支气管哮喘(哮喘)是呼吸系统常见疾病，具有易反复和病程长的特点，严重影响患者身心健康。维生素D在钙、磷及骨骼代谢中的作用是众所周知的，其中1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]是维生素D的主要生物活性形式。近年来，维生素D的免疫调节作用在多领域受到广泛关注。现有研究结果表明：低维生素D水平与气道高反应性、肺功能下降、哮喘控制不良及激素抵抗型哮喘相关[1-4]。临床试验发现：在儿童及成人中补充维生素D能够降低哮喘的严重程度，延缓哮喘复发，更好地控制哮喘[5-6]。但维生素D对于哮喘的防治仍缺乏可靠的生物学证据。Ⅱ型固有淋巴细胞(typeⅡinnate lymphoid cells，ILC2s)是新近发现的固有免疫相关细胞，因其能够分泌Th2型细胞因子IL-13、IL-5、IL-4，促进哮喘的发生、发展而备受重视。而维生素D能否调节哮喘相关ILC2s的作用尚不清楚。本课题通过研究1,25-(OH)2-D3对哮喘小鼠ILC2细胞及相关细胞因子影响，以期为探寻哮喘全身免疫治疗的新途径提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂4~6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只，体质量(20±1.8)g，购自上海动物资源中心，饲养于徐州医科大学实验动物中心，适应性饲养1周。主要试剂：卵清蛋白(OVA)、氢氧化铝、1,25-(OH)2-D3(美国Sigma公司)；TRIzol、逆转录试剂盒(江苏溥博生物科技有限公司)；引物合成(上海生物工程有限公司)；IL-5、IL-13及IL-33 ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；抗Lineage-FITC抗体、抗CD278-PerCP(ICOS)/Cy5.5抗体(美国Biolegend公司)，抗ST-2-PE抗体(美国eBioscience公司)，Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物分组和哮喘小鼠模型的制备将24只BALB/c雌性小鼠按随机数字法分为对照组、哮喘组和干预组，每组8只。动物模型的建立参照文献[7]方法，稍作调整。哮喘组和干预组在第1、8、15天腹腔注射OVA混合液0.2 mL(含OVA 50 μg、10%氢氧化铝0.15 mL和生理盐水0.05 mL)致敏，对照组用PBS替代。第22天开始，哮喘组和干预组雾化吸入2%OVA激发，每日1次，每次60 min，雾化激发1周，共计7次。对照组雾化吸入PBS。干预组每次激发前30 min腹腔注射1,25-(OH)2-D3混合液0.08 mL[含1,25-(OH)2-D3 0.08 μg、生理盐水0.08 mL和无水乙醇2.0 μL]。
1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数末次雾化激发24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，开胸暴露气管及肺脏，迅速结扎左主支气管，行右肺灌洗，回收BALF，于4 ℃低温离心机离心，取上清液保存于-80 ℃冰箱，行ELISA检测；细胞沉淀经PBS重悬后行炎症细胞总数及EOS分类计数。
1.2.3 HE染色观察小鼠肺部病理变化取部分左肺于甲醛固定48 h后，石蜡包埋切片, 每张玻片贴2张切片，行HE染色，光镜下观察肺组织的病理改变，每张切片随机选取5个以上高倍镜视野进行观察。
1.2.4 qRT-PCR检测肺组织抑瘤因子2(suppressor of tumorigenicity 2，ST-2)、可诱导共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA的表达用左肺下叶制作组织匀浆，提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及D(260)/D(280)比值，按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA。内参及引物序列：β-actin，上游引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATT-3′，片段长度227 bp；IL-5，上游引物5′-AAGTGCTGGAGATGGAACCC-3′，下游引物5′-TCAGCCTGGAATACTTGAG-ACC-3′，片段长度106 bp；IL-13，上游引物5′-GCTCTTGCTTGCCTTGGTG-3′，下游引物5′-ACAGGGGAGTCT-GGTCTTGTG-3′，片段长度124 bp；IL-33，上游引物5′-CGCTACTATGAGTCTCCCTGTCC-3′，下游引物5′-CGGAGTAGTCCTTGTCGTTGG-3′，片段长度133 bp；ST-2，上游引物5′-TTGCCTACGAGCAGGAGATTG-3′，下游引物5′-GTCGGCTTGCCTCACCCA-3′，片段长度99 bp；ICOS，上游引物5′-CCGTGTCTTTGTCTTCTGCTTC-3′，下游引物5′-TTCCCTTGGTCTTGGTGAGTT-3′，片段长度194 bp。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，共40个循环。每样品3复孔。
1.2.5 ELISA检测BALF中IL-33、IL-5及IL-13表达按ELISA试剂盒说明书进行检测，采用酶标仪在450 nm处测光密度值[D(450)]，根据拟合曲线，将D(450)值转换为浓度。
1.2.6 流式细胞仪检测肺来源ILC2s比例取新鲜肺组织剪碎，加入5 mL 0.5%Ⅰ型胶原酶、1 mL CaCl2研磨消化，37 ℃恒温水浴箱消化2 h，过200目筛网，加入红细胞裂解液(ACK)，PBS洗涤2次；滴加台盼蓝行细胞计数；加入抗Hematopoietic Lineage-FITC抗体、抗CD278(ICOS-PerCP/Cy5.5)抗体、抗ST2-PE抗体，混匀后4 ℃避光染色50 min；离心弃去上清；PBS洗涤2次；加入200 μL PBS重悬，上机检测。
1.3 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件。计量数据采用x ±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐时，组间比较采用LSD法，方差不齐时，组间比较采用Dunnett’s T3法。P < 0.05为差异有统计学意义。Pearson相关分析BALF中EOS计数、IL-33表达与ILC2s百分比的相关性，BALF中IL-33与IL-13的相关性。采用GraphPad Prism 6软件绘制统计图。
2 结果 2.1 肺组织形态学观察各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示：对照组小鼠支气管壁结构完整，管壁无皱褶，上皮细胞形态正常，无明显炎症细胞浸润；哮喘组病理改变明显，可见支气管管腔狭窄，管壁皱褶，大量炎性细胞浸润，上皮细胞肿胀，黏液分泌明显增多，黏液栓形成；干预组病理改变较哮喘组减轻(图 1)。
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| A:对照组，B:哮喘组，C:干预组 图 1 HE染色观察各组小鼠肺组织形态(×400) |
2.2 BALF中炎性细胞总数及EOS计数
与对照组比较，哮喘组、干预组炎性细胞总数和EOS计数均升高(P < 0.01)，干预组较哮喘组降低(P < 0.01，表 1)。
| 组别 | 炎性细胞总数 | EOS计数 |
| 对照组 | 5.91±1.08 | 0.11±0.06 |
| 哮喘组 | 20.01±2.55a | 3.55±0.64a |
| 干预组 | 13.75±1.64ab | 1.45±0.36ab |
| F值 | 115.624 | 134.405 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 |
| a: P < 0.01, 与对照组比较；b: P < 0.01, 与哮喘组比较 | ||
2.3 BALF中IL-13、IL-5及IL-33表达的变化
ELISA检测结果显示：哮喘组、干预组BALF中IL-33、IL-13、IL-5表达较对照组升高(P < 0.01)；干预组IL-33、IL-13表达较哮喘组降低(P < 0.01)，但IL-5表达与哮喘组比较差异无统计学意义(表 2)。
| 组别 | IL-13 | IL-5 | IL-33 |
| 对照组 | 14.29±2.93 | 55.25±10.97 | 54.52±15.21 |
| 哮喘组 | 48.48±6.96a | 102.00±16.02a | 156.90±23.59a |
| 干预组 | 31.64±3.22ab | 96.57±10.83a | 119.62±17.86ab |
| F值 | 104.122 | 31.743 | 58.243 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| a: P < 0.01, 与对照组比较；b: P < 0.01, 与哮喘组比较 | |||
2.4 肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5及IL-13 mRNA表达的变化
qRT-PCR检测结果显示：哮喘组肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-5、IL-13 mRNA表达高于对照组(P < 0.01)；干预组小鼠肺组织ST-2、ICOS、IL-33、IL-13 mRNA表达较哮喘组下降(P < 0.05)，IL-5 mRNA表达较哮喘组升高(P < 0.05，表 3)。
| 组别 | ICOS | ST-2 | IL-13 | IL-5 | IL-33 |
| 对照组 | 1.04±0.32 | 1.05±0.35 | 1.15±0.67 | 1.15±0.71 | 1.03±0.26 |
| 哮喘组 | 4.70±1.92a | 8.51±2.70a | 16.87±9.25a | 10.89±5.54a | 4.67±1.60a |
| 干预组 | 2.08±0.65ab | 4.90±1.79ab | 5.73±2.56ab | 23.39±9.92ab | 2.15±0.98ac |
| F值 | 20.229 | 31.525 | 16.446 | 23.025 | 23.392 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| a: P < 0.01, 与对照组比较；b: P < 0.05, c: P < 0.01, 与哮喘组比较 | |||||
2.5 肺来源ILC2s比例的变化
流式细胞仪检测结果显示：哮喘组、干预组肺来源ILC2s(lineage- ICOS+ST-2+)百分比较对照组升高(P < 0.01)，干预组较哮喘组降低(P < 0.01，图 2)。
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| A:流式细胞仪检测右上象限(Q2)群为ILC2s(lineage-ICOS+ST2+)；B:ILC2s比例分析a:P < 0.01, 与对照组比较；b: P < 0.01，与干预组比较 图 2 流式细胞仪检测各组肺来源ILC2s比例 |
2.6 EOS计数、IL-33与ILC2s及IL-33与IL-13间相关性分析
EOS计数与ILC2s比例、IL-33表达与ILC2s比例、IL-33与IL-13表达均呈正相关关系(r=0.854、0.757、0.886，P < 0.05，图 3~5)。
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| 图 3 BALF中EOS计数与肺来源ILC2s比例相关性分析 |
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| 图 4 BALF中IL-33表达与肺来源ILC2s比例相关性分析 |
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| 图 5 BALF中IL-33与IL-13表达相关性分析 |
3 讨论
哮喘的发病机制尚不完全清楚。Th1/Th2比值失衡是哮喘发生发展的基础，但该理论并不能解释所有类型哮喘的病理机制。ILC2s是新近发现的来源于骨髓淋巴祖细胞的固有免疫细胞，其活化依赖转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3, GATA3)、B细胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukaemia 11B, Bcl11b)、维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptor α, RORα)、转录因子1(transcription factor 1, TCF-1)、独立生长因子1(growth factor independence 1, Gfi1)以及上皮细胞来源的IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)和IL-25等[8-9]。激活的ILC2s表面表达CD90、CD25、CD278、ST-2等，同时能够产生多种细胞因子、趋化因子和肽物质，包括IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、嗜酸性粒细胞趋化因子和甲硫氨酸脑啡肽等。其中Th2型细胞因子在防治寄生虫感染中起关键作用，同时还参与了哮喘、过敏性皮炎、嗜酸性食管炎、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎及鼻息肉等疾病的病理过程[10-11]。研究显示：在哮喘动物模型气道炎症反应中，ILC2s能迅速活化释放大量致炎因子IL-5和IL-13[12]。ILC2s在不依赖T辅助细胞的作用下即可早期分泌Th2型细胞因子促进哮喘的发生、发展, 而与野生型小鼠相较，ILC2s缺陷小鼠致敏后Th2细胞活化显著减少，炎症反应减弱，提示ILC2s能驱动Th2细胞的分化[13-14]。研究发现肺内ILC2s在过敏原暴露早期即能产生大量IL-5和IL-13，诱导气道嗜酸性粒细胞浸润、黏液分泌，引起气道高反应性，并有助于启动和维持适应性2型免疫应答[15]。这些结果显示ILC2s参与哮喘发展的病理生理过程并起到关键作用。IL-33是IL-1相关的核细胞因子。ST-2是IL-1受体家族的新成员，存在4种亚型，可与IL-33特异性结合，参与炎症及变态反应性疾病的病理生理过程。IL-33与ST-2结合，可以活化Th2细胞，促进释放多种促炎因子，在炎症的发生、发展过程中起重要作用[16]。IL-33已被证明可以通过ST-2受体信号通路促进ILC2s在体外和体内的扩张[17-19]。KEARLEY等[20]发现持续气道高反应与IL-33/ST-2通路有关，用抗体阻断IL-33的ST-2受体可减少Th2型细胞因子IL-13、IL-4的分泌，减轻气道高反应和过敏性炎症。孙亚林[21]研究发现：补充维生素D能抑制哮喘小鼠IL-33表达，从而减轻炎症反应，因此，我们猜测维生素D有可能通过抑制IL-33/ST-2通路调节ILC2s的活化。
维生素D的作用通常是免疫抑制，它的缺乏与自身免疫和过敏性疾病的高易感性有关[22-23]。维生素D可调节多种免疫细胞，参与固有免疫及适应性免疫应答。本研究建立了雌性小鼠哮喘模型，发现哮喘组小鼠肺部出现典型哮喘的病理改变，BALF炎性细胞总数、EOS计数及炎性因子的表达均较对照组明显增强, 而维生素D干预组上述表现较哮喘组明显减轻，可见维生素D干预治疗能有效减轻哮喘炎症反应，上述结果与既往研究[7, 24]一致。同时，本研究发现在哮喘组及干预组中，肺部ILC2s表面标记物ST-2和ICOS(CD278)mRNA表达及ILC2s活化较对照组显著增强，且ILC2s的活化与EOS呈正相关，提示ILC2s参与了哮喘的病理生理过程，与上述结论一致[12]。经维生素D干预后，小鼠肺部ILC2s比例较哮喘组显著下降。有研究表明维生素D能减少呼吸道上皮细胞TSLP和IL-33的表达[25]，抑制人外周血单核细胞(PBMC)中的ILC2s细胞活化[26]。因此，我们认为维生素D可能通过抑制哮喘小鼠ILC2s的活化减缓哮喘炎症反应。本研究观察到：给予1,25-(OH)2-D3后，IL-33/ST-2信号通路及ILC2s活化均被抑制，IL-33的下降与ILC2s及其细胞因子IL-13的抑制均呈正相关关系。因此，我们认为在模型鼠体内维生素D可能通过抑制IL-33/ST-2信号通路调节ILC2s的活化及功能，减缓哮喘炎症反应。但在研究中同时发现：维生素D对炎症因子IL-5无明显抑制作用，考虑Th2细胞可能是IL-5的主要来源，而维生素D对过敏性反应炎症中Th2的影响尚不完全明确。吸入糖皮质激素仍是控制哮喘的经典手段，但仅通过气道局部用药并不能完全抑制全身哮喘变态炎性反应。有实验数据表明：维生素D能增加对糖皮质激素的治疗反应，并可能作为激素耐药性哮喘患者的附加治疗药物[27]，但其机制尚不完全清楚。KABATA等[28]研究发现：在激素抵抗型哮喘中，糖皮质激素不能有效抑制由IL-33介导的ILC2s的作用。根据本研究结果，可推测维生素D能够通过负向调控ILC2s协同激素治疗哮喘。
综上所述，适量维生素D3能够减轻哮喘的炎症反应，通过抑制ILC2s的生物学效应发挥免疫调控作用。本研究为临床补充维生素D提供了部分理论依据，但仍需进一步研究维生素以及协同激素治疗哮喘的机制。维生素D的补充有望成为哮喘治疗的新途径。
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