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1,25-二羟维生素D3对哮喘小鼠Ⅱ型固有淋巴细胞的影响
李程程, 武怡     
221000 江苏 徐州,徐州医科大学附属医院儿科
[摘要] 目的 观察1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]对哮喘小鼠肺来源Ⅱ型固有淋巴细胞(typeⅡinnate lymphoid cells,ILC2s)及相关细胞因子的影响。方法 将24只4~6周龄BALB/c雌性小鼠按随机数字法分为对照组、哮喘组、干预组,每组8只。哮喘组、干预组通过腹腔注射卵清蛋白致敏及雾化激发建立哮喘模型,对照组以PBS替代。干预组在激发前30 min腹腔注射1,25-(OH)2-D3混合液0.08 mL[含1,25-(OH)2-D3 0.08 μg],对照组、哮喘组以PBS替代。末次激发24 h后,行肺泡灌洗术,留取肺泡灌洗液(BALF)进行炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数;采用ELISA检测BALF中炎性因子白细胞介素33(IL-33)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素13(IL-13)的表达;HE染色观察小鼠肺部病理变化;qRT-PCR检测肺组织抑瘤因子2(suppressor of tumorigenicity 2,ST-2)、可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA表达;流式细胞仪检测肺来源ILC2s比例变化;分析BALF中EOS计数、IL-33表达与ILC2s,IL-33与IL-13的相关性。结果 哮喘组气道形态改变及炎症细胞浸润较对照组加重;干预组较哮喘组减轻。哮喘组及干预组BALF中炎性细胞总数、EOS计数、IL-33、IL-13、IL-5表达以及肺来源ILC2s(lineage-ICOS+ST-2+)比例均高于对照组(P < 0.01);干预组BALF中IL-5表达与哮喘组比较差异无统计学意义,其余指标均低于哮喘组(P < 0.01)。哮喘组及干预组肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA表达均高于对照组(P < 0.01);干预组IL-5 mRNA表达高于哮喘组(P < 0.05),其余指标均低于哮喘组(P < 0.05)。BALF中EOS计数与ILC2s比例、IL-33表达与ILC2s比例、IL-33与IL-13表达均呈正相关关系(r=0.854、0.757、0.886,P < 0.05)。结论 1,25-(OH)2-D3可通过抑制IL-33/ST-2通路调节ILC2s活化,减少IL-13分泌,改善哮喘小鼠气道炎症,而对IL-5无明显抑制。
[关键词] 哮喘     1,25-二羟维生素D3     Ⅱ型固有淋巴细胞     白细胞介素13     白细胞介素33     抑瘤因子2    
Effect of 1,25-dihydroxy vitamin D3 on expression of pro-inflammatory cytokines in type Ⅱ innate lymphoid cells in asthmatic mice
LI Chengcheng, WU Yi     
Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou, Jiangsu Province, 221000, China
[Abstract] Objective To investigate the effect of 1,25-dihydroxy vitamin D3 [1,25-(OH)2-D3] on the expression of pro-inflammatory cytokines in type Ⅱ innate lymphoid cells (ILC2s) in asthmatic mice. Methods Twenty-four female BALB/c mice aged 4 to 6 weeks were randomly divided into control group, asthma group and intervention group (n=8). In the asthma group and intervention group, mouse models of asthma were established by intraperitoneal injection and aerosol inhalation of ovalbumin; PBS was used instead in the control group. In the intervention group, the mice received intraperitoneal injection of a mixture of 0.08 mL containing 0.08 μg 1,25-(OH)2-D3 30 min before ovalbumin challenge. At 24 h after the last challenge, alveolar lavage was performed, and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected for assessing the counts of the total inflammatory cells and eosinophils (EOS) and the levels of interleukin-33 (IL-33), IL-5 and IL-13 using ELISA. The pathological changes of the lungs were examined using HE staining. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the mRNA expression of suppressor of tumorigenicity 2 (ST-2), inducible costimulator (ICOS), IL-33, IL-5 and IL-13 in the lung tissues. Flow cytometry was performed to analyze the changes in the proportion of lung-derived ILC2s. The correlations of ILC2s with EOS count and IL-33 expression and the correlation between IL-33 and IL-13 in the BALF were analyzed. Results The asthmatic mice showed obvious morphological changes and inflammatory cell infiltration in the airway, and these pathological changes were significantly lessened in the intervention group. The total inflammatory cell count, EOS count, levels of IL-33, IL-13, and IL-5, and the ratio of lung-derived ILC2s (lineage- ICOS+ST-2+) were significantly higher in the asthmatic group and the intervention group than in the control group (P < 0.01), and were significantly lower in the intervention group than in the asthma group (P < 0.01) with the exception of IL-5 level that was comparable between the 2 groups. The expression levels of ST-2, ICOS, IL-33, IL-5 and IL-13 mRNAs in the lung tissue were significantly higher in the asthma group and intervention group than in the control group (P < 0.01); compared with those in the asthma group, the expression of IL-5 mRNA was significantly increased (P < 0.05) and all the other indexes were significantly lowered in the intervention group (P < 0.05). Positive correlations were found between EOS count and ILC2s ratio in the BALF, between IL-33 expression and ILC2s ratio, and between IL-33 and IL-13 expression in the BALF (r=0.854, 0.757, and 0.886, respectively; P < 0.05). Conclusion 1,25-(OH)2-D3 can inhibit the activation of ILC2s and IL-13 production by inhibiting IL-33/ST-2 pathway to alleviate airway inflammation in asthmatic mice, but it does not significantly affect IL-5 production by ILC2s.
[Key words] asthma     1,25-dihydroxy vitamin D3     type Ⅱ innate lymphoid cells     interleukin-13     interleukin-33     suppressor of tumorigenicity 2    

支气管哮喘(哮喘)是呼吸系统常见疾病,具有易反复和病程长的特点,严重影响患者身心健康。维生素D在钙、磷及骨骼代谢中的作用是众所周知的,其中1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]是维生素D的主要生物活性形式。近年来,维生素D的免疫调节作用在多领域受到广泛关注。现有研究结果表明:低维生素D水平与气道高反应性、肺功能下降、哮喘控制不良及激素抵抗型哮喘相关[1-4]。临床试验发现:在儿童及成人中补充维生素D能够降低哮喘的严重程度,延缓哮喘复发,更好地控制哮喘[5-6]。但维生素D对于哮喘的防治仍缺乏可靠的生物学证据。Ⅱ型固有淋巴细胞(typeⅡinnate lymphoid cells,ILC2s)是新近发现的固有免疫相关细胞,因其能够分泌Th2型细胞因子IL-13、IL-5、IL-4,促进哮喘的发生、发展而备受重视。而维生素D能否调节哮喘相关ILC2s的作用尚不清楚。本课题通过研究1,25-(OH)2-D3对哮喘小鼠ILC2细胞及相关细胞因子影响,以期为探寻哮喘全身免疫治疗的新途径提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂

4~6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只,体质量(20±1.8)g,购自上海动物资源中心,饲养于徐州医科大学实验动物中心,适应性饲养1周。主要试剂:卵清蛋白(OVA)、氢氧化铝、1,25-(OH)2-D3(美国Sigma公司);TRIzol、逆转录试剂盒(江苏溥博生物科技有限公司);引物合成(上海生物工程有限公司);IL-5、IL-13及IL-33 ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司);抗Lineage-FITC抗体、抗CD278-PerCP(ICOS)/Cy5.5抗体(美国Biolegend公司),抗ST-2-PE抗体(美国eBioscience公司),Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和哮喘小鼠模型的制备

将24只BALB/c雌性小鼠按随机数字法分为对照组、哮喘组和干预组,每组8只。动物模型的建立参照文献[7]方法,稍作调整。哮喘组和干预组在第1、8、15天腹腔注射OVA混合液0.2 mL(含OVA 50 μg、10%氢氧化铝0.15 mL和生理盐水0.05 mL)致敏,对照组用PBS替代。第22天开始,哮喘组和干预组雾化吸入2%OVA激发,每日1次,每次60 min,雾化激发1周,共计7次。对照组雾化吸入PBS。干预组每次激发前30 min腹腔注射1,25-(OH)2-D3混合液0.08 mL[含1,25-(OH)2-D3 0.08 μg、生理盐水0.08 mL和无水乙醇2.0 μL]。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数

末次雾化激发24 h后,颈椎脱臼处死小鼠,开胸暴露气管及肺脏,迅速结扎左主支气管,行右肺灌洗,回收BALF,于4 ℃低温离心机离心,取上清液保存于-80 ℃冰箱,行ELISA检测;细胞沉淀经PBS重悬后行炎症细胞总数及EOS分类计数。

1.2.3 HE染色观察小鼠肺部病理变化

取部分左肺于甲醛固定48 h后,石蜡包埋切片, 每张玻片贴2张切片,行HE染色,光镜下观察肺组织的病理改变,每张切片随机选取5个以上高倍镜视野进行观察。

1.2.4 qRT-PCR检测肺组织抑瘤因子2(suppressor of tumorigenicity 2,ST-2)、可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA的表达

用左肺下叶制作组织匀浆,提取总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度及D(260)/D(280)比值,按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA。内参及引物序列:β-actin,上游引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′,下游引物5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATT-3′,片段长度227 bp;IL-5,上游引物5′-AAGTGCTGGAGATGGAACCC-3′,下游引物5′-TCAGCCTGGAATACTTGAG-ACC-3′,片段长度106 bp;IL-13,上游引物5′-GCTCTTGCTTGCCTTGGTG-3′,下游引物5′-ACAGGGGAGTCT-GGTCTTGTG-3′,片段长度124 bp;IL-33,上游引物5′-CGCTACTATGAGTCTCCCTGTCC-3′,下游引物5′-CGGAGTAGTCCTTGTCGTTGG-3′,片段长度133 bp;ST-2,上游引物5′-TTGCCTACGAGCAGGAGATTG-3′,下游引物5′-GTCGGCTTGCCTCACCCA-3′,片段长度99 bp;ICOS,上游引物5′-CCGTGTCTTTGTCTTCTGCTTC-3′,下游引物5′-TTCCCTTGGTCTTGGTGAGTT-3′,片段长度194 bp。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃30 s,共40个循环。每样品3复孔。

1.2.5 ELISA检测BALF中IL-33、IL-5及IL-13表达

按ELISA试剂盒说明书进行检测,采用酶标仪在450 nm处测光密度值[D(450)],根据拟合曲线,将D(450)值转换为浓度。

1.2.6 流式细胞仪检测肺来源ILC2s比例

取新鲜肺组织剪碎,加入5 mL 0.5%Ⅰ型胶原酶、1 mL CaCl2研磨消化,37 ℃恒温水浴箱消化2 h,过200目筛网,加入红细胞裂解液(ACK),PBS洗涤2次;滴加台盼蓝行细胞计数;加入抗Hematopoietic Lineage-FITC抗体、抗CD278(ICOS-PerCP/Cy5.5)抗体、抗ST2-PE抗体,混匀后4 ℃避光染色50 min;离心弃去上清;PBS洗涤2次;加入200 μL PBS重悬,上机检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件。计量数据采用x ±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,方差齐时,组间比较采用LSD法,方差不齐时,组间比较采用Dunnett’s T3法。P < 0.05为差异有统计学意义。Pearson相关分析BALF中EOS计数、IL-33表达与ILC2s百分比的相关性,BALF中IL-33与IL-13的相关性。采用GraphPad Prism 6软件绘制统计图。

2 结果 2.1 肺组织形态学观察

各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示:对照组小鼠支气管壁结构完整,管壁无皱褶,上皮细胞形态正常,无明显炎症细胞浸润;哮喘组病理改变明显,可见支气管管腔狭窄,管壁皱褶,大量炎性细胞浸润,上皮细胞肿胀,黏液分泌明显增多,黏液栓形成;干预组病理改变较哮喘组减轻(图 1)。

A:对照组,B:哮喘组,C:干预组 图 1 HE染色观察各组小鼠肺组织形态(×400)

2.2 BALF中炎性细胞总数及EOS计数

与对照组比较,哮喘组、干预组炎性细胞总数和EOS计数均升高(P < 0.01),干预组较哮喘组降低(P < 0.01,表 1)。

表 1 各组BALF中炎性细胞总数及EOS计数(104 /mL, n=8, x ±s)
组别 炎性细胞总数 EOS计数
对照组 5.91±1.08 0.11±0.06
哮喘组 20.01±2.55a 3.55±0.64a
干预组 13.75±1.64ab 1.45±0.36ab
F 115.624 134.405
P < 0.001 < 0.001
a: P < 0.01, 与对照组比较;b: P < 0.01, 与哮喘组比较

2.3 BALF中IL-13、IL-5及IL-33表达的变化

ELISA检测结果显示:哮喘组、干预组BALF中IL-33、IL-13、IL-5表达较对照组升高(P < 0.01);干预组IL-33、IL-13表达较哮喘组降低(P < 0.01),但IL-5表达与哮喘组比较差异无统计学意义(表 2)。

表 2 各组BALF中IL-13、IL-5及IL-33表达(pg/mL,n=8, x ±s)
组别 IL-13 IL-5 IL-33
对照组 14.29±2.93 55.25±10.97 54.52±15.21
哮喘组 48.48±6.96a 102.00±16.02a 156.90±23.59a
干预组 31.64±3.22ab 96.57±10.83a 119.62±17.86ab
F 104.122 31.743 58.243
P < 0.001 < 0.001 < 0.001
a: P < 0.01, 与对照组比较;b: P < 0.01, 与哮喘组比较

2.4 肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5及IL-13 mRNA表达的变化

qRT-PCR检测结果显示:哮喘组肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA表达高于对照组(P < 0.01);干预组小鼠肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-13 mRNA表达较哮喘组下降(P < 0.05),IL-5 mRNA表达较哮喘组升高(P < 0.05,表 3)。

表 3 肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5及IL-13 mRNA表达(n=8,x ±s)
组别 ICOS ST-2 IL-13 IL-5 IL-33
对照组 1.04±0.32 1.05±0.35 1.15±0.67 1.15±0.71 1.03±0.26
哮喘组 4.70±1.92a 8.51±2.70a 16.87±9.25a 10.89±5.54a 4.67±1.60a
干预组 2.08±0.65ab 4.90±1.79ab 5.73±2.56ab 23.39±9.92ab 2.15±0.98ac
F 20.229 31.525 16.446 23.025 23.392
P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001
a: P < 0.01, 与对照组比较;b: P < 0.05, c: P < 0.01, 与哮喘组比较

2.5 肺来源ILC2s比例的变化

流式细胞仪检测结果显示:哮喘组、干预组肺来源ILC2s(lineage- ICOS+ST-2+)百分比较对照组升高(P < 0.01),干预组较哮喘组降低(P < 0.01,图 2)。

A:流式细胞仪检测右上象限(Q2)群为ILC2s(lineage-ICOS+ST2+);B:ILC2s比例分析a:P < 0.01, 与对照组比较;b: P < 0.01,与干预组比较 图 2 流式细胞仪检测各组肺来源ILC2s比例

2.6 EOS计数、IL-33与ILC2s及IL-33与IL-13间相关性分析

EOS计数与ILC2s比例、IL-33表达与ILC2s比例、IL-33与IL-13表达均呈正相关关系(r=0.854、0.757、0.886,P < 0.05,图 3~5)。

图 3 BALF中EOS计数与肺来源ILC2s比例相关性分析

图 4 BALF中IL-33表达与肺来源ILC2s比例相关性分析

图 5 BALF中IL-33与IL-13表达相关性分析

3 讨论

哮喘的发病机制尚不完全清楚。Th1/Th2比值失衡是哮喘发生发展的基础,但该理论并不能解释所有类型哮喘的病理机制。ILC2s是新近发现的来源于骨髓淋巴祖细胞的固有免疫细胞,其活化依赖转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3, GATA3)、B细胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukaemia 11B, Bcl11b)、维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptor α, RORα)、转录因子1(transcription factor 1, TCF-1)、独立生长因子1(growth factor independence 1, Gfi1)以及上皮细胞来源的IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)和IL-25等[8-9]。激活的ILC2s表面表达CD90、CD25、CD278、ST-2等,同时能够产生多种细胞因子、趋化因子和肽物质,包括IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、嗜酸性粒细胞趋化因子和甲硫氨酸脑啡肽等。其中Th2型细胞因子在防治寄生虫感染中起关键作用,同时还参与了哮喘、过敏性皮炎、嗜酸性食管炎、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎及鼻息肉等疾病的病理过程[10-11]。研究显示:在哮喘动物模型气道炎症反应中,ILC2s能迅速活化释放大量致炎因子IL-5和IL-13[12]。ILC2s在不依赖T辅助细胞的作用下即可早期分泌Th2型细胞因子促进哮喘的发生、发展, 而与野生型小鼠相较,ILC2s缺陷小鼠致敏后Th2细胞活化显著减少,炎症反应减弱,提示ILC2s能驱动Th2细胞的分化[13-14]。研究发现肺内ILC2s在过敏原暴露早期即能产生大量IL-5和IL-13,诱导气道嗜酸性粒细胞浸润、黏液分泌,引起气道高反应性,并有助于启动和维持适应性2型免疫应答[15]。这些结果显示ILC2s参与哮喘发展的病理生理过程并起到关键作用。IL-33是IL-1相关的核细胞因子。ST-2是IL-1受体家族的新成员,存在4种亚型,可与IL-33特异性结合,参与炎症及变态反应性疾病的病理生理过程。IL-33与ST-2结合,可以活化Th2细胞,促进释放多种促炎因子,在炎症的发生、发展过程中起重要作用[16]。IL-33已被证明可以通过ST-2受体信号通路促进ILC2s在体外和体内的扩张[17-19]。KEARLEY等[20]发现持续气道高反应与IL-33/ST-2通路有关,用抗体阻断IL-33的ST-2受体可减少Th2型细胞因子IL-13、IL-4的分泌,减轻气道高反应和过敏性炎症。孙亚林[21]研究发现:补充维生素D能抑制哮喘小鼠IL-33表达,从而减轻炎症反应,因此,我们猜测维生素D有可能通过抑制IL-33/ST-2通路调节ILC2s的活化。

维生素D的作用通常是免疫抑制,它的缺乏与自身免疫和过敏性疾病的高易感性有关[22-23]。维生素D可调节多种免疫细胞,参与固有免疫及适应性免疫应答。本研究建立了雌性小鼠哮喘模型,发现哮喘组小鼠肺部出现典型哮喘的病理改变,BALF炎性细胞总数、EOS计数及炎性因子的表达均较对照组明显增强, 而维生素D干预组上述表现较哮喘组明显减轻,可见维生素D干预治疗能有效减轻哮喘炎症反应,上述结果与既往研究[7, 24]一致。同时,本研究发现在哮喘组及干预组中,肺部ILC2s表面标记物ST-2和ICOS(CD278)mRNA表达及ILC2s活化较对照组显著增强,且ILC2s的活化与EOS呈正相关,提示ILC2s参与了哮喘的病理生理过程,与上述结论一致[12]。经维生素D干预后,小鼠肺部ILC2s比例较哮喘组显著下降。有研究表明维生素D能减少呼吸道上皮细胞TSLP和IL-33的表达[25],抑制人外周血单核细胞(PBMC)中的ILC2s细胞活化[26]。因此,我们认为维生素D可能通过抑制哮喘小鼠ILC2s的活化减缓哮喘炎症反应。本研究观察到:给予1,25-(OH)2-D3后,IL-33/ST-2信号通路及ILC2s活化均被抑制,IL-33的下降与ILC2s及其细胞因子IL-13的抑制均呈正相关关系。因此,我们认为在模型鼠体内维生素D可能通过抑制IL-33/ST-2信号通路调节ILC2s的活化及功能,减缓哮喘炎症反应。但在研究中同时发现:维生素D对炎症因子IL-5无明显抑制作用,考虑Th2细胞可能是IL-5的主要来源,而维生素D对过敏性反应炎症中Th2的影响尚不完全明确。吸入糖皮质激素仍是控制哮喘的经典手段,但仅通过气道局部用药并不能完全抑制全身哮喘变态炎性反应。有实验数据表明:维生素D能增加对糖皮质激素的治疗反应,并可能作为激素耐药性哮喘患者的附加治疗药物[27],但其机制尚不完全清楚。KABATA等[28]研究发现:在激素抵抗型哮喘中,糖皮质激素不能有效抑制由IL-33介导的ILC2s的作用。根据本研究结果,可推测维生素D能够通过负向调控ILC2s协同激素治疗哮喘。

综上所述,适量维生素D3能够减轻哮喘的炎症反应,通过抑制ILC2s的生物学效应发挥免疫调控作用。本研究为临床补充维生素D提供了部分理论依据,但仍需进一步研究维生素以及协同激素治疗哮喘的机制。维生素D的补充有望成为哮喘治疗的新途径。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201812111
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

李程程, 武怡.
LI Chengcheng, WU Yi.
1,25-二羟维生素D3对哮喘小鼠Ⅱ型固有淋巴细胞的影响
Effect of 1,25-dihydroxy vitamin D3 on expression of pro-inflammatory cytokines in type Ⅱ innate lymphoid cells in asthmatic mice
第三军医大学学报, 2019, 41(12): 1095-1101
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(12): 1095-1101
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201812111

文章历史

收稿: 2018-12-13
修回: 2019-01-26

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