2. 400038 重庆, 陆军军医大学(第三军医大学)：第一附属医院感染科
2. Department of Infectious Disease, First Affiliated Hospital, Army Medical Universtiy (Third Military Medical university), Chongqing, 400038, China
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可引起急、慢性病毒性肝炎，是世界重要的公共卫生问题之一。据WHO数据显示：全世界尚有2.57亿乙肝病毒表面抗原阳性感染者，而在中国，依然有8 000余万表面抗原阳性感染者，感染率达到6.1%[1]。在我国西藏地区，长期世居藏族人相对隔离，HBsAg携带率高达12%以上[2]。有研究显示：汉族人HBV感染以B、C基因型为主，B型多见于南方，C型多见于北方[3]，而藏族感染者除了有常见的基因型，还有C/D重组型，且以重组型为优势毒株[4]。此种特殊的C/D重组型乙肝病毒，其感染所致的肝炎病程特征、预后、病毒学特征等，目前研究得不多。
HBV为全长3.2 kb的部分环状双链DNA病毒，其自身复制以pgRNA为模板通过逆转录实现，由于逆转录酶缺乏3′- 5′外切酶活性，缺乏校正功能，故易错配产生一系列序列不同的病毒DNA，称之为准种。HBV准种的存在与肝炎的转归、肝癌的发生、免疫逃逸、耐药等密切相关[5]，故引起了人们越来越多的关注。一直以来有关HBV准种的研究多采用片段扩增、克隆测序的方式进行[6-8]，此种方法成本较高，获得的病毒克隆数有限，难以发现低丰度的准种突变。有研究者采用二代高通量测序的方式进行准种研究[9-10]，获得了大量DNA数据，但二代测序读长较短，需要进行拼接得到目的片段，难以获得单条HBV基因组序列。近年来美国Pacific Biosciences(PacBio)公司推出的基于单分子实时测序(single molecule realtime，SMRT)的PacBio RSⅡ测序平台，是第三代测序技术的代表之一，其文库构建是将双链DNA分子两端加上接头序列形成发卡结构，同时在直径100 nm的零模波导孔(zero-mode waveguide，ZMW)底部固定DNA聚合酶，在ZMW中DNA双链打开形成环状DNA, 进而实现连续的合成测序。SMRT测序技术可以实现高通量、长读长的单条DNA分子测序[11-12]，平均读长可达10 kb，完全可覆盖HBV基因组，免除了克隆、拼接的步骤，极大简化了准种分析，是理想的准种分析工具。
本研究采用PacBio RSⅡ测序平台对HBV基因组进行单分子测序，成功获得HBV全长序列，进而对藏族乙肝感染者的HBV准种特征进行了深入探讨，旨在为藏族人群的乙肝诊治提供新的依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象本科室于2016年5月至2017年7月在藏南地区(包括察隅、类乌齐、米林、墨脱4个县)进行乙型肝炎病毒流行病学调查，调查对象签署《关于参加自然疫源性疾病病原谱调查研究的知情同意书》后，详细收集人口学资料和血清样本，共采集到样本508例，其中高原世居者样本209例、高原移居者299例。血清学检出乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性样本24例：HBsAg强阳性(HBsAg>250 IU/mL)14例，均为高原世居藏族人; HBsAg弱阳性(0.05 IU/mL < HBsAg < 0.5 IU/mL)10例，其中5例为高原移居汉族、2例为高原世居藏族、3例为高原世居其他少数民族。24例HBsAg阳性样本作为高原世居藏组(Tibet，T)纳入本研究，其中男性15例(62.5%)，女性9例(37.5%)，年龄(36.6±13.2)岁。同时，按照性别、年龄、生化指标匹配的原则，选择2017年在我科门诊就诊的HBsAg阳性汉族人24例，留取临床检测后剩余血清样本作为平原汉族对照组样本(Control，C)，其中男性15例(62.5%)，女性9例(37.5%)，年龄(36.5±12.1)岁，患者均签署《临床检测剩余血保存及研究知情同意书》。本研究于2014年7月通过陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院伦理委员会审批[2014年科研第(35)号]。
1.2 HBV DNA提取及全长扩增用美国Omega Bio-Tek公司的磁珠总核酸提取试剂盒，从100 μL血清中提取HBV DNA，遵照厂家说明严格操作。参照GVNTHER等[13]的方法设计引物，并在引物上设计16 nt的随机碱基作为标签以标记样本，正向引物位于1 821~1 841 nt(5′-barcod-TTTTTCACCTCTGCCTARTCA-3′)，反向引物位于1 825~1 806 nt (5′-barcod-AAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3′)。采用50 μL PCR反应体系，包括5 μL 10×PCR Buffer，5 μL MgCl2(25 mmol/L)，8 μL dNTP(2.5 mmol/L)，3 μL正反向引物(10 mmol/L)，0.5 μL LA Taq(5 U/μL), HBV DNA 5 μL, 用ddH2O补足体积; PCR反应条件为：变性94 ℃/5 min; 循环(40次)94 ℃/25 s, 55 ℃/30 s, 72 ℃/210 s; 延伸72 ℃/10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，验证是否成功扩增。
1.3 测序及数据处理将PCR产物进行磁珠纯化，通过Nanodrop、Qubit检测DNA浓度，再将每个样本等量混合，随后在武汉未来组生物科技有限公司PacBio RSⅡ平台进行建库及测序，依据厂家官方步骤操作。获得原始下机数据3.5 GB，经过质控去除低质量reads，再根据序列比对、标签序列拆分获得412 MB有效数据，选择测序读长≥9.6 kb(即≥3倍HBV全长)的reads，通过SMRT Tools生成共有序列(circular consensus sequence，CCS)，即准种序列。用ClustalW 2.1、BioEdit 7.0分别完成序列比对、编辑; 选取3条序列作为参考序列，即B型(AB033554)、C型(AY123041)、D型(X65259)，对插入缺失错误的indel进行必要的手动校正; 用Modeltest 3.7分析得出适用的核酸替换模型为Tamura-Nei model+G(Tamura-Nei模型+伽马分布)，氨基酸替换模型用Jones-Taylor-Thornton (JTT)+G。准种复杂度和多样性分别用标准化的香农熵(Shannon entropy，Sn)和平均遗传距离(mean genetic distance，d)来表示，前者计算公式为：Sn=-Σi(piInpi)/InN，pi为第i个准种序列出现的频率，N为总的准种数量。同时选用校正的Nei-Gojobori method (Jukes-Cantor)+G模型，计算同义突变率(synonymous mutation，dS)、非同义突变率(nonsynonymous mutation, dN); 同时计算非同义突变率/同义突变率比值用于反映阳性选择压力的大小。重组分析用SimPlot 3.5完成，遗传距离、同义突变、非同义突变分析，以及系统发育树构建用MEGA 7.0完成，突变检测的阈值定为1%。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件，均值的比较用Student’s t检验，突变率的比较用Fisher精确概率检验，统计结果采用双侧检验结果，检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 样本概况高原世居藏族组24例样本中仅有9例HBsAg强阳性样本HBV全长扩增成功并测序，5例HBsAg强阳性样本及10例HBsAg弱阳性样本多次扩增失败。9例扩增成功的样本均获得良好的测序结果，均为高原世居藏族人，纳入本研究后续分析。平原汉族对照样本全部HBV全长扩增成功并测序，但有4例样本获得CCS较少(CCS < 18条)，不纳入后续分析，将20例对照样本纳入后续分析。高原世居藏族组平均65条CCS/样本(18~229条)，平原汉族对照组平均124条CCS/样本(24~408条)。两组样本基本情况见表 1。
| 组别 | n | 男/女 | 年龄/岁 | ALT/U·L-1 | ALB/g·L-1 | TBIL/μmol·L-1 | HBV DNAa/lg10 U·mL-1 | HBsAg/IU·mL-1 | 三代测序获得准种数量 |
| 高原世居藏族组 | 9 | 4/5 | 39.9±14.2 | 53.2±29.7 | 43.7±3.6 | 13.7±6.6 | - | >250 | 65±63 |
| 平原汉族对照组 | 20 | 14/6 | 35.5±12.8 | 45.3±19.4 | 44.7±6.1 | 13.7±5.3 | 7.8±0.7 | >250 | 124±110 |
| a:因采集的样本量有限，高原世居藏族样本只进行了HBsAg滴度检测，未检测HBV DNA载量 | |||||||||
2.2 系统发育分析及重组鉴定
将29例样本(9例高原世居藏族样本，20例平原汉族对照样本)各选择18条准种序列，和基因型A~I共9条HBV参考序列比对后，用NJ法构建系统发育树(图 1)。发现8例藏族样本同属一个进化支，与C型参考株距离最近(0.04~0.05)，其中1例藏族样本(T3)与其他7例样本遗传距离稍远; T1与T8样本进化支相互交错，提示它们遗传距离很近，可能有共同的传染源; 此外，还有1例藏族样本(T12)紧邻C型参考株，为C基因型; 汉族对照样本则分别有6例C基因型，14例B基因型。
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| 红色分支表示1例样本的主进化支，蓝色分支表示HBV参考株，青色分支表示T1，紫色分支表示T8;绿色扇区代表B基因型，红色扇区代表C基因型，黄色扇区代表藏族样本自成一个进化支; 比例尺表示遗传距离(替换/碱基) 图 1 29例样本与HBV参考株系统发育树 |
进一步用Simplot进行重组分析，发现7例藏族样本在750 nt发生重组(图 2A)，1~750 nt是D型，而751~3 215 nt是C型，为C/D1重组型; 1例藏族样本在1 500 nt发生重组(图 2B)，1~1 500 nt是D型，1 501~3 215 nt是C型，为C/D2重组型。剩下1例藏族样本(T12)及20例对照样本则无重组现象。
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| A:藏族样本T2为C/D1重组型，重组发生在750 nt; B:藏族样本T3为C/D2重组型，重组发生在1 500 nt; 参考序列为A(AF090842)、B(AB033554)、C(AY123041)、D(X65259)、E(AB032431)、F(X69798)、H(AY090460) 图 2 藏族HBV基因组Simplot重组分析 |
为进一步探讨HBV重组可能的来源，从GenBank选取23例C基因型参考株、61例D基因型参考株，5例C/D重组型参考株，对藏族样本HBV的2个重组片段进行系统发育分析。C/D1型样本D型片段(1~750 nt)除了与青海、蒙古、四川C/D型HBV较接近外，还与D4亚型HBV较接近(图 3A); 其C型片段(751~3 215 nt)除与青海、蒙古C/D型HBV接近，与C2亚型较接近(图 3B)。对1例C/D2型HBV做同样的系统发育分析，发现其D型片段(1~1 500 nt)与D3亚型较接近，尤其与蒙古的1株D3型HBV距离较近; 而其C型片段(1 501~3 215 nt)同样与C2型较接近。此外，1例C型藏族样本T12属C2亚型。
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| A:C/D1型HBV 1~750 nt片段系统发育分析; B：C/D1型HBV 751~3 215 nt片段系统发育分析 图 3 C/D1型HBV重组片段的系统发育分析 |
2.3 准种复杂度和多样性分析
高原世居藏族组与平原汉族对照组在HBV 4个编码区(preC/C、X、preS/S、P)内比较，准种复杂度、多样性差异无统计学意义; 但藏族组在preC/C区的非同义突变率高于对照组(图 4A，P=0.045)，而在其他3个编码区差异无统计学意义; 同义突变率组间差异也无统计学意义(图 4B)。全部的藏族样本以及75%(15/20)的对照样本preC/C区dN/dS>1(图 4C)，而X、preS/S、P区未出现此种特征，提示preC/C区相比其他3个编码区受到更大的阳性选择压力。
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| A：藏族样本(T)与对照样本(C)在各编码区非同义突变率的比较; B：T与C在各编码区同义突变率的比较; C：T与C在各编码区非同义突变率/同义突变率的比值比较; D：C/D型HBV与对照基因型HBV在preC/C编码区准种复杂度比较; E：C/D型与对照基因型HBV在preC/C编码区核酸水平多样性比较; F：C/D型与对照基因型HBV在preC/C编码区氨基酸水平多样性比较; G：C/D型与对照基因型HBV在preC/C编码区非同义突变率比较; H: C/D型与对照基因型HBV在preC/C编码区同义突变率比较; I: C/D型与对照基因型HBV在preC/C编码区非同义突变率/同义突变率比值的比较每个点代表 1个样本该编码区得出的平均值，黑色短横线代表均数±标准差 图 4 29例样本HBV准种复杂度、多样性、同义/非同义突变率的比较 |
为进一步了解C/D型HBV在preC/C的准种特征，将8例C/D型样本与21例B、C型样本(包括T12)进行比较发现，C/D型HBV的复杂度(图 4D)、多样性(图 4E、F)、非同义突变率(图 4G)、同义突变率(图 4H)都高于对照样本，且复杂度和非同义突变率最为显著(P=0.006)。
2.4 准种突变检测对所有样本进行突变检测发现(图 5)：高原世居藏族样本在基本核心启动子区(basal core promoter，BCP)比平原汉族对照样本有更多的增强子Ⅱ(EnhⅡ)突变C1653T(P=0.005)，和T1753V/A1762T/G1764A三突变(P=0.022)。C基因区的变异各有不同，在T细胞表位区，C1913A、Y38H、L60V只在对照组中出现，而I59V突变只在藏族样本中出现; 在B细胞表位区，发现1例藏族样本(T5)同时带有E77D、L84A、T109M、E113T、T114V突变，对照样本E77D、E83D、S87G突变分别在不同样本间散在分布。另外，只在1例藏族样本中观察到C基因的缺失突变。两组样本在preS1区都发现有缺失突变，preS2都发现有W3*突变，而preS2的缺失突变只在2例对照样本中发现。在S基因的“a”决定区(aa124~147)，藏族样本只发现2例低频率的I/T126A/N突变，2例低频率G145R突变，非“a”决定区有1例L175S突变; 对照样本则发现较多的“a”决定区突变，除有I/T126A/N外，还有P127S/T、Q129H、M133T、T140I、S143T等突变，其中S143T显著多于藏族样本(P=0.001);RT区耐药突变只在2例藏族样本中低频率出现，对照样本未发现耐药突变; X基因变异V5L对照组显著多于藏族组(P=0.030)。其他报道过的突变如S区免疫逃逸突变A128V、Q129H/R、G130N、M133L/T、Y134F/H, RT区耐药突变I169L、V173L、L180M、A181V, S202C/I、N236T、P237H等在所有样本中未发现。
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| 纵坐标为样本编号，横坐标为各功能区的突变，将频率>1%的突变纳入分析，突变频率用相应的颜色表示，白色表示没有突变; *：终止密码子 图 5 29例样本HBV突变筛查结果 |
3 讨论
本研究借助PacBio RSⅡ第三代测序平台，成功对29例样本进行了HBV全长测序，两组样本各获得了平均65条、135条准种序列。结果表明第三代测序相比一代、二代测序，有长读长、操作简便、成本较低的优势，适用于HBV基因组全长测序，在HBV全长准种分析上有优势。但此次测序下机数据为3.5 GB，处理后最终得到的有效数据为421 MB，拆分率仅有12%，其原因可能是PCR扩增不完全、杂质干扰、DNA降解断裂等，以致文库中存在部分短片段DNA，拟在以后的研究中运用DNA凝胶回收的方法加以改进。此外，样本收集条件受限，样本量较少，HBV DNA、HBeAg定量等数据未能获得，也是本研究的不足之处。
2002年就有研究者发现青海、西藏地区乙肝感染者HBV存在着大量的C/D重组现象，且C/D重组型是西藏地区的优势毒株[4, 14]。实际上，有关HBV重组现象时有报道，例如印度发现的A/D型[15]，非洲发现的D/E型[16]，甚至东南亚发现的Ⅰ型毒株也有人认为是基于C型HBV的重组株[17]。而C/D重组型则主要在中国青藏高原发现，可能因为青藏高原具有独特的地理环境和宗教信仰，藏族人群长期世居，与外界鲜有交流，故此种重组型HBV毒株仅在此地域流行。C/D型HBV与C型参考株基因组序列仅有4%~5%的差异，而全基因序列差异>8%可列为新的基因型，差异>4%可列为新的基因亚型[18]，此种重组型HBV是否可以划定为一个新的C基因型亚型，目前尚无定论。本研究在9例高原世居藏族样本中，鉴定出7例C/D1型HBV，重组发生在750 nt，1~750 nt为D型，其他部分为C型，此种类型占绝大多数; 此外鉴定出1例C/D2型HBV，重组发生在1 500 nt，1~1 500 nt为D型，其他部分为C型; 两种重组型的发现与文献报道的重组方式基本一致[18-19]。C/D1型HBV分别由D4亚型与C2亚型HBV相应的片段组成，C/D2型则由D3亚型与C2亚型组成，两者都是在C2亚型的基础上，加入了短片段的D型HBV序列; D4亚型见于南太平洋的澳大利亚、汤加、斐济以及加勒比海域等地，而D3型在印度、印尼等地多有报道，C2型则流行于东亚大陆[20]。C/D型HBV重组的发生，一个可能的解释是，上述地域传入的D型HBV, 与C2型HBV共同感染人体，在免疫系统选择压力下发生了重组。有趣的是，藏族人C/D型HBV流行株在核酸水平除了与地缘关系较近的青海流行的C/D型较接近外, 还与在蒙古分离出的两株C/D型HBV也十分接近，提示西藏、青海、蒙古三地C/D型HBV的传播有着紧密的联系。
藏族人C/D型HBV在preC/C基因区复杂度和非同义突变率显著高于对照组，并且preC/C区相比其他编码区受到更大的阳性选择压力，提示在藏族人的遗传背景下，HBV preC/C基因区面临更大的选择压力。此外，本研究发现在C/D重组型HBV准种变异主要集中在EnhⅡ区(1 636~1 744 nt)、BCP区(1 742~ 1 849 nt)和preS区(2 848~3 215 nt，1~154 nt)，例如C1653T突变、T1753V/A1762T/G1764A三联突变、preS的缺失突变等，SHEN等[21]曾报道过C/D型HBV有较多A1762T/G1764A双突变，与本研究的结果较一致。对照组准种变异则主要在BCP、preC(1 814~1 900 nt)、preS、S(155~835 nt)、X(1 374~1 838 nt)等功能区，例如G1896A、preS缺失突变、sT140I、sS143T、xV5L等变异。A1762T/G1764A双突变会抑制preC蛋白的合成，进而抑制HBeAg的合成，此突变被认为与肝硬化、肝癌(HCC)的进展有关[22-23];另一项研究显示:preS突变、C1653T、T1753V、A1762T/G1764A的存在会增加HCC患病风险[24]。A1762T/G1764A双突变同时会导致X基因的K130M/V131I双突变，而有研究显示：X基因V5L突变和K130M/V131I双突变会随着年龄的增加而增多，同时会增加HCC的患病风险[25]。藏族人C/D型HBV存在较多EnhⅡ、BCP、preS区变异，而S基因区表位变异少，X基因V5L变异少，呈现出与汉族人不同的变异特点，其是否会有较大的HCC患病风险，有待进一步研究。
本研究采用了第三代测序技术对藏族人HBV准种进行了深入探讨，第三代测序技术(单分子测序)具有长读长、操作简便、成本较低等特点，用于HBV全长准种分析有其独特的优势。本研究在藏族人中鉴定了C/D1与C/D2两种HBV重组型，且C/D1为优势毒株; 继而发现C/D重组型HBV准种突变集中在EnhⅡ区、BCP区、preS区，而S基因、X基因突变较少; HBV重组的发生机制及其与肝炎发展、肝癌发生的关系还有待进一步研究。
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