2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)高原军事医学系高原生理学与病理学教研室，特殊环境医学教育部重点实验室，全军高原医学重点实验;
3. 400016 重庆，重庆医科大学：实验教学管理中心
2. Department of High Altitude Physiology and High Altitude Biology, Key Laboratory of Extreme Environmental Medicine of Ministry of Education, Key Laboratory of High Altitude Medicine of PLA, Faculty of High Altitude Military Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China;
3. Experimental Teaching Management Center, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016
缺氧，即氧供不足和/或需求增大造成氧供需不平衡，进而引发多种反应，是一种常见的病理生理过程，存在于慢性阻塞性肺疾病、组织缺血再灌注损伤相关的心血管疾病以及肿瘤等多种临床疾病[1-2]。近年来，进入高原环境生活、工作和旅游的人数逐年增加，但在高原上随着海拔增加，大气压逐渐降低，氧分压随之而降低，外环境中的氧分子向血液弥散的驱动力随之而降低，造成缺氧，可引起作业能力降低，甚至引起急慢性高原病，对进驻高原人群的健康造成严重影响[3]。因此，维持机体病理条件下以及特殊生存环境条件下氧供需平衡显得尤为重要。血液中的红细胞是氧的运输者，氧气分子结合在红细胞的血红蛋白上，血红蛋白与氧分子的亲和力是机体从外界环境获取氧、血液向组织释放氧的关键因素。
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种不稳定的亲脂性气体分子，半衰期很短, 可自由穿过细胞膜，在细胞生物学中发挥多种作用[4]。在一些缺氧耐受能力强的生物(如深海域鱼类)中发现NO及其相关的代谢产物含量较高；此外，高原世居人群呼出气中NO的含量比平原地区人群高，提示NO与缺氧具有密切关系。NO在调节血管张力、降低血脂水平等过程中发挥重要作用[5]。本研究探讨吸入NO是否可以改变红细胞的携氧特性，以及这一改变是否与缺氧耐受力有关，为缺氧相关疾病的治疗和对高原习服的理解奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料和仪器主要仪器：气体吸入装置-玻璃箱(实验室自制)，气体浓度检测仪(深圳普利通科技有限公司)，TCS HOMOX-ANALYZER氧平衡曲线仪(美国TCS Scientific公司)，Ohmeda TuffSat掌式手持式血氧仪(美国GE-Datex Ohmeda公司)。主要试剂：13%氨基甲酸乙酯(乌拉坦，国药集团化学试剂有限公司)，PBS(北京中杉金桥生物有限科技公司)，22%牛血清白蛋白(澳大利亚Hyclone公司)，10%聚二甲基硅氧烷(消泡剂，成都楚鹰工贸有限公司)。
50只8周龄C57雄性小鼠由陆军军医大学实验动物中心提供，体质量为(20.29±0.89)g。
1.2 氧平衡曲线(oxygen equilibrium curve, OEC)绘制乌拉坦麻醉小鼠后，眼球取血并置于冰上，配置OEC待测样品(3 mL PBS，30 μL新鲜血，12 μL 22%牛血清白蛋白，10 μL 10%消泡剂)后，不同待测样品(n=15)加入TCS HOMOX-ANALYZER氧平衡曲线仪测试槽，分别用3种不同的气体(N2、N2+100 mL/m3 NO、N2+200 mL/m3 NO)通入样品中，按仪器操作说明进行操作，绘制OEC，并计算血氧饱和度(SpO2)为50%时的氧分压(P50)和希尔系数(Hill)。
1.3 动物缺氧和NO吸入以及动物氧饱和度与存活时间的测定向1个相对密闭的有机玻璃箱(50 cm×50 cm×50 cm)中通入N2、NO和15%O2 3种气体，通过调节流量计阀门，使密闭箱的氧浓度和NO浓度达到实验所需要值。将50只雄性小鼠按随机数字表法分为常氧组(氧浓度21%)和缺氧组(氧浓度5%)，缺氧组再根据未吸入NO及吸入NO浓度(5、10、20 mL/m3)进行分组，每组10只。动物麻醉后，将其口鼻部伸入到相应气体浓度(氧浓度21%或5%，NO浓度为5、10、20 mL/m3)的箱体中。用血氧仪记录动物尾部的氧饱和度及存活时间。
1.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，实验数据以x ±s表示，采用单因素方差分析，用最小显著差异法LSD进行均数之间差异显著性检验，小鼠存活时间延长与血氧饱和度增加的相关性分析采用Pearson相关性分析。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 外源性通入NO对小鼠离体红细胞携氧特性的影响为了明确NO对红细胞携氧特性的影响，在氧离曲线仪的反应池中通入N2(绘制氧离曲线)的同时通入NO，结果发现：随着NO浓度的增加(0、100、200 mL/m3)，氧离曲线逐步左移(图 1)，P50逐渐降低(P < 0.01)，分别为(43.77±2.49)、(40.97±1.40)、(38.86±2.27)mmHg。NO也影响了希尔系数，未吸入NO及吸入100、200 mL/m3 NO组血液的希尔系数分别是2.39±0.18、2.33±0.14和2.49±0.14，但各组间差异无统计学意义。
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| 图 1 NO对小鼠血液氧离曲线的影响 |
2.2 吸入NO对小鼠血氧饱和度的影响
吸入NO对小鼠血氧饱和度的影响是研究NO对机体从外界获取氧的能力的重要指标。结果发现：与常氧组比较，单纯缺氧(缺氧时未吸入NO)组小鼠血氧饱和度显著降低[(48.65±3.79)% vs(82.04±2.38)%，P < 0.05]。吸入NO可以显著提高在缺氧环境(5%O2)中的动物血氧饱和度(P < 0.05)，并呈浓度(NO浓度)依赖；缺氧时未吸入NO及吸入5、10、20 mL/m3 NO时，血氧饱和度分别为(48.65±3.79)%、(52.46±3.77)%、(58.08±2.59)%和(61.29±1.08)%。
2.3 吸入NO对小鼠在缺氧环境下存活时间的影响为探讨NO改善血液携氧特性是否对动物耐缺氧能力产生影响，检测了小鼠在缺氧(5%O2)条件下的存活时间与存活率。结果发现：未吸入NO及吸入5、10、20 mL/m3 NO时，小鼠存活时间分别为(4.98±1.23)、(6.09±1.29)、(6.39±1.58)min和(7.36±0.75)min，10、20 mL/m3 NO组存活时间与单纯缺氧组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。同时，吸入NO也明显提高缺氧条件下小鼠的存活率。
2.4 缺氧条件下吸入NO，小鼠存活时间延长与血氧饱和度增加的相关性缺氧时，小鼠吸入NO后血氧饱和度与未吸入NO时血氧饱和度之间的差值，即血氧饱和度的增加值(△SpO2)，表示吸入NO引起的血氧饱和度增加。每只小鼠吸入NO的存活时间与单纯缺氧组存活时间平均值之间的差值，即存活时间的延长值(△RT)，表示吸入NO引起的存活时间延长。结果发现：△RT与△SpO2间呈显著正相关关系(P < 0.05，图 2)。
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| 图 2 缺氧时吸入NO引起的血氧饱和度增加与存活时间延长的相关性分析 |
3 讨论
所有真核生物和许多原核生物都能产生NO[6]。NO是一种气态自由基，由于其高度亲脂性，可以自由扩散穿过生物膜[7]。在各种生物体中，NO具有多种信号和保护作用，如血管张力调节、代谢调节、凋亡抑制和抗氧化作用[8]。NO直接或间接地发挥它的广泛作用，例如，它可以通过引发氧化还原反应对超过1 000种蛋白的结构和/或活性进行修饰。血红蛋白分子也不例外。本研究结果显示：外源性通入NO可以使氧离曲线发生左移，并呈浓度依赖性，说明NO可以使氧和血红蛋白亲和力增加。同时，通入NO也显著降低小鼠离体血液P50，并呈浓度依赖性。P50是血红蛋白氧饱和度为50%时的氧分压，是反应Hb和O2亲和力的常用指标。通入NO使血液P50降低，说明NO可以使氧和血红蛋白亲和力增加。NO对血红蛋白氧亲和力的影响，可能与两方面的作用有关：①使血红蛋白亚硝基化，改变血红蛋白稳定性; ②与血红蛋白的半胱氨酸残基可逆性结合。
健康成人血红蛋白的部分氨基酸残基发生亚硝基化后，可以通过稳定血红蛋白的松弛构象(R态)而增加氧亲和力。镰刀状红细胞贫血(sickle cell anemia，SCD)是由β-珠蛋白基因突变引起的常染色体隐性遗传病，其血红蛋白(HbS)一级结构发生变异而引起血红蛋白分子聚合，改变红细胞的性状[9]。吸入低浓度NO引起血红蛋白亚硝基化，稳定血红蛋白，防止聚合，进而提高SCD小鼠在缺氧环境下的存活率[10]，可见吸入NO可引起血红蛋白分子构象发生变化。另外，NO可以通过影响铁原子而影响血红蛋白的氧亲和力[11]。
除了上述作用外，NO还可以可逆性地结合在血红蛋白β链93位的半胱氨酸残基上，形成SNO-Hb。SNO-Hb从肺部输送到其他组织毛细血管处时，NO可以从血红蛋白上解离下来，成为游离分子或结合到小的硫醇分子上，并扩散到血管壁，促进血管舒张[12]。NO从血红蛋白分子上解离后，血红蛋白分子与氧的亲和力降低，有利于氧分子从血红蛋白分子上释放出来，供组织使用。而且，SNO-Hb具有完整波尔效应和磷酸盐效应，可以在缺氧组织中酸性代谢产物的作用下，使氧离曲线顺利右移，即血红蛋白与氧的亲和力降低，氧分子可以顺利地从血红蛋白分子上释放出来[13]。
因此，吸入NO可以在肺部随着氧气分子进入血红蛋白分子，提高其对氧的亲和力。同时，当结合了NO的血红蛋白分子随着血液循环进入到肌肉、脑等组织时，NO释放出来扩张血管的同时，也降低氧和力，促进氧分子释放。NO这一既能促进氧摄取、又能促进氧释放的特性，提示其可能在提高耐氧能力中发挥积极作用。本研究结果表明：小鼠在缺氧条件下吸入NO，显著延长其存活时间、提高其存活率，可见吸入NO可提高小鼠耐缺氧能力。NO与动物对各种刺激的应激反应有关，例如：缺氧耐受动物包括巴西红耳龟和鲫鱼通过增加某个或多个身体部位的NO及其代谢物的浓度，来对组织氧分压降低做出反应[14]；一些生物维持相对高的NO产生能力以应对即将发生的应激[15]。
NO的生物学作用十分广泛，包括扩张血管、抑制凋亡和减少活性氧簇等[8, 16]，这些作用均可能在提高耐缺氧能力中发挥效应。因此，为了探讨NO对血红蛋白携氧特性的影响是否在其中发挥作用，我们进行了下一步的研究。结果发现：吸入NO可以显著减弱缺氧条件下血氧饱和度的降低程度。这一结果进一步证实了体外通入NO可以增加血红蛋白氧亲和力。而且，在低氧条件下吸入NO引起的血氧饱和度增加值与动物存活时间的增加值之间存在显著正相关关系。因此，在低氧条件下，吸入NO引起的动物耐缺氧能力增加，与吸入NO引起的血液携氧能力增强有关。
总之，本研究发现吸入低浓度NO可增强血红蛋白携氧能力并在增强耐缺氧能力中发挥作用。这一发现对于理解高原习服或高原适应有重要意义。我国藏族是对高原低氧环境适应最好的人群[17-18]。有研究表明拉萨(3 658 m)出生的藏族新生儿在出生后第1周适应缺氧状态时有明显的优势，因为他们的呼出气中NO高于同一海拔或更低海拔出生的汉族新生儿[19]。另外，本研究也为探寻提高耐缺氧能力的措施提供了新的思路。高原病等缺氧相关疾病的防治、耐缺氧能力的提高可能是一些产生NO的药物的新适用领域。但是，NO具有较强的血管活性，其对血压降低作用可能会限制在应激时的应用。缺氧肺血管收缩反应引起肺动脉压适度增加，有利于增加呼吸膜面积。吸入过多的NO可能会削弱这一代偿反应，也会使血红蛋白发生过度修饰进而损伤血红蛋白的携氧特性，因此，吸入NO的浓度可是关键点，本研究中吸入NO浓度20 mL/m3的数据可为之后的研究提供参考。
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