慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致原发性肝癌(hepatocellular carcinoma; HCC)的重要原因之一[1]。HBx蛋白是HBV编码的7个蛋白质之一,研究表明,HBx调节相关癌基因和抑癌基因的表达诱导肝癌的发生,但该确切机制目前尚不清楚[2-3]。目前,肝癌细胞的来源存在着较大的争议,研究发现,成熟的肝细胞不能有效分化,而肝前体细胞(hepatic progenitor cells, HPCs),也称为肝干细胞,能够分化成胆管上皮细胞或肝细胞,肝癌细胞的来源可能与HPCs有关[4-5]。肝癌的发生过程中,Akt/mTOR信号通路在细胞凋亡、增殖、转移及肿瘤血管形成方面起着至关重要的作用,HBx基因通过激活Akt/mTOR信号通路诱导了肝癌的发生[6-7]。
我们前期在体外研究结果显示,HBx使肝前体细胞的S期延长,抑制肝前体细胞的正常分化,这可能导致肝前体细胞发生恶性转化,预示着HCC的发生[8-9]。本研究构建稳定表达HBx的肝前体细胞株HBx-EGFP-14-19,通过肝门静脉注射,将HBx-EGFP-14-19细胞株输入小鼠体内,建立了在小鼠肝脏稳定表达HBx的KM小鼠模型,并检测其肝脏细胞的凋亡、周期和Akt/mTOR信号通路相关因子的表达情况;给予小鼠模型Akt磷酸化抑制剂MK2206进一步验证HBx对于肝脏细胞的影响,探讨HBx通过Akt/mTOR信号通路抑制肝脏细胞凋亡和促进细胞周期进程的作用机制。通过了解HBx对小鼠肝脏细胞的凋亡和周期的影响及其机制,探讨HBx诱导HCC发生的早期生物行为,为HCC的发生机制、早期诊断和治疗奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞及小鼠永生化的小鼠肝前体细胞株14-19由美国芝加哥大学分子肿瘤研究中心馈赠,无特殊病原体(specificpathogen free,SPF)级KM小鼠,来自重庆医科大学动物中心。
1.1.2 主要试剂DMEM(高糖)培养基购自HyClone公司;FBS胎牛血清购自CELL BOX公司;DAB显色液及免疫组化SP试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司;HBx抗体和β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;AKT抗体、p-AKT抗体、mTOR抗体和p-mTOR抗体均购自Cell Signaling Technology公司;cyclinD1抗体、CDK2抗体、caspase9抗体和Bad抗体均购自万类生物科技有限公司;MK2206购自Selleck公司;总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;PCR试剂盒购自TaKaRa公司;SYBR*Premix Ex TaqTM实时荧光定量试剂盒购自大连宝生物公司;TUNEL-FITC绿色荧光标记原位凋亡检测试剂盒购自Roche公司;ECL显影液购自Advansta公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养及细胞株转染小鼠肝前体细胞株14-19培养于含10% FBS的高糖DMEM培养基中,置于培养箱中(37 ℃,5% CO2)。利用T4 DNA连接酶将目的基因片段HBx和线性化载体(pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro)以3 :1进行连接构建质粒(pLenti-CMV-HBVgp3-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro)。将14-19细胞接种于12孔板中,每孔5×104个细胞,待细胞贴壁后加入慢病毒载体和质粒。当EGFP表达量达到90%以上时,加入嘌呤霉素(1 μg/mL)筛选稳定表达的细胞株,连续筛选4周后进行目的基因检测。
1.2.2 动物模型构建及分组选取6~8周龄雄性KM小鼠45只,体质量18~22 g,随机分为3组:生理盐水组(normal saline group,NS)、EGFP-14-19组及HBx-EGFP-14-19组,每组15只。从肝门静脉分别注射生理盐水(200 μL),EGFP-14-19或HBx-EGFP-14-19细胞(5×105细胞悬浮于200 μL PBS中)。小鼠麻醉,避开口鼻腹部喷洒酒精并擦拭,于剑突下行2 cm纵向切口使暴露肝脏,挑起肝门静脉,血管夹轻夹门静脉远端,近端缓慢注射细胞或生理盐水,确认无出血后关闭腹腔,皮肤缝合。手术后120 d将小鼠安乐死,收取其肝脏,剪取一部分新鲜肝脏组织浸泡于4%多聚甲醛中,部分储存于液氮中,用于后续实验。
另取15只6~8周龄雄性KM小鼠,体质量18~22 g,从肝门静脉注射HBx-EGFP-14-19细胞(5×105细胞悬浮于200 μL PBS中),术后120 d将小鼠随机分为3组:空白对照组,磺丁基-β-环糊精(Captisol)组,MK2206组,每组5只小鼠。采用灌胃的方法分别给予空白对照组100 μL生理盐水,给予Captisol组100 μL 15% Captisol,给予MK2206组Akt磷酸化抑制剂MK2206 (120 mg/kg,溶于15% Captisol)。每周3次,给药1周,于第3次给药24 h后将小鼠安乐死,收取肝脏组织。
1.2.3 实时聚合酶链反应(qRT-PCR)RNA提取试剂盒提取小鼠肝脏的RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA后,稀释10倍,使用SYBR premix Ex Taq酶(TaKaRa)表达检测系统进行检测,引物见表 1。GAPDH作为内参,在CFX Manager软件系统(BIO-RAD)调整基线和阈值,确定Ct值,采用2-ΔΔCt法进行相对基因表达分析。每个样本设3个复孔,实验重复至少3次。
基因 | 序列 | |
GAPDH | 上游: | 5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′ |
下游: | 5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′ | |
HBx | 上游: | 5′-CCCAACTCCTCGTTCACGGTGGTCTC-3′ |
下游: | 5′-GAGACCACCGTGAACGAGGAGTTGGG-3′ | |
Caspase-9 | 上游: | 5′-TCAGGGGACATGCAGATATGG-3′ |
下游: | 5′-TTGGCAGTCAGGTCGTTCTTC-3′ | |
Bad | 上游: | 5′-CTCCGAAGGATGAGCGATGAG-3′ |
下游: | 5′-CTCCTTGTCTACGCTTTCCAC-3′ | |
CDK2 | 上游: | 5′-GTGGGCTCGGCAAGATTTTAG-3′ |
下游: | 5′-AGGTGGGGCACTGGTTTAGTTA-3′ | |
cyclinD1 | 上游: | 5′-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3′ |
下游: | 5′-ACTTGAAGTAAGATACGGAGGGC-3′ |
1.2.4 Western blot检测
小鼠肝脏组织剪碎后用液氮研磨,加入预混裂解液(RIPA :PMSF :磷酸酶抑制剂=100 :1 :2),细胞样本直接加入预混裂解液重悬,于冰上裂解45 min,离心(4 ℃,1 2 000 r/min)20 min,取上清液。用BCA法测定蛋白浓度后按比例加入蛋白上样缓冲液,100 ℃变性5 min,冷却,保存于-20 ℃,备用。SDS-PAGE电泳后转印蛋白至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,然后一抗孵育过夜(4 ℃)。次日,TBST洗涤膜后放入相应的二抗中,室温孵育2 h。TBST再次洗涤后,使用ECL发光剂显影,并用自动凝胶成像系统(Bio-Rad)采集图像。
1.2.5 免疫组化法组织切片经50 ℃烘片30 min,2次二甲苯脱蜡,置于梯度酒精中水化,98 ℃水浴修复抗原,冷却至室温,3% H2O2室温避光孵育15 min,灭活内源性过氧化物酶。牛血清37℃孵育25 min以封闭组织内非特异性抗原,一抗4 ℃孵育过夜。次日室温复温2 h,辣根过氧化物酶标记的链霉素工作液37 ℃孵育15 min,二抗室温孵育15 min,洗片后用二氨基联苯胺(DAB)室温避光显色,自来水冲洗终止反应。使用苏木素复染细胞核,脱水,透明,中性树胶封片。
1.2.6 荧光TUNEL实验肝脏组织经4%多聚甲醛48 h固定后石蜡包埋、切片,按照TUNEL试剂盒说明书操作,进行脱蜡、水合和细胞通透,加适量按1 :9混合的试剂1(TdT)和试剂2(dUTP),DAPI复染细胞核,然后抗荧光淬灭剂封片,200倍光镜下采集图像。每张切片随机选择5个视野,计算每个视野中凋亡细胞核数和总细胞核数,凋亡指数=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。
1.3 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件,数据以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肝前体细胞株中HBx的表达鉴定荧光显微镜观察显示HBx-EGFP-14-19组与EGFP-14-19组细胞均有绿色荧光蛋白的表达,表达量达90%以上(图 1A),表明慢病毒载体高效转染至14-19细胞。Western blot检测结果显示,与14-19组和EGFP-14-19组细胞相比,HBx-EGFP-14-19组细胞中有HBx蛋白质表达(图 1B),qRT-PCR和Western blot检测结果一致(图 1C,P < 0.01),说明HBx基因在14-19细胞中成功表达。
2.2 小鼠肝脏组织中HBx的表达鉴定
Western blot检测各组小鼠术后120 d的肝脏细胞中HBx蛋白质的表达,结果表明,相较于生理盐水组和EGFP-14-19组的小鼠肝脏组织,HBx-EGFP-14-19组中有HBx表达(图 2A),qRT-PCR与Western blot检测结果一致(图 2B,P < 0.01)。采用免疫组化法检测3组肝脏组织中HBx蛋白的表达,结果显示HBx- EGFP-14-19组小鼠肝脏组织有HBx的阳性染色(图 2C),且细胞质内及细胞膜中均能观察到棕黄色染色,表明HBx在小鼠肝脏中成功表达。生理盐水组与EGFP-14-19组未见阳性染色。
2.3 HBx对小鼠肝脏细胞凋亡和周期的影响
分别取3组小鼠术后120 d的肝脏组织,TUNEL染色后荧光显微镜观察显示(图 3A),HBx-EGFP-14-19组的TUNEL-FITC染色阳性细胞数较生理盐水组和EGFP-14-19组明显减少,凋亡率显著降低(图 3B,P < 0.01)。Western blot检测凋亡相关因子的蛋白质表达,结果显示caspase-9和Bad的表达明显降低(图 3C),qRT-PCR结果显示caspase-9和Bad的mRNA表达水平显著降低(图 3E、F,P < 0.01,P < 0.01)。同时Western blot检测周期相关因子的表达,结果显示周期相关因子CDK2和cyclin D1的表达明显降低(图 3D),qRT-PCR和Western blot检测结果一致(图 3G、H,P < 0.05,P < 0.01)。表明HBx在小鼠肝脏中抑制了肝脏细胞的凋亡并且促进了细胞周期进程。
2.4 HBx抑制肝脏细胞的凋亡作用与Akt/mTOR信号通路之间的关系
Western blot检测t-Akt/p-Akt(total-Akt/phospho-Akt)和t-mTOR/p-mTOR(total-mTOR/phospho-mTOR)蛋白质表达情况,结果表明,在HBx-EGFP-14-19组中,p-Akt和p-mTOR的蛋白质表达水平明显高于生理盐水组和EGFP-14-19组,而t-Akt和t-mTOR的表达在所有样本中没有差异(图 4A)。
给予HBx-EGFP-14-19组小鼠Akt磷酸化抑制剂MK2206,进一步探讨了HBx诱导抑制肝脏细胞的凋亡作用和Akt/mTOR信号通路之间的联系,对照组给予HBx-EGFP-14-19组小鼠生理盐水或15% Captisol。结果表明MK2206组中p-Akt和p-mTOR的表达显著减少,而t-Akt和t-mTOR的表达在所有样本中没有显著差异(图 4B)。通过检测凋亡和周期相关因子发现,相比于生理盐水和15% Captisol组,MK2206组的caspase9和Bad蛋白质表达水平显著增加(图 4C),mRNA表达水平与蛋白质表达水平一致(图 4E、F,P < 0.01,P < 0.05);CDK2和cyclinD1的蛋白质表达水平显著降低(图 4D),mRNA表达水平与蛋白质表达水平一致(图 4G、H,P < 0.01,P < 0.01)。这些结果表明,HBx通过激活Akt/mTOR信号通路抑制肝脏细胞凋亡并上调细胞周期调控因子的表达。
3 讨论HBx在HCC发生中的作用及其机制研究涵盖了HBx对基因的调控和表观遗传分子的调节等[10-11]。虽然很多研究报道了HBx与HCC的密切关系,但HBx在导致HCC发生过程中的作用机制尚不清楚。本研究显示,HBx在小鼠肝脏的表达激活了Akt/mTOR信号通路,从而抑制肝脏细胞的凋亡同时加速细胞周期的S期和G2期。用药物的方式抑制Akt/mTOR信号通路后,HBx抑制小鼠肝脏细胞的凋亡作用和加速细胞周期进程的影响被逆转。这些结果提示HBx通过调控Akt/mTOR信号通路在HCC的发展中发挥着重要作用。
本研究将转染HBx的HPCs注射到KM小鼠肝门静脉中,使HBx能够直接进入血液中。这种方式较皮下注射转染HBx的细胞能更好的模拟人体发生HCC的情况。本课题组基于此已经做过大量的研究,结果表明携带HBx的HPCs在进入血液之后其早期分化指标表达减少,晚期分化指标表达增加,揭示了HBx是影响HPCs分化的重要因素,并且极有可能使进入小鼠体内的肝前体细胞发生恶性转化[12]。此外,以往在探索HCC的发生、发展的实验中使用的大多是免疫系统不完整的动物模型,并不能充分说明HBx在肝癌中的作用机制,因为肝癌的发生是一个受非特异性先天免疫反应影响的复杂过程。因此,本研究采用有免疫健康功能的KM小鼠感染HBx建立动物模型,为探索由HBx诱导的HCC的作用机制提供更令人信服的证据。
在肿瘤发生、发展的多个阶段细胞凋亡都被抑制是肿瘤发生的重要原因,对细胞凋亡和周期的分子机制的深入研究为HCC的治疗奠定了基础[13-15]。研究表明,Akt/mTOR信号通路在细胞凋亡、增殖及肝再生中起着重要的作用,EGF可以通过Akt磷酸化来诱导肝细胞的增殖[16]。WHEELER等[17]的研究发现,Akt是肝癌发生过程中的一个关键分子,Akt的激活可以促进肝细胞的增殖。Akt磷酸化抑制剂MK2206可以抑制Akt信号通路的激活,从而抑制细胞增殖和肿瘤生长,并且可以促进细胞凋亡和增强细胞毒性[18]。这说明可以通过降低Akt的磷酸化来促进细胞凋亡,可能为肝癌的药物治疗提供了新的靶点。阐明HBx的重要生物学效应,可以进一步认识HBx的作用,最终为HBv相关的肝癌患者提供新的治疗策略,促进肝癌的临床治疗。因此,探讨HBx在正常免疫系统条件下的体内功能是未来研究的重点。本研究为建立原发性肝癌早期的诊断方法和治疗的药物靶点提供了理论依据。
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