肾癌被认为少数几种具有免疫原性的肿瘤，传统的放化疗远期疗效有限[1-2]。目前研究认为，肿瘤免疫逃逸可能是其疗效欠佳的主要原因，而MDSCs的激活和扩增是导致肿瘤免疫逃逸的主要原因[3]。研究发现，当肿瘤发生时，肿瘤分泌的外泌体(exosomes)诱导MDSCs在肿瘤组织和淋巴组织呈高浓度聚集，导致下游的T淋巴细胞功能缺陷、失能或凋亡，从而介导了肿瘤的免疫逃逸[4-5]，而肾癌中的exosomes通过活化的MDSCs来抑制T淋巴细胞的功能却不清楚。因此，本研究拟从小鼠Renca肾癌细胞中分离出exosomes，验证其对MDSCs的活化效应。然后体外用肾癌特异性抗原冲击DCs，冲击后的DCs诱导CTLs的产生，然后验证exosomes活化的MDSCs对CTLs增殖和杀伤效应的抑制作用。从而为exosomes的肾癌临床免疫治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、动物、主要试剂与仪器小鼠肾癌Renca细胞株来自中国医学科学院上海细胞库，6~8周龄雄性BALB/c小鼠由重庆医科大学动物实验中心提供。胎牛血清、RPMI1640购自美国Gibco公司。抗小鼠Gr-1-FITC、CD11b-PE、CD11c-Alexa Fluor 647、CD80-APC、CD86-PE/Cy7、主要组织相容性复合体-Ⅱ (major histocompatibility complex-Ⅱ, MHC-Ⅱ)- FITC、CD8-PE单克隆流式抗体购自美国BioLegend公司。MDSCs磁珠分选试剂盒、CD8+T细胞磁珠分选试剂盒和T细胞扩增试剂盒购自德国Miltenyi公司。CFSE购自上海麦克林公司，酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国R & D公司。白介素-2(lnterleukin-2，IL-2)、白介素-4(lnterleukin-2，IL-4)、白介素-6(lnterleukin-2，IL-6)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)购自美国Peprotech EC公司，糖多脂(lipopolysaccharides, LPS)购自美国Sigma公司，LDH试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。超速离心机、透射电子显微镜、Beckman Coulter流式细胞仪、尼康荧光显微镜为实验所需主要仪器。
1.2 细胞培养和Exosomes的提取Renca细胞体外常规培养，接种于含10%胎牛血清RPMI1640培养基中，加入50 mg/L链霉素、50×103 U/L青霉素，于5%CO2、37℃条件下常规传代培养。待细胞生长到90%以上，用无血清的RPMI1640饥饿处理并收集培养48 h后的上清液。采用传统超速离心法分离exosomes[6]，具体步骤如下：300×g离心20 min+ 2 000×g离心30 min去除细胞和细胞碎片，10 000×g离心30 min去除亚细胞成分，100 000×g离心70 min，所得沉淀即为exosomes；再用PBS重悬exosomes，混匀后再以100 000×g离心70 min以纯化exosomes。0.5 mL PBS重悬exosomes，0.22 μm滤膜过滤，并置于-80 ℃冰箱内保存备用，避免反复冻融。
1.3 流式细胞术检测体内MDSCs比例将exosomes和PBS分别以每周3次，每次10 μg或200 μL通过尾静脉注射到BALB/c小鼠体内，Renca细胞以每只小鼠5×106个细胞数混匀200 μL PBS皮下注射到小鼠体内。2周后，脱颈处死小鼠，分离脾脏，200目滤网中碾磨成单细胞悬液，裂红，离心沉淀细胞并制成单个脾细胞悬液。分离出大腿两侧的股骨，用1 mL针头反复冲洗骨髓腔直至骨头发白，收集骨髓细胞，裂红，离心沉淀细胞并制成单个骨髓细胞悬液，将单个脾细胞悬液和单个骨髓细胞悬液用Gr-1-FITC、CD11b-PE流式抗体4 ℃条件下避光孵育20 min，最后上机检测。
1.4 磁珠分选MDSCs将exosomes和PBS分别以每周3次，每次10 μg或200 μL通过尾静脉注射到BALB/c小鼠体内。14 d后，分离脾脏制备单个脾细胞悬液，用buffer重悬细胞并调整细胞数为108/350 μL，加入50 μL FcR Blocking Reagent，混匀2~8 ℃孵育10 min，加入100 μL Anti-Ly-6G-Biotin混匀2~8 ℃孵育10 min，buffer洗细胞并调整细胞数108/800 μL，加入200 μL Anti-Biotin MicroBeads混匀2~8 ℃孵育15 min，洗细胞并用500 μL buffer重悬细胞。组装好磁柱、磁架和分选器，500 μL buffer清洗磁柱，将细胞悬液缓慢通过磁柱，收集流出未被标记的细胞，从磁架中移除磁柱悬于EP管上方使其脱离磁场区域，加入1 mL buffer于磁柱内并快速下压活塞使标记的Gr-1highLy-6G+细胞迅速流出，收集流出的Gr-1highLy-6G+细胞。
将上一步流出的未被标记的细胞以108/400 μL buffer重悬，加入100 μL Anti-Gr-1-Biotin混匀2~8 ℃孵育10 min，buffer洗细胞并调整细胞数108/900 μL，加入100 μL Streptavidin MicroBeads混匀2~8 ℃孵育15 min，洗细胞并用500 μL buffer重悬细胞。用上述相同的方法收集Gr-1dimLy-6G-细胞。将两部分细胞一并收集，流式检测其Gr-1-FITC、CD11b-PE双阳性细胞比例。并加入10 ng/mL GM-CSF和2 ng/mL IL-6于5%CO2、37 ℃条件下常规培养。
1.5 肿瘤负载抗原DCs的分离与培养BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，分离出大腿两侧的股骨，用1 mL针头反复冲洗骨髓腔直至骨头发白，收集骨髓细胞，裂红，离心沉淀细胞并用含有10 ng/mL GM-CSF、2 ng/mL IL-4的完全培养基重悬制成骨髓单细胞悬液, 37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 d。小心洗去悬浮细胞，往贴壁细胞中加入上述完全培养基继续培养，每2天半量换液并补充等量的GM-CSF和IL-4。待培养到第6天加入LPS继续培养。
常规培养并收集正常生长的Renca细胞，PBS洗涤3次，用RPMI1640重悬并调整细胞数为107/mL，将细胞置于液氮中10 min，再迅速置于37℃恒温水浴锅中，待完全溶解后，再置于液氮中，如此循环往复3次。细胞裂解物于800×g离心10 min，收集上清液按每毫升加入相当于2×106肿瘤细胞的裂解物和DCs共培养至第8天，收集悬浮细胞即为负载肿瘤抗原的DCs。相差显微镜观察抗原刺激活化后的DCs形态，流式细胞学检测肿瘤抗原刺激前后DCs的CD11c、CD80、CD86以及MHC-Ⅱ的表达率。
1.6 磁珠分选CD8+T细胞与肾癌抗原特异性CTLs的制备用相同的方法制备上述所示的单个脾细胞悬液，buffer以90 μL/107重悬细胞，再以10 μL/107细胞数加入CD8 MicroBeads混匀后2~8 ℃孵育15 min洗细胞并用50 mL buffer重悬细胞。组装好磁柱、磁架和分选器，500 μL buffer清洗磁柱，将细胞悬液缓慢通过磁柱，丢弃流出未被标记的细胞，从磁架中移除磁柱悬于EP管上方，加入1 mL buffer于磁柱内并快速下压活塞使标记的CD8+T细胞迅速流出，收集流出的CD8+T细胞。加入与CD8+T细胞等量的包被CD3/CD28抗体的磁珠和20 ng/mL IL-2继续常规培养。
在CD8+T细胞培养后第2天，将CD8+T细胞与负载肾癌抗原的DCs以1 :10的比例共培养，同时补充20 ng/mL IL-2，对照组为未用DCs刺激的CD8+T细胞，培养第4天，倒置显微镜下观察CD8+T细胞的形态。
1.7 干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的检测收集上述未用DCs刺激的CD8+T细胞和DCs刺激的CD8+T细胞的上清液，按照ELISA试剂盒说明书流程检测两组CD8+T细胞上清液IFN-γ的分泌量。
1.8 Exosomes活化的MDSCs对CTLs增殖的抑制实验收集DCs刺激后的CD8+T细胞(CTLs)，用1 mL预热的PBS重悬107个CTLs，CFSE加入到细胞悬液中使其工作浓度为2.5 μmol/L，混匀室温黑暗条件下孵育10 min，加入5倍体积的完全培养基室温孵育5 min以去除CFSE，完全培养基洗3次并调整细胞数为106/mL，然后标记的CTLs细胞分成3组，分别与exosomes活化的MDSCs和PBS处理的MDSCs以5 :1的比例共培养，未加MDSCs的CTLs作为对照。3 d后，荧光显微镜观察CTLs的荧光密度并收集细胞上机进行流式检测。
1.9 Exosomes活化的MDSCs对CTLs体外杀伤Renca细胞的抑制作用将CTLs设为效应(effect，E)细胞，Renca细胞设为靶(target，T)细胞，然后将exosomes活化的MDSCs+CTLs，PBS处理的MDSCs+CTLs和单独的CTLs按照LDH试剂盒说明书操作流程将效应细胞与Renca细胞共培养并测定不同效靶比(E/T ratio)条件下CTLs的杀伤率，并以公式计算杀伤率[杀伤率=(反应孔A值-自然释放孔A值)/(最大释放孔A值-自然释放孔A值)×100%]。
1.10 统计学分析用GraphPad Prism 7.0进行数据分析，每次至少重复3个样本，数据以x±s表示。2组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Renca细胞来源的exosomes的电镜形态透射电镜对exosomes进行形态学鉴定，200 nm视野下见exosomes大小不一，呈盘状脂质膜包绕而成的类圆碟形，直径在30~100 nm之间(图 1)。
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| 图 1 透射电镜观察Renca细胞来源的exosomes的电镜形态 |
2.2 Exosomes促进了体内骨髓和脾脏中MDSCs的聚集
流式细胞仪检测exosomes和PBS处理14 d及成瘤14 d后小鼠骨髓和脾脏中MDSCs细胞比例的变化，见图 2。Renca tumor成瘤组相对于exosomes处理组，exosomes处理组相对于PBS对照组，14 d后Gr-1+和CD11b+双阳性细胞比例均有明显增加(P < 0.05)。
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| A：骨髓细胞中MDSCs比例分析；B：脾脏细胞中MDSCs比例分析a: P < 0.05，与PBS组比较；b：P < 0.05，与Exosomes组比较 图 2 流式细胞仪检测体内PBS处理、Exosomes处理和Renca细胞成瘤14 d后MDSCs的比例变化 |
2.3 MDSCs的分离与鉴定
体外经磁珠分选出exosomes活化的MDSCs以及PBS处理的MDSCs，流式细胞仪检测Gr-1+和CD11b+双阳性细胞比例(均>95%)，倒置显微镜观察MDSCs形态，发现20 μm视野下PBS处理的和exosomes活化的MDSCs分布均匀，大多呈圆球形，为单个核细胞，细胞核较大，见图 3。
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| A：倒置显微镜下观察PBS处理的MDSCs形态；B：倒置显微镜下观察exosomes活化的MDSCs形态；C：流式细胞仪检测磁珠分选过后的MDSCs比例 图 3 MDSCs的分选和鉴定 |
2.4 Renca细胞肿瘤抗原促进了DCs的成熟
在倒置显微镜下观察，培养第7天的DCs多为贴壁细胞，表面伸出毛刺样突起，形态大小不规则，有梭形、星形或多边形，呈集落样生长。流式细胞仪检测结果显示CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达率分别为95.71%、97.06%、77.76%和55.77%，而培养第8天肿瘤抗原刺激后的DCs，半贴壁细胞增多，体积变大，具有典型的树突状细胞结构，DCs表面标志物CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达率分别为97.01%、97.27%、84.17%和71.02%，CD86、MHC-Ⅱ表达率相对于肿瘤抗原刺激之前有明显增加，见图 4。提示此时的DCs具备高效的抗原提呈能力。
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| A：倒置显微镜下观察培养7 d后DCs的形态；B:倒置显微镜下观察肿瘤抗原后激后DCs的形态；C:流式细胞仪检测肿瘤抗原刺激前DCs表面标志；D:流式细胞仪检测肿瘤抗原刺激后DCs表面标志 图 4 倒置显微镜和流式细胞学分析DCs的形态和表面标志 |
2.5 DCs诱导了CTLs的形成
在倒置显微镜下观察DCs刺激的CTLs，提取的CD8+T细胞围绕着包被CD3/CD28的磁珠聚集生长，细胞形态规则，呈单一圆形。DCs刺激后的CD8+T细胞形态不规则，部分细胞变大，此时通过ELISA检测发现DCs刺激2 d后的CD8+T细胞其IFN-γ的分泌量明显高于未用DCs刺激的CD8+T细胞(P < 0.05，图 5)。提示此时CD8+T细胞已活化成为肿瘤抗原特异性的CTLs。
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| A：未用DCs刺激的CD8+T细胞形态；B：DCs刺激后的CD8+T细胞形态；C：ELISA检测未用DCs刺激的和用DCs刺激的CD8+T细胞IFN-γ的分泌量a: P < 0.05, 与CD8+T not activated by DCs组比较; 1: DCs刺激后的CD8+T细胞；2: DCs刺激后的CD8+T细胞 图 5 倒置显微镜和ELISA实验证明DCs诱导CD8+T细胞活化为CTLs |
2.6 Exosomes活化的MDSCs抑制了肿瘤抗原特异性CTLs的增殖
将exosomes活化的MDSCs (E-MDSCs)和PBS处理的MDSCs (P-MDSCs)分别与CTLs共培养，空白组为单独的CTLs，3 d后荧光显微镜下观察3组CTLs荧光密度，发现未加MDSCs的CTLs增殖最快，荧光密度最大。而与E-MDSCs共培养后的CTLs可见少量增殖，其荧光密度比与P-MDSCs共培养后的CTLs更小，见图 6。就CTLs增殖指数而言，E-MDSCs+CTLs < P-MDSCs+CTLs < CTLs (P < 0.05，图 7)。
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| 图 6 荧光显微镜观察CTLs染色CFSE后不同条件下培养3 d后的荧光密度(×100) |
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| a: P < 0.05, 与CTLs+P-MDSCs组比较；b：P < 0.05, 与CTLs组比较；1：CTLs+E-MDSCs；2：CTLs+P-MDSCs；3：CTLs 图 7 流式细胞分析CTLs染色CFSE后不同条件培养3 d后增殖指数 |
2.7 Exosomes活化的MDSCs抑制了肿瘤抗原特异性CTLs的杀伤效应
为了评估E-MDSCs在CTLs对Renca细胞杀伤作用中的抑制效应，通过LDH释放实验来检测CTLs对Renca细胞的杀伤率。在E:T=20:1或E:T=10:1条件下(MDSCs等量)，E-MDSCs作用下的CTLs对Renca细胞的杀伤率 < P-MDSCs作用下的CTLs杀伤率 <空白组CTLs杀伤率(P < 0.05，图 8)。表明E-MDSC显著抑制了CTLs对Renca细胞的杀伤效应。
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| a: P < 0.05, 与CTLs组比较；b：P < 0.05, 与P-MDSCs+CTLs组比较 图 8 LDH释放实验检测MDSCs作用下的CTLs在不同E/T比例下对Renca细胞的杀伤率 |
3 讨论
Exosomes在肿瘤免疫中发挥双向调控作用：一方面，可携带肿瘤相关抗原，如MHC-Ⅰ类分子、黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、共刺激分子86(co-stimulatory molecule 86，CD86)等免疫信息分子，将信息传递给与之相互作用的靶细胞，从而引发抗肿瘤免疫应答[7-8]；另一方面，Exosomes可负向调节多种免疫细胞，如胶质瘤exosomes可通过miR-10a/Rora and miR-21/Pten信号通路促进MDSCs的激活与扩增[9]；结肠癌细胞exosomes表面的热休克蛋白72(heat shock protein 72，HSP72)可通过TLR2/ MyD88途径引起STAT-3通路的激活和IL-6的产生, 增强了MDSCs的抑制功能，引起下游T淋巴细胞功能缺失和凋亡，从而介导肿瘤的免疫逃逸[10]。因此，本研究所提取的exosomes对MDSCs的激活效应可能是由多种原因造成的，如exosomes中的前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)[11]、HSP70[3]以及HSP72[10]都能诱导MDSCs的激活，激活后的MDSCs通过高表达精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[12]等诱导CTLs的免疫抑制。
本实验通过传统的超速离心法从Renca细胞中提取出exosomes，并通过电镜对exosomes进行形态学鉴定，发现其为呈类圆碟形、大小不一的盘状囊泡，其直径在30~100 nm之间。然后体内实验发现exosomes能促进MDSCs的聚集，与之前报道的文献[3, 10-11]一致。另外，荷瘤小鼠具有更强的促进MDSCs在骨髓和脾脏中的聚集作用，可能是因为肿瘤细胞通过释放驱动MDSCs聚集的某些可溶性因子和exosomes来调节骨髓和脾脏等远端部位，创建了一个肿瘤驱动的“宏观环境”[13]。倒置显微镜下对MDSCs进行鉴定发现其为细胞核较大的单个核类圆形细胞。然后从小鼠骨髓中提取出DCs，在小鼠DCs体外培养中，GM-CSF是维持DCs发育及分化最重要的细胞因子，而添加IL-4能抑制巨噬细胞和中性粒细胞的产生，并且使DCs具有很强的抗原递呈能力[14]。随后，将Renca细胞特异性抗原体外冲击DCs，抗原刺激后的DCs高表达CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ，提示此时的DCs具有高效的特异性Renca细胞抗原提呈能力。然后用DCs诱导CD8+T细胞活化为CTLs，将抗原特异的CTLs与exosomes活化的和PBS处理的MDSCs共培养，发现exosomes活化的MDSCs显著抑制了CTLs的增殖以及杀伤效应。本研究的LDH释放实验可能不是CTLs杀伤效应的最佳方法，因混合体系有3种细胞，难以判断LDH均来自肿瘤细胞，最好的方法是51Cr标记肿瘤细胞，然后观察同位素的释放情况。但51Cr释放实验存在放射性，为安全起见，本研究采用LDH释放实验检测exosomes激活的MDSCs对CTLs杀伤效应的抑制作用。
近年来，针对exosomes的免疫治疗引起越来越多的关注，但是由于其结构的复杂性以及对免疫的负向调节作用如促进MDSCs的体内聚集，使优化其治疗方案变得越来越重要。有研究报道低氧exosomes中的miR-10a和miR-21能够分别通过Rora/ⅠκBa/NF-κB和Pten/PI3K/AKT信号通路激活MDSCs，因此阻断其中的信号通路或者避免低氧有望达到一定的疗效[9]。另外，用维生素D来阻断exosomes中的miR-155对MDSCs的活化也能发挥抗肿瘤疗效[15]。而本研究验证了肾癌细胞来源的exosomes活化的MDSCs对肾癌特异性CTLs增殖和杀伤效应的抑制作用，为改善肾癌的免疫治疗提供了新的靶点。但是exosomes的免疫抑制作用不仅体现在激活MDSCs方面，如促进T细胞的凋亡[16]、阻碍DCs的分化和成熟[17]、抑制自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)的功能[18]。因此，下调一些exosomes中的免疫抑制因子，如PEG2、TGF-β和HSP72，往往能够阻断MDSCs的聚集从而减弱exosomes的免疫抑制效应；另外避免MHC-Ⅰ类分子、黏附分子、共刺激分子的缺失往往能够增强exosomes的抗肿瘤免疫和CTLs的应答。
志谢 感谢重庆医科大学附属第一医院泌尿外科主治医师陈刚为本研究提供技术指导，感谢重庆医科大学附属第二医院肝胆外科博士研究生王孟皓、心内科博士研究生陈芸林为本研究提供技术支持。| [1] | SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67(1): 7–30. DOI:10.3322/caac.21387 |
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