氮芥(nitrogen mustard, NM)属于外军装备的糜烂性毒剂类,可引起典型的难愈性皮肤损伤,尚缺乏有效治疗措施。NM引起皮肤损伤的机制复杂,目前认为具有表皮干细胞性质的角质形成细胞是NM的作用靶点,其功能紊乱是NM诱导皮肤损伤发生、发展的关键[1-2]。然而,关于NM诱导角质形成细胞损伤的毒理学机制尚未阐明。自噬(autophagy)是真核细胞通过吞噬降解胞内变性、受损和衰老的蛋白质或细胞器实现代谢调节、细胞器更新的过程。新近研究表明,自噬在多种外界刺激引起的皮肤损伤中发挥重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞能量代谢通路的关键分子,对细胞自噬具有重要的调控作用[3-5]。本实验室前期研究发现芥类化合物染毒后能够显著干扰细胞能量代谢[6]。然而,关于NM对AMPK及其介导的自噬的影响,国内外尚少见相关报道。本研究通过体外实验,利用角质形成细胞系建立NM染毒细胞模型,利用自噬特异性抑制剂(3-Methyladenine, 3-MA)、激动剂(rapamycin, RAPA)和AMPK特异性抑制剂(compound C, CC)干预处理,初步探讨AMPK/自噬通路在NM诱导的角质形成细胞毒性中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验试剂人角质形成细胞株(HaCa T细胞)购自中科院上海细胞所,胎牛血清(无支原体)和RPMI培养基为美国HyClone公司产品;细胞增殖及毒性检测试剂盒(Cell counting kit)为日本Dojindo生物公司产品;GFP-LC3-B质粒购自浙江碧云天生物公司;lipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自美国Sigma公司;兔抗人LC3-B2/B1抗体和兔抗人AMPK抗体购自美国CST公司,兔抗人p62抗体为美国Santa Cruz公司产品;鼠抗人β-actin抗体为北京中杉金桥公司产品;PVDF膜和ECL发光液购自美国Merck Millipore公司。
1.2 细胞处理HaCaT细胞用含10%胎牛血清的RPMI培养基传代培养。实验分组和处理如下:①NM组用不同浓度(1、5、10、20 μmol/L)NM处理24 h;②NM+3-MA组用5 mmol/L 3-MA处理1 h后,加入20 μmol/L NM继续处理24 h;③NM+RAPA组用20 nmol/L RAPA处理1 h后,加入20 μmol/L NM继续处理24 h;④NM+CC组用10 mmol/L CC处理1 h后,加入20 μmol/L NM继续处理24 h;⑤3-MA组加入5 mmol/L 3-MA处理24 h;⑥RAPA组加入20 nmol/L RAPA处理24 h;⑦CC组加入5 mmol/L 3-MA处理24 h;⑧空白对照组不做任何处理。
1.3 细胞增殖活力测定应用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖活力。取处于对数增长期的HaCaT细胞接种于96孔板中,每组设置4个复孔,接种细胞数为1.5×104/孔。24 h后更换培养基,按照NM不同浓度(0、0.1、1、5、10、20、50、100、200 μmol/L)处理细胞。细胞培养结束后,按照操作说明书每孔加入CCK-8溶液20 μL,继续培养细胞1.5 h。再用酶标仪测定每组细胞在450 nm处的光密度值[D(450)]。将空白对照组增殖活力设为100%,其余各组细胞增殖活力=[处理组D(450)/空白对照组D(450)]×100%。
1.4 共聚焦显微镜观察细胞自噬体将处于对数生长期的HaCaT细胞按5×104/孔接种于预置有盖玻片的24孔板中,细胞长至80%融合状态后进行转染。每孔加入2 μL lipofectamineTM 2000脂质体和0.4 μg GFP-LC3质粒DNA,培养4~6 h后,更换培养液,继续传代培养24 h。按实验分组分别加入处理因素,细胞培养终止后,弃培养液,PBS浸洗2次,用4%的多聚甲醛固定15 min,取出玻璃片,吸干存留液体后封片,共聚焦显微镜观察。
1.5 蛋白表达检测按照1.2实验分组依次加入处理因素后,收取细胞测定蛋白浓度。取40 μg蛋白样品加入上样缓冲液后煮沸变性上样;用质量分数为10%的SDS-PAGE凝胶电泳;将蛋白应用湿性转膜法转印至PVDF膜上,用含5%蛋白干粉封闭液封闭2 h后,用LC3-B2/B1、AMPK和p62抗体稀释液4 ℃过夜孵育;洗膜后加入二抗稀释液室温孵育1.5 h;再次洗膜后加入ECL发光液,用VILBER FUSION FX7成像系统曝光。
1.6 统计学分析计量资料以x±s表示,采用SPSS 20.0统计软件对数据进行单因素方差分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 NM对HaCaT细胞增殖活力和形态的影响NM处理后,HaCaT细胞增殖活力被显著抑制,且NM浓度越高,细胞增殖活力下降越明显(P<0.05);当NM浓度为20 μmol/L时,角质形成细胞增殖活力约下降40%(图 1A)。
与空白对照组相比,倒置显微镜下观察NM(20 μmol/L)组细胞数量明显减少,形态不规则且折光度降低(图 1B)。
2.2 NM对HaCaT细胞自噬标志蛋白表达的影响Western blot检测不同浓度NM处理后LC3-B2、p62蛋白的表达水平。如图 2A所示,NM处理后能够上调LC3-B2的表达并促进p62的降解,NM浓度越高,蛋白表达变化越明显。GFP-LC3荧光质粒转染后,共聚焦显微镜检测结果显示,NM(20 μmol/L)处理后可显著促进HaCaT细胞自噬体的形成(图 2B、C)。
2.3 自噬在NM诱导HaCaT细胞增殖活力下降中的作用
Western blot检测结果显示,NM处理后能显著上调LC3-B2表达水平,同时促进p62降解;加入3-MA后,NM诱导的LC3-B2、p62表达变化被明显抑制(图 3A),而加入RAPA后NM诱导效应无明显变化(图 4A)。同时,CCK-8检测HaCaT细胞增殖活力发现,3-MA处理后能够显著抑制NM诱导的细胞增殖活力下降(P<0.05,图 3B),而加入RAPA处理后细胞增殖活力无显著改变(P>0.05,图 4B)。
2.4 NM对AMPK活性的影响
Western blot检测结果显示,NM处理后可明显增加AMPK活性形式pAMPK蛋白的表达,且随着NM处理浓度的增加,pAMPK变化越显著(图 5)。
2.5 AMPK在NM诱导HaCaT细胞自噬中的作用
如图 6A所示,与空白对照组比较,NM组LC3-B2、pAMPK表达显著增加,p62表达显著降低,而Compound C处理后能显著抑制NM诱导的LC3-B2、pAMPK和p62表达变化。利用CCK-8法检测细胞增殖活力结果显示,Compound C处理抑制细胞自噬后,NM诱导的HaCaT细胞增殖活力下降被明显抑制(P<0.05,图 6B)。
3 讨论
氮芥是最早应用于肿瘤治疗的药物并且取得突出疗效[7],但也常常引起皮肤损伤。皮肤是NM最主要的接触中毒靶器官之一,NM损伤后能够引起皮肤红斑、水肿、水泡、糜烂、坏死,易造成二次感染,创面愈合缓慢。虽然NM引起的皮肤损伤研究持续已久,但其损伤机制尚未阐明。目前也没有开发出氮芥中毒的特效药物,临床治疗上仅能采取对症支持措施。因此,研究NM诱导皮肤损伤的确切机制,对于提高NM损伤防治策略具有重要的军事意义和民用价值。
角质形成细胞为皮肤的快速更新不断提供细胞来源,是NM的作用靶点。NM中毒可引起细胞结构及增殖、迁移、分化、因子分泌等功能紊乱,进而诱导皮肤损伤的发生、发展。KUMAR等[8]和UDASIN等[1]的研究报道指出,NM中毒可引起角质形成细胞线粒体功能紊乱,导致活性氧(ROS)生成过多,进而引起细胞氧化应激损伤。目前采用抗炎抗氧化药物只能部分缓解NM引起的皮肤损伤症状,提示NM诱导皮肤损伤还存在其他特异的作用机制。本研究通过体外构建NM染毒角质形成细胞模型,模拟NM对皮肤损伤的毒性作用,进一步探讨NM诱导皮肤损伤的作用机制。
自噬是真核细胞调节代谢、维持自我更新的生物过程,与人类健康以及疾病发生、发展密切相关[9]。外界因素如饥饿刺激后会通过激活细胞自噬进而维持细胞稳态[10]。研究证实,自噬与多种疾病,如皮肤晒伤、感染、癌症等疾病的发生、发展密切相关[11]。新近研究指出,自噬通过抑制紫外线照射后皮肤细胞活性氧(ROS)的产生[12],减轻皮肤损伤和老化[13]。本研究发现,NM染毒后能够浓度依赖性地抑制细胞增殖活力,并显著上调LC3-B2的表达,促进p62蛋白降解,提示NM能够显著诱导HaCaT细胞损伤和自噬的发生。同时,利用自噬特异抑制剂3-MA和激动剂RAPA干预,进一步证实NM通过诱导自噬实现对HaCaT细胞的毒性作用。结果显示,3-MA显著抑制NM处理引起的HaCaT细胞自噬的发生,进而抑制了NM对HaCaT细胞增殖活力的毒性作用;而RAPA对NM诱导细胞自噬和毒性没有明显作用。上述结果显示,NM可通过激活细胞自噬造成角质形成细胞的损伤。为针对自噬途径寻找NM损伤治疗靶点提供了新的思路。以往对糜烂性毒剂损伤机制的研究,从广为接受的DNA烷化加合损伤,扩展到多通路和多靶点的损伤机制。本研究结果对丰富糜烂性毒剂的多机制损伤学说提供了有力的实验证据。
AMPK是真核生物能量代谢调控的关键分子,参与维持细胞内葡萄糖水平,与线粒体功能密切相关,具有重要的生理作用。近期研究表明,AMPK在自噬调控中起关键作用,其介导的细胞自噬在机体的多种生理病理过程中发挥重要作用[14-16]。研究表明,激活皮肤表皮细胞AMPK能诱导细胞自噬,进而促进紫外线引起的皮肤损伤修复[17-18];而镉能通过激活AMPK诱导自噬,进而导致皮肤损伤[19]。以上研究结果提示,AMPK介导的细胞自噬在外界刺激引起的皮肤损伤修复过程有重要作用。此外,本实验室前期研究也发现,与氮芥类似的另一种毒剂半硫芥染毒后能够显著影响细胞能量代谢水平[6]。因此,我们推测NM可能通过调控AMPK而诱导细胞自噬,进而引起皮肤损伤。本研究通过Western blot检测NM处理HaCaT细胞后AMPK、pAMPK蛋白表达变化,结果显示:NM能浓度依赖性地激活AMPK。为进一步明确AMPK在NM诱导HaCaT细胞自噬中的作用,我们利用AMPK特异抑制剂CC处理细胞后,发现NM诱导的细胞毒性作用以及LC3-B2、p62蛋白表达变化均被明显抑制。以上研究结果表明,AMPK介导的细胞自噬在NM诱导角质形成细胞损伤中具有重要作用。然而,关于NM激活AMPK的具体作用机制,还有待进一步研究阐明,这也是我们后期研究的重点内容之一。
综上所述,本研究发现NM通过激活AMPK/自噬信号通路诱导角质形成细胞毒性损伤。该结果对于进一步揭示NM诱导角质形成细胞损伤的确切机制有重要意义,对于提高NM损伤防治效果具有潜在的应用价值。
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