实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)作为核酸(包括mRNA、miRNA等)定量检测的重要方法之一,有着广泛的应用,并具有显著的优势[1-3]。在血浆中miRNA具有高度稳定性[4],可以作为许多人类疾病的生物标志物。mRNA表达谱与恶性肿瘤的分期、分化程度、侵袭转移等有关[5-6],血浆mRNA可作为肿瘤生物标志物[7],用于疾病诊断[8]。目前,在组织和细胞中,常用β-actin、GAPDH、U6作为内参照,但血浆中基因检测尚无标准参照物。GAPDH、β-actin、U6等在血浆中扩增不稳定,不能作为血浆中核酸含量检测的内参照[9-10]。既往研究发现[11],采用人工合成模板和引物的外参照进行血浆核酸的绝对定量PCR,其在不同样本中能稳定存在,且变化最小,但这大都为各实验室的专利,同时缺乏其与β-actin、GAPDH、U6等内参照的直接对比实验和相关数据分析。因此,本研究旨在设计合成一种更为稳定表达的外参照,并同内参照(GAPDH、β-actin、U6)在血浆mRNA、miRNA和细胞上清mRNA水平进行对比分析,以使血浆miRNA、mRNA检测更为可靠,更好地指导相关研究。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器miRNeasy Serum/Plasma Kit购自QIAGEN GmbH公司(批号:217184);氯仿(批号:61553)和乙醇(批号:32061)购自重庆川东化工有限公司;RNase-Free water购自天根生化科技(北京)有限公司(批号:P5207);PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser购自TaKaRa公司(批号:AK4602);Thermo全能型高速冷冻离心机(台式冷冻S116R)购自Thermo Fisher Scientific公司;微量核酸蛋白检测仪ND-2000购自Thermo Fisher Scientific公司;Bio-Rad梯度PCR仪(veriti 96 well)购自Applied Biosystems公司;ABI7500荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司。
1.2 研究对象随机采取8名Ⅲ~Ⅳ期恶性肿瘤患者的外周血,年龄53~66岁,其中包括7名肺癌(4名鳞癌,2名腺癌,1名类癌)患者,1名胃腺癌患者;2名患者未行任何治疗,6名患者分别予以放化疗和(或)免疫和(或)靶向治疗。用含EDTA-K2(K3)抗凝剂的紫色管采集8例恶性肿瘤患者静脉血3 mL,4 ℃放置15 min,然后4 ℃ 2 000×g离心15 min;提取200 μL上清继续实验,剩余的上清置于-80 ℃冰箱中储存。取肺癌细胞株6株培养液4 mL,800×g离心5 min,取上清。本研究经本院伦理委员会评审通过(2016-研第054-01)。
1.3 实验方法 1.3.1 血浆中总RNA的提取取200 μL血浆(和细胞上清)加入1 mL QIAzol Lysis Reagent混匀;室温孵化5 min(15~25 ℃);加入3.5 μL PLACON RNA(1.6×108 copies/μL),混匀;之后操作参考说明书,提取总RNA。
1.3.2 RT-qPCR法检测血浆样本中内参照及PLACON的循环阈值(cycle threshold,CT)值采用ABI7500荧光定量PCR仪进行RT-qPCR检测。反应条件:预变性为95 ℃ 30 s;PCR反应为95 ℃ 5 s,57.6 ℃ 34 s,40循环;熔解曲线为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。
1.3.3 外参照(PLACON)序列设计为保证在人类基因组中进行高特异性目的基因的PCR扩增,拟从与人类种属基因组相似性相距甚远的低级别物种秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,T27E9.1d.39)的基因组选取外参照(PLACON)序列。理想的PLACON序列设计的要求:利于PCR扩增,与miRNAs前体序列长度相近,便于人工基因合成时有足够的精确度,拟选取50~60 nt长度的序列为宜;同时兼顾GC含量约50%,以控制合适的解链温度(melting temperature,Tm);排除具有发夹、连续重复碱基、易折叠等二级结构的序列,以防止PCR扩增中二聚体产生,使其在PCR过程中稳定扩增,不增加目的基因的非特异性扩增。利用正向引物(5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′)及反向引物(5′-CGACTCTACAACGACCGTGA-3′)进行PCR扩增筛选出PLACON序列:5′-CUCGCUAA-CGACUCUACAACGACCGUGAAUU CAAGCGCCGCUUG-GAUGUCCGC-3′。利用在线工具BLAST进行序列相似性检索(网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
1.4 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,分别统计血浆及细胞上清液中对照组(PLACON)和实验组(GAPDH、β-actin、U6)mRNA水平扩增CT的极差,数据以x±s表示,采用t检验和单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 外参照(PLACON)序列设计外参照碱基数为53、GC含量为56.6%、Tm值为87.1 ℃,无明显发夹等二级结构,是较为理想的外参照基因的序列设计。在线工具BLAST进行序列相似性检索结果显示,在人类基因组中未检索到任何相似序列,表明该PLACON序列具有完全的特异性,与人类基因组无交叉性。
2.2 血浆mRNA水平RT-qPCR熔解曲线熔解曲线显示所有标本中血浆mRNA水平PLACON、β-actin、GAPDH的产物熔解峰,扩增产物分别在84.2 ℃、85.4 ℃、87.0 ℃出现单一峰(图 1),提示RT-qPCR法可以检测血浆中mRNA的表达水平且具有较高的特异性。
2.3 PLACON用于血浆mRNA检测的比较分析
分别将PLACON稀释成10倍梯度浓度(0.005、0.05、0.5、5、50 ng/mL),采用RT-qPCR法获得血浆mRNA水平外参照CT值(n=6),依次为23.57±0.29、21.36±1.22、17.14±0.66、10.70±0.36、6.95±0.27,PLACON浓度和CT值呈明显的线性关系,显示出PLACON在血浆中扩增的稳定性、特异性和抗干扰性。当PLACON浓度为0.5 ng/mL时,用RT-qPCR法获得血浆mRNA水平PLACON与GAPDH、β-actin在恶性肿瘤患者血浆标本中的CT值,结果显示:PLACON组极差最小,波动范围小,PLACON在血浆mRNA水平中扩增的稳定性高于β-actin、GAPDH。PLACON组的CT值显著低于GAPDH、β-actin组(P < 0.01,表 1)。CT值愈小,扩增效率愈高,提示PLACON比β-actin、GAPDH的扩增效率高,更具有扩增优势。
组别 | x±s | 极差 |
PLACON组 | 15.81±0.88 | 2.87 |
β-actin组 | 25.45±2.85a | 8.36 |
GAPDH组 | 26.60±1.95a | 6.44 |
a:P < 0.01,与PLACON组比较 |
2.4 血浆miRNA水平RT-qPCR熔解曲线
熔解曲线显示所有标本中血浆miRNA水平PLACON、U6的产物熔解峰,扩增产物分别在84.2 ℃、81.6 ℃出现单一峰(图 2),提示RT-qPCR法可以检测血浆中miRNA的表达水平且具有较高的特异性。
2.5 PLACON用于血浆miRNA检测的比较分析
PLACON浓度为0.5 ng/mL时,用RT-qPCR法获得血浆miRNA水平PLACON同U6在恶性肿瘤患者血浆标本中的CT值,结果显示:PLACON、U6组间CT值极差分别为3.01、2.95,两组极差差异无统计学意义,波动范围均较小。PLACON的CT值为(16.20±0.93),显著低于U6组(19.49±1.01,P < 0.01)。虽然PLACON同U6的极差无明显差异,但PLACON扩增效率较U6高,仍有一定扩增优势。
2.6 细胞上清液mRNA水平RT-qPCR熔解曲线熔解曲线显示细胞上清液mRNA水平PLACON、β-actin、GAPDH的产物熔解峰,扩增产物分别在84.2 ℃、86.5 ℃、85.4 ℃出现单一峰(图 3),提示RT-qPCR法可以检测细胞上清液中mRNA的表达水平且具有较高的特异性。
2.7 PLACON用于细胞上清液mRNA检测的比较分析
分别将PLACON稀释成10倍梯度浓度(0.005、0.05、0.5、5 ng/mL),采用RT-qPCR法获得细胞上清液PLACON的CT值(n=3),依次为23.99±0.24、17.95±0.20、15.83±0.07、7.86±0.24,PLACON浓度和CT值呈明显的线性关系,提示PLACON在细胞上清液中扩增的稳定性、特异性和抗干扰性。PLACON浓度为0.5 ng/mL时,用RT-qPCR法获得PLACON同GAPDH、β-actin在肺癌细胞株细胞上清液中mRNA水平的CT值,结果显示:PLACON组极差仍为最小,稳定性最高。PLACON组的CT值显著低于GAPDH、β-actin组(P < 0.01,表 2)。其结果与PLACON在血浆mRNA、miRNA表达水平中扩增情况相似,均显示PLACON稳定性好,扩增效率更高,验证了PLACON比内参照的扩增效率高,更具有扩增优势。PLACON可应用于血浆mRNA、miRNA的定量检测。
组别 | x±s | 极差 |
PLACON组 | 17.00±1.29 | 3.42 |
GAPDH组 | 21.32±2.88a | 8.02 |
β-actin组 | 24.34±3.04a | 7.76 |
a:P < 0.01,与PLACON组比较 |
3 讨论
理想情况下,参照基因的表达都是普遍稳定,且不受实验条件的影响,参考基因的结构和序列必须能被识别[12]。在所有实验条件下(不同的品种、组织或器官、发育时期、生物或非生物胁迫等),一个具有普遍稳定表达的参照基因目前还未被发现[13]。目前,实验中常选择稳定表达的管家基因作为内参照基因(如β-actin、GAPDH、U6等),内参照基因的变化即反映样品制备及实验条件的变化[14-15]。其中,β-actin基因具有高度保守性、转录丰度较高以及表达的持续稳定性等特点,因此β-actin是RT-qPCR过程中的经典内参基因[16]。与其他编码蛋白的基因相比,GAPDH基因的进化速率较慢(5 PAMs每100万年),功能区序列高度保守,所以GAPDH经常被用作RT-qPCR的内参照基因[17]。在组织和细胞中,U6和GAPDH是RT-qPCR常用的参考基因[18],但血清中U6的表达易受冻融循环的影响[19],其在血清中的表达不恒定,故U6不适合作为血清RT-qPCR法核酸检测的内参照。作为内参照标准,这些基因在特定的组织或条件下应该是相对恒定的,但相关研究表明,管家基因的表达会因组织、细胞和疾病的不同阶段而变化[20-22]。盲目地使用管家基因作为不同实验条件下的内参照,将导致实验结果出现偏差。因此,选择合适的参照基因对于研究基因表达是至关重要的[23-24]。而采用外参照基因可以便于排除RNA提取过程的影响因素,提高RT-qPCR结果的准确性,以进行准确的数据分析[25-26]。
秀丽隐杆线虫具有繁殖速度快、世代周期短、通体透明、体细胞数目恒定、基因组小并被完全测序等优点[27-28]。故本研究中预先从秀丽隐杆线虫的基因组内找出的一段保守序列(即PLACON,图 1),具有合适的模板长度、GC含量、退火温度、无发夹结构等优势,并在BLAST上检索出该序列具备高度的特异性,与人类基因组完全无同源性,通过预实验证实这段序列能够在血浆中稳定扩增。并将PLACON同GAPDH、β-actin、U6分别在恶性肿瘤患者血浆mRNA和miRNA水平、肺癌细胞株细胞上清mRNA水平进行扩增,PLACON的CT值波动在15.81~17.00之间,而GAPDH、β-actin、U6的CT值为21.32~26.60、24.34~25.45、17.84~20.79,很明显PLACON的扩增效率更好。稳定性高低排序:血浆mRNA水平PLACON>GAPDH>β-actin;血浆miRNA水平PLACON同U6无明显区别;细胞上清mRNA水平PLACON>β-actin>GAPDH。CT值越小,说明基因扩增效率越高;CT值越大,说明基因扩增效率越低;极差越小,说明稳定性越高;极差越大,说明稳定性越低。PLACON组在血浆中和细胞上清液中mRNA水平扩增的CT值均显著低于GAPDH、β-actin组(P < 0.01)。PLACON组在血浆miRNA水平扩增的CT值显著低于U6组(P < 0.01)。PLACON组在细胞上清液mRNA水平扩增的CT值均显著低于GAPDH、β-actin组(P < 0.01),与PLACON在血浆mRNA、miRNA水平扩增的情况相似,验证了PLACON比内参照的稳定性更高,扩增效率更高,扩增优势更明显,可应用于血浆mRNA、miRNA的定量检测。
虽然绝对定量PCR已为成熟方法,但只限于核酸定量原理、操作技术、实验条件和常规内参照等内容,而如何选取参照基因、如何加入外参照技术步骤、如何摸索最优化定量PCR条件,甚至采血多少量和裂解反应时间,均是本研究的独特之处。本课题设计的血浆外参照PLACON适用于血浆mRNA和miRNA,因直接与内参照比较,具有显著的稳定性、扩增效率和普适性的优势,属于原始创新,并拥有完全自主产权,已申请发明专利进入实质性审查阶段(申请号:201810102695.2)。
综上所述,PLACON在血浆中扩增表达较内参照基因GAPDH、β-actin、U6具有可重复性、均一性、稳定性及高表达性,不仅在血浆中具有以上优势,在细胞上清中的表达中同样如此。在医学研究中,越来越多疾病的诊断、治疗、疗效评估及预后的预测依赖于mRNA及miRNA等分子学的表达水平[29]。本研究除了在血浆miRNA、mRNA水平上研究PLACON的稳定性和扩增效率优于内参照,还在细胞上清mRNA水平上进行验证,显示PLACON具有应用于其他方面核酸检测相关研究的潜能,PLACON表达的稳定性为检测结果的准确性提供了有力的保障,对今后的液态活检有着深远意义。比如,PD-L1是目前研究最新、最热的免疫检测点,对肿瘤免疫治疗,尤其是非小细胞肺癌免疫检测点抑制剂治疗(Checkmate057[30]、Keynote024[31]等)具有重要的临床价值。现PD-L1检测主要采用组织标本IHC,但对于组织标本不易获得、需要动态监测PD-L1表达、判断免疫治疗疗效和耐药分析等方面上具有很多局限性。液态活检将是很好的补充,已有研究显示,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)作为非侵入性方法可有效检测晚期NSCLC患者的PD-L1表达[32]。因此,本研究所设计的外参照有望对今后实现血浆PD-L1,甚至是血浆外泌体中PD-L1 mRNA水平的检测打下坚实的基础,从而获得简便、快捷、动态监测PD-L1和免疫治疗耐药分析的新途径,为肿瘤患者谋取最大化的利益。当然,在外参照基因序列的选取上是否可以选取其他微生物基因组中的序列,仍值得我们更进一步探索。
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