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GCNT3在结直肠癌中的表达及临床意义
刘陕西, 叶钧, 尚杨杨, 陈颢元, 汪荣泉     
重庆,陆军军医大学西南医院全军消化病研究所
[摘要] 目的 探讨GCNT3在结直肠癌中表达的水平变化及其对结直肠癌患者预后的影响。方法 国际癌症和肿瘤基因数据库(TCGA)中下载结直肠癌患者GCNT3基因(编码C2GnT-2)的mRNA表达数据及临床信息,整理分析其表达水平变化对结直肠癌临床相关性及预后的影响,并通过细胞增殖实验观察干扰C2GnT-2合成后结直肠癌细胞增殖能力的变化情况。结果 GCNT3在癌组织中较癌旁组织低表达(P < 0.001);GCNT3低表达组病人无病生存率显著低于高表达组(P < 0.05);干扰C2GnT-2合成后结直肠癌细胞增殖能力显著增强(P < 0.01)。结论 GCNT3在结直肠癌中低表达,其低表达可能提示直肠癌患者无病生存率低。
[关键词] 结直肠癌     癌症和肿瘤基因数据库     GCNT3     无病生存率    
Clinical Significance of GCNT3 in colorectal cancer
LIU Shanxi, YE Jun, SHANG Yangyang, CHEN Haoyuan, WANG Rongquan     
Institute of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
[Abstract] Objective To investigate the expression level of GCNT3, a glycosyltransferase enzyme, in colorectal cancer (CRC) and its association with the prognosis of the patients. Methods The mRNA expression data of GCNT3 gene (encoding mucin-type core 2 synthase enzyme, C2GnT-2) and clinical information of the patients were obtained from the Cancer Genome Atlas database (TCGA). The correlation of GCNT3 mRNA expression level with the clinical characteristics of the patients was analyzed. Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis were used for assessing the prognostic value of GCNT3. We also tested the effect of a short hairpin RNA (shRNA) targeting GCNT3 on the proliferation of the colorectal cancer cell line HT-29 using MTT assay. Results GCNT3 mRNA expression level was significantly decreased in CRC tissues as compared with the paired adjacent colorectal tissues (P < 0.001). A low expression level of GCNT3 was significantly correlated with a reduced disease-free survival (DFS) rate in the patients with CRC (P < 0.05). In HT-29 cells, interference of C2GnT-2 with the specific shRNA significantly promoted the cell proliferation as compared with the control cells (P < 0.01). Conclusion The expression of GCNT3 is significantly downregulated in CRC tissues, and a low expression of GCNT3 can be indicative of a low disease-free survival rate of patients with CRC.
[Key words] colorectal cancer     Cancer Genome Atlas database     GCNT3 gene     disease-free survival    

结直肠癌的发病率在常见恶性肿瘤中仍高居第3位,其复发转移是导致患者死亡的主要原因[1]。肿瘤发生发展中,糖基化改变被认为是一种普遍的癌症标志[2]。黏蛋白在合成过程中,O-型糖链根据连接在丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸分子上糖链的不同主要区分为Core1-4,O-型糖链由不同的糖基转移酶催化合成[3], Core2 O-型糖链主要由GCNT3基因编码的C2GnT-2合酶催化合成[4],C2GnT-2合酶在正常结直肠组织中高表达[5]。据报道,其在肿瘤组织中表达水平发生改变并具有肿瘤抑制特性[4],结合课题组在研究宿主细胞糖基化影响大肠杆菌侵袭能力中构建的平台,本研究旨在探索GCNT3基因表达水平作为结肠癌预后标志物的可能性及潜在机制。

1 资料与方法 1.1 数据下载

TCGA官网数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)[6]下载结直肠癌患者基因mRNA表达量及相关临床信息,需借助批量下载工具(https://gdc.nci.nih.gov/access-data/gdc-data-transfer-tool)[7]运行系统下载。经整合、标准化、剔除极值等处理后,共筛选442例病人样本,其中49例具有配对的癌旁基因表达量。

1.2 材料

人结肠腺癌细胞株HT-29购自上海中科院细胞库,shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞模型[8]来自课题组构建;McCoy’s5A培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、四氮唑蓝(MTT)粉末购自Sigma公司;胰蛋白酶、无菌PBS购自吉诺公司;96孔板购自耐思公司;荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.3 数据分组

利用X-tile软件(Yale University, New Haven, CT, USA)中的Kaplan-Meier方法做无病生存分析取最佳cut-off值[9],将样本分为高表达组(125例)和低表达组(317例)。

1.4 细胞增殖实验

培养HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29三组细胞在含5% CO2的37 ℃的细胞孵箱中,当细胞生长融合至85%左右时,胰蛋白酶消化离心,分别取1×103个细胞接种到96孔板中,每孔加入100 μL含10%FBS的McCoy’s 5A培养基,并各设3个以上复孔;分别在培养24、48、72、96 h时,吸取上清后加入20 μL按4 :1配比的MTT(5 mg/mL), 即PBS:MTT=4 :1;而后96孔板置于细胞孵箱中,继续培养4 h;吸取上清后每孔加入二甲基亚砜150 μL,再将96孔板置于摇床低速震荡10 min,使其充分溶解;将96孔板放于PCR酶标仪上检测,测定在490 nm处各孔的OD值,重复3次。

1.5 统计学方法

利用软件SPSS 16.0进行数据处理。配对样本采用配对t检验;组间比较时用卡方检验及Fisher确切概率法;生存分析时用Kaplan-Meier方法;Cox回归分析用于危险因素评估。

2 结果 2.1 GCNT3在结直肠癌组织中表达显著降低

49例配对样本分析结果显示,GCNT3在结直肠癌组织中表达水平显著低于其癌旁组织(P < 0.001,图 1)。

a:P < 0.001,与癌旁组织比较 图 1 TCGA数据库中GCNT3在结直肠癌组织及癌旁组织中表达水平比较

2.2 GCNT3表达水平与其临床特征相关性分析

数据分析结果显示,结直肠癌患者GCNT3基因表达水平与患者性别(P=0.415)、年龄(P=0.111)、肿瘤位置(P=0.674)、T分期(P=0.205)、N分期(P=0.394)、M分期(P=0.790)、Stage分期(P=0.395)均无显著相关性(表 1)。

表 1 GCNT3表达与结直肠癌临床特征的相关性分析
临床特征 例数
(%)
GCNT3低表达
(n=317)
GCNT3高表达
(n=125)
P
总例数 442 317 125
 性别 0.415
  男性 241(54.52) 169(53.31) 72(57.60)
  女性 201(45.48) 148(46.69) 53(42.40)
 年龄 0.111
 <70岁 270(61.09) 201(63.41) 69(55.20)
 ≥70岁 172(38.91) 116(36.59) 56(44.80)
部位 0.674
 结肠 319(72.17) 227(71.61) 92(73.60)
 直肠 123(27.83) 90(28.39) 33(26.40)
T分期 0.205
 T1+T2 99(22.40) 66(20.82) 33(26.40)
 T3+T4 343(77.60) 251(79.18) 92(73.60)
N分期 0.394
  N0 272(61.54) 199(62.78) 73(58.40)
N1+ N2 170(38.46) 118(37.22) 52(41.60)
M分期 0.790
  M0 386(87.33) 276(87.07) 110(88.00)
  M1 56(12.67) 41(12.93) 15(12.00)
TNM分期 0.395
  Ⅰ+Ⅱ 265(59.95) 194(61.20) 71(56.80)
  Ⅲ+Ⅳ 177(40.05) 123(38.80) 54(43.20)

2.3 单因素和多因素Cox回归分析

无病生存率单因素分析结果显示,GCNT3表达水平与结直肠癌患者无病生存率显著相关(P < 0.05),高表达组无病生存率显著高于低表达组(图 2);进一步对可能影响结直肠癌无病生存率的临床特征进行单因素分析,结果显示,N分期、M分期、Stage分期等均为无病生存率的危险因素(P < 0.05),而GCNT3高表达为结直肠癌的保护因素(图 3);将有统计学意义的单因素(P < 0.05)纳入Cox回归模型进行多因素分析,结果显示,M分期是结直肠癌患者的独立危险因素(P < 0.05),GCNT3表达水平为结直肠癌患者的独立保护因素(P < 0.05)(图 4)。

图 2 GCNT3的表达水平与结直肠癌无病生存率的关系

图 3 结直肠癌无病生存率预后因素的单因素Cox回归分析

图 4 结直肠癌无病生存率预后因素的多因素Cox回归分析

2.4 细胞系MTT增殖实验

细胞开始培养后48 h,干扰模型shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞增殖速率逐渐高于对照的HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞;细胞培养至72 h和96 h,shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞增殖速率显著高于对照的HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞,差异具有统计学意义(P < 0.01),见图 5

a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与HT-29组及shRNA-Ctr/Ht-29组比较 图 5 干扰C2GnT-2合成后结直肠癌细胞增殖能力的变化

3 讨论

结肠癌是高死亡率的恶性肿瘤之一,严重影响着患者的生存及预后,临床上仍以手术治疗和辅助化疗,其预后不良的主要原因仍然是转移和复发,复发后治疗有效率低、缺乏有效的预后生物学标志物仍是研究需要解决的热点[10]。GCNT3基因表达水平不仅与结直肠癌患者的预后关系密切[4], 而且与胃癌、肝癌、胰腺癌等的发生发展密切相关[11-12]。其编码合成的Core2在黏膜屏障中也发挥重要作用,缺乏GCNT3小鼠更容易发生自发性结肠炎和溃疡,可能原因为肠隐窝干细胞受损[13]。这些研究都表明,C2GnT-2通过影响正常O-糖链结构的形成,最终导致炎症和肿瘤的发生发展。

尽管有文献报道GCNT3在结直肠癌组织中表达下调[4],但是其临床意义仍不清楚。本研究回顾分析了癌症和肿瘤基因数据库中442例结直肠癌样本和49例癌旁正常组织样本,结果显示癌组织中GCNT3表达水平较癌旁组织显著降低,其表达水平变化的原因仍不清楚,可能与糖蛋白的折叠和翻译后修饰有关。进一步探讨该糖基转移酶基因与结直肠癌患者各临床特征间是否存在相关性,统计学分析发现其表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期及Stage分期均无显著相关性,提示其可能在结直肠肿瘤的发生发展中具有独特的作用机制,可能需要特定的模型分析其对临床特征的影响。生存分析结果表明,结直肠癌患者中GCNT3高表达组无病生存率显著高于低表达组,即低表达组患者复发率更高;单因素和多因素Cox回归分析结果显示,GCNT3是结直肠癌患者无病生存率的独立保护因子,远处转移是独立危险因子,对结直肠癌患者无病生存状态具有提示意义。

在细胞增殖实验中,发现干扰C2GnT-2合成后,HT-29细胞的增殖能力显著增强,即GCNT3编码合成的C2GnT-2在结直肠癌中具有肿瘤抑制特性,该结果与HuangMC等人的研究结果部分相似,但我们的研究第一次从反向研究并结合病例回顾性分析证实;正常结肠组织中含有大量高活性C2GnT-2,发挥黏膜屏障、细胞黏附、免疫应答及细胞信号传导等功能,多数结肠癌组织中C2GnT-2活性显著降低,而结肠癌细胞系HT-29中C2GnT-2相对较高表达[8].课题组第一次成功构建了HT-29细胞的干扰模型,从生物学行为角度进行观察发现,MTT实验表明干扰C2GnT-2合成的细胞增殖能力更强;糖基转移酶数量和活性异常导致正常的糖链结构合成受阻,Core2、Core4及Ⅰ分支结构合成减少,而Core1结构大量堆积[14],Core1结构过表达被证实可促进结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和成瘤,这与Vavasseur F报道结直肠癌中Core4、Ⅰ分支结构表达下调一致;抑制肿瘤作用减弱后亦可引起异常肿瘤血管内皮生成因子A大量合成[15],这在卵巢癌的发生发展研究中也有报道[16]。最近研究表明,GCNT3在不同肿瘤中发挥截然相反的作用,例如,在非小细胞肺癌中显示其为致癌基因[17],这可能与不同的胚胎学背景、分子模式、肿瘤微环境等相关,某些组织需要更多的Core4结构来维持正常细胞代谢,而某些组织则需要更多的Core2结构维持正常代谢活动。总之,GCNT3基因影响结直肠癌预后的分子机制仍不清楚,上皮间质转化是肿瘤发生发展中常见的分子机制[18],下步将继续分析干扰细胞模型中上皮及间质标志物的变化情况。

本研究的不足之处在于,TCGA数据库收集整理的是mRNA水平的数据,缺乏GCNT3基因在蛋白水平的表达情况。同时,需要其他肿瘤细胞系干扰模型进一步验证,如LS174结直肠癌细胞系,并结合免疫组化方法深入分析讨论。本研究为GCNT3基因在肿瘤发生发展研究中的基础和临床研究提供了依据,提供了肿瘤治疗可能作用的靶点。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201812043
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

刘陕西, 叶钧, 尚杨杨, 陈颢元, 汪荣泉.
LIU Shanxi, YE Jun, SHANG Yangyang, CHEN Haoyuan, WANG Rongquan.
GCNT3在结直肠癌中的表达及临床意义
Clinical Significance of GCNT3 in colorectal cancer
第三军医大学学报, 2019, 41(10): 913-917
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(10): 913-917
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201812043

文章历史

收稿: 2018-12-05
修回: 2019-01-28

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