胃癌是常见的消化道恶性肿瘤, 据国家肿瘤登记中心统计, 我国2015年胃癌新发病例约67.9万, 死亡病例约49.8万, 在我国恶性肿瘤中高居第2位[1]。由于胃癌早期检出率低, 多数患者首次就诊即被确诊为晚期, 严重影响患者预后及生存率[2]。随着内镜技术的发展及医疗技术的改善, 虽然胃癌患者5年生存率提高至90%[3-4], 但淋巴结转移限制了其治疗效果, 我国每年仍有约35万例因胃癌死亡的患者[5]。因此, 胃癌的早期预防、诊断、抗肿瘤综合治疗备受关注。
微小RNA(microRNA)是一类高度保守的非编码RNA, 广泛存在于哺乳动物、植物和线虫等生物体内, 能与靶mRNA特异性结合而调控基因转录后表达, 是近年来肿瘤领域研究的热点[6]。已有多项研究表明microRNA在肿瘤组织中表达异常, 可发挥抑制或促进肿瘤发展的作用[7-8]。其中, 微小RNA-107(microRNA-107, miR-107)已被证实可抑制癌细胞迁移和侵袭, 并且其在胃癌组织中表达显著上调[9-10]。本研究通过检测抑制miR-107表达后胃癌细胞迁移和侵袭情况, 探讨miR-107对胃癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制,为胃癌的治疗提供新的靶标。
1 材料与方法 1.1 材料人胃癌细胞MKN45(批号:JN-B1855)、人胃黏膜上皮细胞GES-1(批号:JN-B1627)购自上海纪宁实业有限公司; 胎牛血清(批号:SH41288)、DMEM培养基(批号:11320033)购自美国Gibco-BRL公司; Lipofect-amineTM 2000转染试剂(批号:11668027)购自美国Invitrogen公司; TaKaRa反转录试剂盒(批号:RR047A)、TaKaRa实时荧光定量试剂盒(批号:RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司; BCA试剂盒(批号:PC0020)、PVDF膜(批号:BSP0161)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:D0010)、ECL发光液(批号:PE0030)、结晶紫(批号:C8470)、4%多聚甲醛(批号:P1110)购自北京Solarbio公司; pcDNA 3.1载体(批号:60548)购自爱迪基因; 兔抗人Notch2多克隆抗体(批号:NBP1-19125)、兔抗人基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase, MMP-9)多克隆抗体(批号: PAB0982)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(批号: LS-C108027)购自上海煊翎生物科技有限公司; Transwell小室(批号:BD-353502)购自北京明阳科华生物技术有限公司; 细胞培养箱、酶标仪购自美国Thermo公司。
1.2 细胞培养及分组取MKN45人胃癌细胞和GES-1人胃黏膜上皮细胞, 使用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养, 2~3 d换液1次。待细胞生长至对数期进行收集, 标记为MKN45组和GES-1组, 用于Real-time PCR实验。收集对数生长期的MKN45细胞, 胰酶消化并重悬, 调整细胞悬液浓度为1×106/mL并接种至6孔板, 在细胞融合度约50%时按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行转染, 继续培养24 h。将转染后的MKN45细胞分为NC组(转染non-specific control序列), miR-NC组(转染NC inhibitors), miR-107 inhibitors组(转染miR-107 inhibitors), pcDNA 3.1组(转染pcDNA 3.1空载体), pcDNA 3.1-Notch2组(转染Notch2过表达载体), miR-107 inhibitors+ scrambled组(转染miR-107 inhibitors和scrambled shRNA载体), miR-107 inhibitors+shNotch2组(转染miR-107 inhibitors和shRNA-Notch2载体)。所用non-specific control、NC inhibitors、miR-107 inhibitors、scrambled、shRNA-Notch2均由上海吉玛生物科技公司设计合成。
1.3 qRT- PCR检测收集MKN45组、GES-1组、NC组、miR-NC组、miR-107 inhibitors组、pcDNA 3.1组、pcDNA 3.1-Notch2组、miR-107 inhibitors+scrambled组和miR-107 inhibitors+shNotch2组细胞, 采用TRIzol法提取总RNA。分光光度计测定RNA样品浓度及纯度后按照TaKaRa反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA, 避光配制反应体系, 每个样品重复3次。以GAPDH为内参, 所得实验数据采用2-△△Ct法计算相对表达量。所用引物及序列如下:miR-107引物,上游5′-CATACTAGTG-TCTTCTGGACAGGCTCTG-3′, 下游5′-CTTAAGCTTA-GAATCTCTCACATACACAC-3′,66 bp;Notch2引物,上游5′-AGCTGCTACTCACAGGTGAACGAA-3′, 下游5′-CCAGCCTGCATCACAGAGACA-3′,7 416 bp;MMP-9引物,上游5′-GGACGACGTGGGCTACGT-3′, 下游5′-CA-CGGTTGAAGCAAAGAAGGA-3′,1 813 bp; GAPDH引物,上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′, 下游5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′,332 bp。
1.4 Western blot检测收集MKN45组、GES-1组、NC组、miR-NC组、miR-107 inhibitors组、pcDNA 3.1组、pcDNA 3.1-Notch2组细胞, 加入细胞裂解液,置于冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000×g离心15 min, 取上清, BCA试剂盒测定蛋白样品浓度。取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后,电转至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉TBST液室温封闭1 h; 分别加入兔抗人Notch2多克隆抗体(1 :2 000)、兔抗人MMP-9多克隆抗体(1 :500)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(1 :1 000), 4 ℃孵育过夜, TBS洗膜3次, 加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1 :5 000),室温孵育1 h, TBS洗膜, ECL曝光显影, 实验重复3次。
1.5 Transwell实验取转染后的NC组、miR-NC组、miR-107 inhibitors组、pcDNA 3.1组、pcDNA 3.1-Notch2组、miR-107 inhibitors+scrambled组和miR-107 inhibitors+shNotch2组细胞, 胰酶消化后重悬。取200 μL细胞悬液接种于包被或未包被基质胶的Transwell小室, 放于含完全培养基的下室上, 37 ℃、5% CO2条件下培养24 h, 吸除多余培养基, 棉签擦去上层细胞。加入4%多聚甲醛固定30 min, 0.1%结晶紫染色10 min, 荧光显微镜下记录穿膜细胞数。
1.6 双荧光素酶报告基因实验收集MKN45细胞, 胰酶消化离心, 重悬后调整细胞悬液浓度为1×106/mL并接种至6孔板, 在细胞融合度约50%时使用LipofectamineTM 2000转染试剂将miR-NC、miR-107 mimics分别与pGL3空白质粒、Notch2 3’-UTR突变型质粒、Notch2 3’-UTR野生型质粒共转染至MKN45细胞, 常规培养48 h。加入细胞裂解液裂解细胞, 4 ℃、12 000×g离心10 min, 取上清进行荧光素酶活性检测。
1.7 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件, 使用GraphPad Prism 6.0作图, 数据均以x ±s表示。两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-107和Notch2在MKN45和GES-1细胞中的表达Real-time PCR检测结果表明:与GES-1细胞比较, MKN45细胞中miR-107表达上调(0.190±0.028 vs 0.067±0.019, P < 0.01), Notch2表达下调(1.06±0.40 vs 2.79±0.43,P < 0.01);进一步使用Western blot检测Notch2蛋白表达, 发现Notch2蛋白在MKN45细胞中表达量明显降低(P < 0.01,图 1)。
2.2 抑制miR-107表达对MKN45细胞迁移和侵袭的影响
转染miR-107 inhibitors至MKN45细胞后, miR-107相对表达量明显低于NC组和miR-NC组(P < 0.01,图 2A); 与NC组和miR-NC组比较, miR-107 inhibitors组中MKN45细胞迁移和侵袭数明显减少(P < 0.01,图 2B、C);结晶紫染色结果见图 3。
2.3 过表达Notch2抑制MKN45细胞迁移和侵袭
Western blot检测结果显示:pcDNA 3.1-Notch2组Notch2蛋白表达高于NC组和pcDNA 3.1组(P < 0.01,图 4A、B); Transwell检测细胞迁移和侵袭, 发现与NC组和pcDNA 3.1组比较,pcDNA 3.1-Notch2组细胞迁移和侵袭数明显减少(P < 0.01,图 4C、D)。
2.4 过表达Notch2抑制MKN45细胞中MMP-9的表达
Real-time PCR和Western blot检测结果显示:过表达Notch2后,与NC组和pcDNA 3.1组相比较,pcDNA 3.1-Notch2组MMP-9的mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.01,图 5)。
2.5 Notch2是miR-107潜在的靶基因
Targetscan在线预测发现:Notch2 3’-UTR上存在miR-107的结合位点(图 6A), 猜测Notch2是miR-107的潜在靶基因。为验证这一观点, 将miR-NC、miR-107 mimics分别与pGL3空白质粒、Notch2 3’-UTR突变型质粒、Notch2 3’-UTR野生型质粒共转染至MKN45细胞, 采用双荧光素酶报告基因实验进行检测, 结果(图 6B)显示:NC组细胞荧光素酶活性无明显变化, 而转染miR-107 mimics的Notch2-WT组细胞荧光素酶活性明显下降(P < 0.01),Notch2-MUT组细胞荧光素酶活性与对照无明显差异。
2.6 沉默Notch2逆转miR-107对MKN45细胞迁移和侵袭的抑制作用
Real-time PCR和Transwell检测结果(图 7)显示, 在MKN45细胞中转染miR-107 inhibitors,Notch2表达上调(P < 0.01),细胞迁移和侵袭数减少(P < 0.01);抑制miR-107表达的同时沉默Notch2,则Notch2表达下调, 视野内迁移和侵袭细胞数明显增多(P < 0.01)。
3 讨论
胃癌的发生与饮食习惯、吸烟、饮酒和遗传等多种因素有关, 其发病机制尚未完全明确[11]。MicroRNA能调控多种下游基因表达, 参与生物体几乎所有的生命活动, 与肿瘤的发生、发展密切相关。文献[12-13]报道miR-148a、miR-130a能够调节肝癌、乳腺癌多种肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物过程, 在肿瘤发生的分子机制中起关键作用, 是癌症治疗的新靶点。
MiR-107首次发现于人宫颈癌细胞, 能够靶向多种下游基因表达, 参与调节细胞应激、脂质代谢、血管生成、血管内皮因子分泌和损伤修复, 可抑制或诱导2型糖尿病、阿尔茨海默病和肿瘤等疾病的发生[14]。在肿瘤的相关研究中, STVCKRATH等[15]研究发现:miR-107在乳腺癌患者血浆中表达异常, 调节miR-107表达能抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭;LIU等[16]研究表明:下调miR-107表达能通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡减缓结直肠癌的发展,提示miR-107可能是癌症治疗的新靶点。为研究miR-107对胃癌发展是否具有抑制作用,FENG等[17]进行了胃癌细胞的体外实验, 发现miR-107能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶表达, 诱导细胞周期停滞, 抑制癌细胞增殖。本研究发现miR-107在人胃癌细胞MKN45中相对表达水平高于人胃黏膜上皮细胞GES-1(P < 0.01);在MKN45细胞中转染miR-107 inhibitors, 视野内细胞迁移和侵袭数减少(P < 0.01);采用Targetscan在线预测发现:Notch2 3’-UTR上存在miR-107的结合位点;双荧光素酶报告基因实验结果表明:Notch2是miR-107的潜在靶基因, 抑制miR-107可促进Notch2表达。
上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)指上皮细胞失去原有极性, 获得抗凋亡、高迁移和侵袭的能力, 转化为间质细胞的过程[18]。肿瘤细胞具有向周围组织浸润的能力, 通过淋巴管、血管转移并成长为实体瘤, 而EMT的发生使MMP-9表达上调, 细胞间连接减弱, 增强细胞迁移能力, 促进肿瘤发展[19-20]。Notch信号通路是诱导EMT的重要调节者, 广泛参与细胞分化、增殖及凋亡过程[21]。Notch信号通路包含Notch1、Notch2、Notch3和Notch4 4种受体, 多种肿瘤细胞EMT的发生常伴有Notch通路的激活, 激活Notch1可增强细胞迁移能力, 促进EMT发生[22-23]。此外, 多项研究表明激活Notch2可诱导肿瘤细胞EMT, 促进肿瘤转移[24-25]。本研究采用Real-time PCR检测发现:Notch2在MKN45人胃癌细胞中相对表达水平低于GES-1人胃黏膜上皮细胞(P < 0.01), 过表达Notch2, 则MKN45细胞迁移和侵袭能力下降(P < 0.01), MMP-9表达下调(P < 0.01)。在MKN45细胞中沉默Notch2表达, 可逆转miR-107对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。
综上所述, 在胃癌细胞中, miR-107高表达,而Notch2低表达;抑制miR-107可促进Notch2表达, 从而上调MMP-9水平, 抑制胃癌细胞迁移和侵袭。这一研究结果有望为胃癌临床治疗提供新靶点。
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