼠，未纳入统计学处理。
1.2.2 LIPUS治疗流程手术后小鼠休息1 d，为了防止小鼠膝关节和LIPUS探头接触不良，LIPUS治疗前麻醉固定小鼠，刮除右膝关节毛发，皮肤涂上耦合胶，LIPUS探头紧贴膝关节。DMM+LIPUS组小鼠每天采用LIPUS治疗20 min，每周6次，具体见图 1A。DMM均在同一时间点和DMM+LIPUS进行麻醉。DMM手术2周后小鼠取材。4%多聚甲醛固定右膝关节12 h，15% EDTA脱钙14 d，30%蔗糖脱水，OCT包埋，冰冻切片。
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| A：LIPUS治疗流程；B：HE染色观察各组小鼠膝关节滑膜的变化 图 1 LIPUS对DMM手术小鼠膝关节滑膜的影响 |
1.2.3 HE染色方法
冰冻切片置于37 ℃温箱中30 min，PBS洗2遍后，苏木精染色3 min，自来水浸泡3 min，伊红染色10 s，使用95%乙醇脱色，最后封片并采集图片。选取每只小鼠右膝关节滑膜最厚部位，用Image J软件测量滑膜厚度。
1.2.4 免疫荧光染色方法冰冻切片放置在37 ℃温箱中30 min，PBS清洗2遍，封闭液封闭1 h后，加入一抗4 ℃过夜，清洗2遍后荧光二抗孵育1 h，PBS清洗3遍后加入DAPI染核，PBS清洗后封片, 共聚焦显微镜下拍照。培养的细胞免疫荧光染色采取相似的方法。
1.2.5 细胞培养和处理THP-1和Raw 264.7细胞均培养于α-MEM培养基中，培养基中含有10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞放于37 ℃、5% CO2孵育箱培养。THP-细胞使用100 ng/mL PMA处理72 h，诱导分化为成熟的巨噬细胞。100 ng/mL的LPS处理巨噬细胞12 h，使其分化为M1型巨噬细胞。LIPUS探头涂上耦合剂，紧贴培养皿底部，打开LIPUS开关，处理20 min，1 h后收集细胞。将THP-1细胞系分为对照组、LIPUS组、LPS(lipopolysaccharide)组和LPS+LIPUS组，将Raw 264.7细胞分为LPS组和LPS+LIPUS组，分别进行后续研究。
1.2.6 实时荧光定量PCR检测依据说明书上使用TRIzol法提取细胞总RNA，反转RNA后用SYBR Green RT-PCR试剂盒进行定量PCR检测。GAPDH引物上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′，下游：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；IL-1β引物上游：5′-GCCATGGACAAGCTGAGGAAG-3′，下游：5′-GTG-CTGATGTACCAGTTGGG-3′；TNF-α引物上游：5′-CA-GCCTCTTCTCCTTCCTGA-3′，下游：5′-CAGCTTGAGG-GTTTGCTACA-3′；IL-10引物上游：5′-GACTTTAAGG-GTTACCTGGGTTG-3′，下游：5′-TCACATGCGCCTTGA-TGTCTG-3′；Arg1引物上游：5′-ACGGAAGAATCAGCCTGGTG-3′，下游：5′-GTCCACGTCTCTCAAGCCAA-3′。GAPDH作为内参标准化数据。
1.2.7 Western blot检测细胞蛋白表达水平细胞裂解液提取细胞总蛋白，30 μg的蛋白上样于12%的SDS-PAGE胶进行电泳，电泳后蛋白转移到PVDF膜中，用5%的脱脂牛奶常温封闭PVDF膜1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，PBST清洗3遍后加入二抗37 ℃孵育1 h。PBST洗膜3遍，用ECL化学发光法显影，采用Bio-Rad图像分析系统进行分析。
1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 7进行统计学分析，数据以x±s表示，两组间比较使用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Post Hoc检验比较组间差异, 检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 LIPUS缓解DMM手术导致的滑膜异常增生各组小鼠膝关节滑膜的变化见图 1B。对照组小鼠膝关节滑膜厚度为(14.57±2.48)μm，小鼠DMM手术后2周的滑膜厚度为(73.17±5.83)μm，比未做手术对照组显著增加(P < 0.01)，并且可以看到滑膜中有大量巨噬细胞浸润。2周的LIPUS治疗后滑膜厚度为(54.10±4.84)μm，较DMM组显著降低(P < 0.05)。说明LIPUS治疗缓解了DMM手术导致的早期滑膜增生。
2.2 LIPUS调节PTOA小鼠滑膜巨噬细胞的极性DMM手术增加了小鼠膝关节滑膜F4/80阳性巨噬细胞中iNOS阳性细胞即M1型巨噬细胞的比例(P < 0.05, 表 1，图 2A)。与DMM组比较，LIPUS降低了iNOS阳性巨噬细胞比例(P < 0.05)。DMM手术小鼠的滑膜CD206阳性M2型巨噬细胞占总巨噬细胞的比例和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而LIPUS处理组的滑膜巨噬细胞CD206阳性比例较单纯DMM手术组增多(P < 0.05，表 1，图 2B)。结果提示，DMM手术2周后的滑膜巨噬细胞大部分极化为M1型巨噬细胞，而2周的LIPUS治疗处理可降低M1型巨噬细胞比例，增加了M2型巨噬细胞的比例。
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| M：半月板；T：胫骨；S：滑膜；虚线为滑膜组织的边界线；白框为局部放大区域A：小鼠右膝关节F4/80和iNOS共染；B：小鼠右膝关节F4/80和CD206共染 图 2 免疫荧光检测LIPUS对DMM小鼠滑膜巨噬细胞极化的影响 |
| 组别 | iNOS阳性细胞比例 | CD206阳性细胞比例 |
| 对照组 | 46.44±2.00 | 51.39±6.94 |
| DMM组 | 76.68±4.75a | 44.86±2.86 |
| DMM+LIPUS组 | 41.39±3.39b | 65.00±2.50b |
| a: P < 0.05, 与对照组比较；b: P < 0.05, 与DMM组比较 | ||
2.3 LIPUS对THP-1和RAW264.7巨噬细胞极化相关基因表达的影响
PMA诱导分化72 h后的THP-1细胞中，LIPUS处理组的IL-1β和TNF-α mRNA表达量和对照组相比有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，LIPUS处理组的IL-10和Arg1 mRNA表达量增加(P < 0.05)。LPS处理PMA诱导分化的THP-1细胞12 h后，和LPS组相比，LIPUS+LPS组的IL-1β和TNF-α的mRNA表达量减少(P < 0.05)，而IL-10和Arg1的mRNA表达量增加(P < 0.05)。LPS处理Raw 264.7细胞12 h，LIPUS+LPS组的IL-1β和TNF-α mRNA表达量比LPS组减少(P < 0.05)，IL-10和Arg1的表达量较LPS组增加(P < 0.05, 图 3)。
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| A：THP-1细胞IL-1β mRNA水平的变化 1：对照组；2：LIPUS组；3：LPS组；4：LPS+LIPUS组；a：P < 0.05，与LPS组比较；B：THP-1细胞TNF-α mRNA的变化 1：对照组；2：LIPUS组；3：LPS组；4：LPS+LIPUS组；a：P < 0.05，与LPS组比较；C：THP-1细胞IL-10 mRNA的变化 1：对照组；2：LIPUS组；3：LPS组；4：LPS+LIPUS组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与LPS组比较；D：THP-1细胞Arg 1 mRNA的变化 1：对照组；2：LIPUS组；3：LPS组；4：LPS+LIPUS组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与LPS组比较；E：Raw264.7细胞IL-β、TNF-α、IL-10和Arg1的mRNA的变化 a：P < 0.05，与LPS组比较 图 3 LIPUS对THP-1和Raw264.7巨噬细胞系极化相关基因的mRNA水平影响 |
2.4 LIPUS抑制活化巨噬细胞JNK和NF-κB信号通路
与对照组比较，LIPUS处理对小鼠腹腔来源的Raw 264.7细胞的磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白表达量没有显著影响(P>0.05), 而LIPUS能显著下调LPS导致的p-JNK和p-NF-κB p65的高蛋白表达水平(P < 0.05，图 4)。PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞中，LIPUS组与对照组比较，p-JNK和JNK蛋白表达量的比值差异无统计学意义，而LPS+LIPUS组与LPS组比较，p-JNK和JNK蛋白表达量的比值有下降趋势(P>0.05, 图 4)。说明LPS炎症刺激条件下，LIPUS抑制了JNK信号通路，同时也抑制了NF-κB p65的磷酸化。利用免疫荧光染色，发现DMM手术增加了小鼠滑膜组织中p-JNK和p-NF-κB p65的表达水平；而LIPUS治疗后的小鼠，p-JNK和p-NF-κB p65在滑膜中的表达水平较DMM组显著降低(P < 0.05，图 5, 表 2)。
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| A、B：Raw 264.7细胞的Western blot检测及半定量分析结果 1：对照组；2、3：LIPUS组；4：LPS组；5、6：LPS+LIPUS组a：P < 0.05，与LPS组比较；C、D：THP-1细胞的Western blot检测及半定量分析结果 1：对照组；2：LIPUS组；3：LPS组；4：LPS+LIPUS组 图 4 Western blot检测各组p-JNK和p-NF-κB p65蛋白的表达 |
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| M：半月板；T：胫骨；F：股骨；S：滑膜；白色虚线为滑膜组织边界线A：小鼠右膝关节F4/80和p-JNK共染；B：小鼠右膝关节F4/80和p-NF-κB p65共染 图 5 LIPUS对各组p-JNK和p-NF-κB p65蛋白表达的影响 |
| 组别 | p-JNK阳性细胞比例 | p-NF-κB p65阳性细胞比例 |
| 对照组 | 15.05±1.01 | 18.87±1.58 |
| DMM组 | 53.17±2.47a | 54.48±2.67a |
| DMM+LIPUS组 | 22.58±1.43b | 14.51±1.59b |
| a: P < 0.05, 与对照组比较；b: P < 0.05, 与DMM组比较 | ||
2.5 LIPUS抑制LPS诱导的THP-1细胞NF-κB p65入核
共聚焦显微镜观察可见，LPS+LIPUS组核内NF-κB p65阳性THP-1细胞数(36.50±2.33)较LPS组(74.08±3.35)显著减少(P < 0.01)。说明在LPS诱导的炎症环境下，LIPUS可以抑制THP-1细胞NF-κB p65进入细胞核，见图 6。
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 ：示典型核内NF-κB p65阳性细胞
图 6
LIPUS对THP-1细胞NF-κB p65入核的影响
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3 讨论
骨性关节炎患者在临床上表现为关节疼痛、活动受限等，晚期患者只能行关节置换术，可导致劳动力丧失，给社会带来严重的经济负担。因此OA的预防以及延缓早期OA进程显得尤为重要[1]。临床上的非手术治疗包括非甾体类药物、激素、生物因子等[15]。研究表明无创的物理治疗也可有效缓解创伤导致的关节炎症状，如疼痛和关节活动受限[5]。LIPUS是临床上常用的非侵入性物理治疗方法，临床研究提示其可缓解OA患者症状[8]。OA患者的疼痛症状与滑膜炎密切相关，滑膜炎是治疗OA的靶向组织[16]。本研究利用DMM手术小鼠模型模拟创伤后骨关节炎，发现2周的LIPUS处理可缓解OA引起的小鼠膝关节滑膜的厚度，提示LIPUS的治疗对OA的滑膜炎有一定的抑制作用。
滑膜炎表现为滑膜肥厚、畸形生长，血管增生与炎症反应，89%的膝关节OA患者有严重的滑膜炎[17]。膝关节的滑膜组织中主要有两种细胞：成纤维细胞和巨噬细胞。在OA患者关节局部可以看到大量活化的巨噬细胞聚集[18]。活化的巨噬细胞可分泌大量可溶性促炎因子，如IL-1β，TNF-α等，加速了OA的病理进程[19]。F4/80是巨噬细胞的特异性标志物，本研究中也发现DMM手术2周后的小鼠滑膜中，有大量F4/80阳性的巨噬细胞浸润。巨噬细胞具有异质性，在不同的微环境刺激下，巨噬细胞可以被极化为经典活化的巨噬细胞(即M1型巨噬细胞)和替代性活化的巨噬细胞(即M2型巨噬细胞)[20]。近期研究提示OA患者的滑膜中聚集着大量的M1型巨噬细胞，而M2型巨噬细胞在滑膜中的比例较少[21]。M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例与OA的严重程度正相关[22]。促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化可能是缓解OA滑膜炎的一种新策略[23]。研究报道，在急性肌肉组织损伤的大鼠模型中，LIPUS处理减少了损伤肌肉部位M1型巨噬细胞，而增加了M2型巨噬细胞的数量[24]。iNOS是M1型巨噬细胞的标志物，CD206是M2型巨噬细胞标志物。本研究发现，LIPUS可减少DMM手术后2周滑膜中iNOS阳性的巨噬细胞数量，增加CD206阳性巨噬细胞数, 提示LIPUS抑制OA滑膜中M1型巨噬细胞的极化，而促进M2型巨噬细胞极化可能是LIPUS缓解OA的一种重要机制。
本研究进一步用体外细胞模型探究LIPUS对巨噬细胞极化的影响，发现在正常培养条件下，LIPUS对THP-1和Raw 264.7巨噬细胞的M1型标志物IL-β和TNF-α没有明显影响，但可以促进巨噬细胞M2型标志物IL-10和Arg1的表达。LPS是激活巨噬细胞向M1型极化的刺激因子[25]。本研究进一步利用LPS诱导巨噬细胞极化，结果提示LIPUS抑制了M1型标志物的表达，而促进了M2型标志物的表达，在炎症刺激条件下，LIPUS对巨噬细胞的极化作用和体内实验的结果吻合。总之，研究的结果提示LIPUS可能通过促进滑膜M2型巨噬细胞和M1型巨噬细胞的比例缓解了OA的进程。
巨噬细胞的极化和JNK通路密切相关，使用JNK的抑制剂可以抑制巨噬细胞M1相关标志物的蛋白表达而促进M2型巨噬细胞的标志物表达[26]。NF-κB信号通路的活化也能促进M1型巨噬细胞的活化，导致炎症反应[27]。LIPUS调节巨噬细胞极化的具体分子机制并不完全清楚。本研究发现，在巨噬细胞中，LIPUS可以下调LPS诱导的磷酸化JNK和磷酸化p65蛋白的高表达，提示LIPUS抑制了炎症条件下JNK和NF-κB信号通路。有研究表明LIPUS能抑制LPS诱导成骨细胞的NF-κB核转位[28]，本研究同样发现LIPUS抑制了LPS处理THP-1巨噬细胞所致的NF-κB p65入核，进一步提示LIPUS能抑制炎症条件下NF-κB信号通路的活化。总之，在炎症条件下，LIPUS可能通过抑制JNK和NF-κB信号通路的活化，进而抑制M1型巨噬细胞的极化，而促进巨噬细胞向M2型极化。
本研究在DMM手术模型中验证了LIPUS抑制滑膜炎，进一步用新的动物模型证实了LIPUS具有抗炎的功能。以往有研究表明LIPUS可以调控急性肌肉组织损伤部位巨噬细胞的极化[24]，本研究在DMM手术模型中发现LIPUS能调控滑膜中巨噬细胞的极化状态，这可能也是LIPUS治疗OA的一种新的机制。本课题在体外水平研究了LIPUS对活化的巨噬细胞极化的影响，发现LIPUS能减少M1型巨噬细胞的标志物表达，而增加M2型巨噬细胞的标志物表达。在机制研究方面，本课题在体内外水平发现LIPUS能抑制炎症状态下的JNK和NF-κB信号通路，与之前在肌肉损伤模型中的报道结果一致[29]，而文献[26-27]报道这两条通路均可以调控巨噬细胞的极化，因此LIPUS可能通过该机制调控巨噬细胞的极化。综上所述，LIPUS可通过抑制滑膜巨噬细胞向M1型极化，促进向M2型极化而抑制OA滑膜炎，该调控作用可能与LIPUS抑制JNK和NF-κB信号通路有关，该研究为LIPUS在临床上治疗OA提供了理论基础。
本研究存在一定局限性：本课题发现LIPUS可以降低炎症状态下巨噬细胞中JNK和NF-κB p65的磷酸化水平，抑制NF-κB p65入核，但LIPUS调控JNK和NF-κB信号通路具体分子机制需要下一步研究。LIPUS采用治疗骨折的临床参数，而LIPUS治疗OA的最优参数(频率、强度、占空比、处理时间)组合需要进一步研究，以达到最佳治疗效果。
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