2. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院全军肿瘤研究所
2. Cancer Institute, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一类具有典型组织学特征的肝癌，其所占比例达到了原发性肝癌的80%左右[1]。HCC细胞具有高度的增殖能力，但到目前为止，调控HCC细胞增殖的相关机制尚不清楚。
三结构域蛋白(tripartite motif，TRIM)是一类具有高度保守结构域的蛋白家族，其在细胞内发挥着重要的生物学作用，参与细胞的多条信号通路[2-3]。同时，TRIM的表达水平与癌症的发生、发展密切相关，尤其对肿瘤细胞的增殖调控发挥着重要作用[4]。
TRIM21也称之为Ro52(Ro protein 52)或者RNF81 (ring finger protein 81)，具有E3连接酶活性[5]。研究表明，TRIM21与诸多肿瘤如食道癌[6]、乳腺癌[7]的发生、发展紧密相关，但TRIM21与肿瘤细胞增殖间的关系尚不清楚。尤其关于TRIM21与HCC的关系以及TRIM21能否调控HCC细胞的增殖目前尚少见报道。
本研究以HCC细胞为对象，探讨TRIM21对HCC细胞增殖的调控作用及可能机制，旨在深入揭示HCC细胞的增殖调控机制，为探索以TRIM21为靶标的HCC治疗新策略提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料人HCC细胞系HepG2细胞和SMMC7721细胞由本校基础医学院生物化学与分子生物学教研室保存。胎牛血清和高糖DMEM培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Western blot 12% SDS-PAGE凝胶试剂盒购自美国Bio-Rad公司；CCK-8试剂盒、细胞裂解液RIPA、BCA蛋白定量试剂盒及蛋白酶抑制剂PMSF均购自江苏碧云天生物技术公司；抗HA标签兔多克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司，TRIM21抗体和ATG4B抗体购自美国Proteintech公司，山羊抗兔HRP标记二抗购自北京中杉金桥公司；流式FITC偶联Annexin V凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。转染试剂Lipofectamine3000购自美国Invitrogen公司，TRIM21和ATG4B的表达质粒购自美国GeneCopoeia公司，TRIM21的小干扰RNA购自上海吉荧公司，ATG4B的小干扰RNA购自上海吉玛公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养HepG2和SMMC7721细胞铺于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基的培养瓶中，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2 细胞转染HepG2和SMMC7721细胞以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到50%~60%时，分别转染TRIM21的表达质粒和siRNA，以及ATG4B表达的质粒和shRNA(转染用量按照转染试剂推荐用量)，于转染48 h后收获细胞进行下一步实验。
1.2.3 Western blot检测HepG2和SMMC7721细胞经转染48 h后，弃去上层培养基，用含5% EDTA的胰酶将细胞消化后加入1.5 mL的EP管中，用预冷的PBS漂洗细胞2次，每次1 000 r/min离心5 min，弃去上清，在每管加入100 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，用移液枪反复猛烈吹打至细胞完全裂解，于冰上放置10 min，然后在4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，将上清收集到新的EP管中，并使用BCA法制作蛋白标准曲线并标定蛋白浓度。将测定后的蛋白样品以每孔20 μg上样，在12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，待电泳结束后将凝胶中的蛋白用半干转的方法转移到PVDF膜上，在室温条件下用含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h，其后用PBST浸泡PVDF膜1 min，再分别用抗HA标签兔多克隆抗体(1 :1 000稀释)、兔多克隆TRIM21抗体(1 :1 000稀释)、ATG4B抗体(1 :1 000稀释)及GAPDH抗体(1 :1 000稀释)在4 ℃冰箱中孵育过夜，第2天分别用PBST洗膜3次，每次10 min后，用山羊抗兔二抗(1 :5 000稀释)室温孵育2 h，再用PBST洗膜3次，每次10 min后用化学发光底物法置于化学发光仪中显影曝光。
1.2.4 CCK-8检测 1.2.4.1 细胞存活实验HepG2和SMMC7721细胞以每孔1×104接种于48孔板中，设置对照组(即mock组)、实验组，其中实验组按不同处理方法分别为：过表达实验分为空载组(HepG2细胞为EX-NEG-M07-3HA组，SMM7721细胞为pCMV5组)和过表达组(HepG2细胞为pEZ-M07-TRIM21-3HA组，SMM7721细胞为pCMV-ATG4B组)；敲降实验分为空载组(HepG2细胞为pGPU6-shNC组，SMM7721细胞为siNC组)和敲降组(HepG2细胞为pGPU6-shATG4B-220组，SMM7721细胞为siTRIM21组)。每组设置3个复孔，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞密度汇合至50%~60%时，分别转染TRIM21的表达质粒和siRNA，以及ATG4B的表达质粒和shRNA(转染用量按照转染试剂推荐用量)，继续培养48 h后，每孔加入20 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育30 min后使用全波长酶标仪检测450 nm处的每孔的光密度值D(450)。
细胞存活率=(实验组光密度值-空白孔光密度值)/(对照组光密度值-空白孔光密度值) ×100%
1.2.4.2 细胞增殖实验将6孔板中转染48 h后的不同组细胞分别收获，按每孔2 000个细胞接种于96孔板中，以空白培养基为第0天，分别于第1~3天向部分孔中每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃、5%CO2孵育2 h后，使用全波长酶标仪检测450 nm处每孔的光密度值[D(450)]，每组细胞每天3个复孔。然后以时间为横坐标，光密度值为纵坐标制作细胞生长曲线。
1.2.5 细胞克隆形成实验转染48 h后的细胞消化后，按每孔1 000个细胞铺入6孔板中，继续于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养7 d后，用PBS漂洗细胞表面2次，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛室温固定15 min后，弃去多余液体，再加入1%的结晶紫染色10 min。然后用PBS冲洗培养板直到背景干净，在显微镜下计数克隆形成的集落中细胞的个数。
1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡用1.5 mL EP管收集转染48 h后的细胞，用预冷的PBS洗2次，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，每管中加入100 μL 1 ×Annexin V Binding buffer，5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI染液，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪进行检测。
1.2.7 流式细胞术检测细胞周期将转染48 h后的细胞收集于1.5 mL EP管中，PBS洗2次，离心弃上清，加入1 mL预冷的70%乙醇，于4 ℃固定过夜。第2天1 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS洗2次，离心并弃上清，每个样本加入80 μL 50 μg/mL RNA酶，混匀后37 ℃水浴30 min，再加入100 μL 50 μg/mL PI染液，混匀室温孵育15 min，滤网过滤后使用流式细胞仪进行检测。
1.3 统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行组间t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 TRIM21在HCC组织中的表达水平下调为了探究临床上TRIM21在HCC中的表达水平，本实验在TCGA数据库中找到了49例同时具有HCC组织和正常癌旁组织的患者样本数据，对其TRIM21的mRNA表达水平进行了评估。与正常组织相比，HCC组织中TRIM21的表达水平显著下调(P < 0.05，图 1)。
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| a:P < 0.05，与正常癌旁组织比较 图 1 TRIM21在HCC组织中的表达水平下调 |
2.2 在HepG2和SMMC7721细胞中上调和下调TRIM21的表达水平
为了探寻TRIM21在HCC中发挥的作用，需要选择合适的HCC细胞系调控TRIM21的表达水平，Western blot检测结果显示TRIM21在HepG2细胞中相对低表达，在SMMC7721细胞中相对高表达(图 2A)。在此基础上，对HepG2细胞进行TRIM21的表达质粒转染，上调其表达；对SMMC7721细胞进行TRIM21的siRNA转染，下调其表达。Western blot验证转染后TRIM21的表达水平(图 2B、C)。
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| A：Western blot检测HCC细胞系中TRIM21表达1：HepG2细胞；2：Hep3B细胞；3：SMMC7721细胞；4：PLC细胞；5：Huh-7细胞；B：Western blot检测质粒转染后HepG2细胞中TRIM21的蛋白水平1：EX-NEG-M07-3HA组；2：pEZ-M07-TRIM21-3HA组；C：Western blot检测siRNA转染后SMMC7721细胞中TRIM21的蛋白水平1：siNC组；2：siTRIM21组 图 2 选择合适的HCC细胞系上调和下调TRIM21 |
2.3 上调TRIM21抑制细胞存活，下调TRIM21促进细胞存活
为查明TRIM21在HCC中的功能，需要明确TRIM21在细胞学上的影响。本实验在细胞转染48 h后，采用CCK-8实验观察TRIM21的上调和下调对细胞存活率的影响。在HepG2细胞中上调TRIM21的表达后，细胞存活率显著下降(P < 0.01，图 3)，而在SMMC7721细胞中下调TRIM21的表达后，细胞存活率显著上升(P < 0.05，图 3)。
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| 1：HepG2 EX-NEG-M07-3HA组；2：HepG2 pEZ-M07-TRIM21-3HA组；3：SMMC7721 siNC组；4：SMMC7721 siTRIM21组a：P < 0.05，与SMMC7721 siNC组比较；b：P < 0.01，与HepG2 EX-NEG-M07-3HA组比较 图 3 过表达或敲低TRIM21对HCC细胞存活的影响 |
2.4 上调TRIM21可以抑制细胞增殖，下调TRIM21可以促进细胞增殖
为进一步明确TRIM21对细胞存活率的影响是否依赖于细胞增殖的变化，本研究使用CCK-8实验和细胞克隆形成实验观察细胞的增殖能力。结果显示，在HepG2细胞中，转染质粒pEZ-M07-TRIM21-3HA组与空载EX-NEG-M07-3HA组相比，细胞在第1、2、3天的生长速率显著下降(P < 0.001)，细胞克隆形成减少，克隆中的细胞数量显著减少(P < 0.01，图 4)；在SMMC7721细胞中，相比siNC组，使用靶向TRIM21的siRNA组的细胞在第1、2、3天的生长速率显著升高(P < 0.001)，细胞克隆形成增多，克隆中的细胞数量显著增加(P < 0.05，图 4)。
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| A：细胞克隆形成实验检测结果；B：细胞克隆形成实验统计分析1：HepG2 EX-NEG-M07-3HA组；2：HepG2 pEZ-M07-TRIM21-3HA组；3：SMMC7721 siNC组；4：SMMC7721 siTRIM21组a：P < 0.05，与SMMC7721 siNC组比较；b：P < 0.01，与HepG2 EX-NEG-M07-3HA组比较 图 4 上调或下调TRIM21对细胞增殖的影响 |
2.5 过表达或敲降TRIM21对细胞凋亡影响不明显
在证实细胞增殖的变化对细胞存活率产生影响的同时，还要进一步明确细胞凋亡的变化是否也参与了对细胞存活率的影响，本实验采用流式细胞术检测了细胞凋亡率的变化。结果显示，在两种细胞系中，过表达或敲降TRIM21，细胞凋亡的比例并没有发现明显的差异，说明TRIM21对细胞凋亡的影响并不明显(图 5)。
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| A：流式细胞术检测结果；B：流式细胞术检测统计分析1：HepG2 EX-NEG-M07-3HA组；2：HepG2 pEZ-M07-TRIM21-3HA组；3：SMMC7721 siNC组；4：SMMC7721 siTRIM21组 图 5 过表达或敲降TRIM21对细胞凋亡的影响 |
2.6 TRIM21在HCC细胞中可以负调控ATG4B的表达水平
为进一步探讨TRIM21在HCC细胞中影响细胞增殖的相关机制，结合本课题组之前关于ATG4B影响细胞增殖的研究，实验采用Western blot检测了上调TRIM21和下调TRIM21后的HepG2细胞和SMMC7721细胞中ATG4B的表达水平变化。结果表明，TRIM21在两种细胞系中可以负调控ATG4B的表达水平，体现为ATG4B的蛋白水平在HepG2细胞中随着TRIM21表达上升而下降(图 6A)和在SMMC7721细胞中随着TRIM21表达下降而上升(图 6B)。
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| A：Western blot检测上调TRIM21后HepG2细胞中ATG4B的蛋白水平变化1：EX-NEG-M07-3HA组；2：pEZ-M07-TRIM21-3HA组；B：Western blot检测下调TRIM21后SMMC7721细胞中ATG4B的蛋白水平变化1：siNC组；2：siTRIM21组 图 6 TRIM21在HCC细胞中可以负调控ATG4B的表达水平 |
2.7 ATG4B的下调抑制细胞存活，ATG4B的上调促进细胞存活
为确定TRIM21可以通过负调控ATG4B来影响肝癌细胞增殖的作用，本研究依据之前的结果，先在HepG2细胞中使用shRNA下调了ATG4B(图 7A)，在SMMC7721细胞中使用了ATG4B的表达质粒上调了ATG4B(图 7B)，后通过CCK-8实验检测了细胞存活率。结果显示，在HepG2细胞中，敲降ATG4B可使细胞存活率显著下降(P < 0.05，图 7C)，而在SMMC7721细胞中，过表达ATG4B可使细胞存活率显著上升(P < 0.05，图 7C)，该结果再结合图 3、4和图 6的结果，表明TRIM21可通过下调ATG4B而抑制HCC细胞存活与增殖。
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| A：Western blot检测shRNA转染后HepG2细胞中ATG4B的蛋白水平1：pGPU6-shNC组；2：pGPU6-shATG4B-220组；B：Western blot检测质粒转染后SMMC7721细胞中ATG4B的蛋白水平1：pCMV5组；2：pCMV-ATG4B组；C：CCK-8测定下调或上调ATG4B对HCC细胞存活的影响1：HepG2 pGPU6-shNC组；2：HepG2 pGPU6-shATG4B-220组；3：SMMC7721 pCMV5组；4：SMMC7721 pCMV-ATG4B组a：P < 0.05，与HepG2 pGPU6-shNC组比较，与SMMC7721 pCMV5组比较 图 7 调控ATG4B表达对HCC细胞增殖的影响 |
2.8 过表达或敲降ATG4B可以加快或阻滞细胞周期的G0/G1期
为进一步探明ATG4B具体影响细胞增殖的机制，使用流式细胞术检测了细胞周期中各个时期的比例，分析发现(图 8A)，下调ATG4B后，细胞周期过程中G0/G1期的比例显著增多(P < 0.01)，S期和G2/M期的比例下降，细胞周期进程阻滞于G0/G1期(图 8B)；而上调ATG4B后，G0/G1期的比例显著下降(P < 0.05)，S期和G2/M期的比例上升，细胞周期进程加快(图 8B)。
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| A：流式细胞术检测过表达和敲降ATG4B后HCC细胞的周期变化；B：HCC细胞周期各时期的比例a: P < 0.05，与SMMC7721 pCMV5组比较；b：P < 0.01，与HepG2 pGPU6-shNC组比较 图 8 过表达或敲降ATG4B后HCC细胞周期的变化 |
3 讨论
TRIM21是一种主要分布于细胞质的蛋白，当发生炎症反应时会显著上调并转移到细胞核中发挥功能[8]。与其他诸多TRIM蛋白相似，TRIM21具有E3连接酶活性并且可以参与蛋白泛素化的过程[5]。最新的研究证明，当细胞发生病原体(如病毒、细菌)感染时，TRIM21的表达上调[9]，并激活下游NF-κB(nuclear factor κB)、AP-1(activator protein 1)、IRF3(interferon regulatory factor 3)、IRF5(interferon regulatory factor 5)和IRF7(interferon regulatory factor 7)等转录因子信号通路从而为细胞提供强有力的抗病原体保护[10]。尽管很多TRIM家族蛋白被证实在癌症发生过程中起到了重要的调控作用，比如TRIM15在结直肠癌中[11]，TRIM62在乳腺癌[12]和肺癌[13]中均发挥抑癌作用，TRIM35在HCC中呈下调趋势，而且它的表达水平与肿瘤的分级、肿瘤的大小以及患者血清甲胎蛋白(AFP)的水平都呈负相关性[14]。但TRIM21在HCC进程中的作用却少见报道。本研究证实了TRIM21在HCC临床样本中表达水平降低，且发现TRIM21的低表达促进了HCC细胞的存活和增殖。选择性地过表达TRIM21可以降低细胞的存活率并抑制细胞增殖，初步表明TRIM21在HCC中发挥着抑癌作用。这一结果也暗示了TRIM21作为临床上治疗HCC关键靶蛋白的可能性。
ATG4B是隶属于ATG4家族的一种半胱氨酸蛋白酶，又称自噬蛋白酶-1(autophagin-1)，是存在于哺乳类动物体内的4种ATG4之一[15]。ATG4的主要功能是调节细胞自噬[16]。细胞自噬是真核细胞特有的高度保守的代谢过程，参与细胞内容物的降解和再循环。细胞通过形成双层膜结构的自噬小体可以将细胞内受损的蛋白质、细胞器等借助溶酶体途径进行降解，从而为处在压力状态下的细胞提供能量供应[17]，起到促进细胞存活的作用。在哺乳动物细胞中，ATG4B一方面可以在LC3-PE(microtubule associated protein 1 light chain 3-PtdEth)结合过程中剪切LC3的前体，推动LC3和PE的结合[18]，另一方面又可以在LC3-PE解离过程中切割LC3和PE[19]，从而回收LC3进行下一轮的结合[20]并促进自噬体膜的延伸[21]，所以ATG4B在LC3与PE之间的结合和解离过程是必不可少的。除细胞自噬外，最新研究表明，ATG4B还与肿瘤细胞的增殖密切相关，且ATG4B对肿瘤细胞增殖的调控与自噬过程无关。如下调ATG4B可以激活LKB1(liver kinase B1)-AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase)信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖[22]，ATG4B可以促进结直肠癌细胞增殖而非依赖自噬过程[23]。本课题组的前期研究也表明，ATG4B蛋白第34位丝氨酸的磷酸化可增强其线粒体转位而促进HCC细胞增殖[24]。本研究进一步证实，ATG4B的表达水平与HCC细胞增殖密切相关，而TRIM21很可能通过泛素化修饰ATG4B，调节其在细胞内的水平，从而影响HCC细胞增殖，这也与之前ATG4B可被E3连接酶RNF5泛素化修饰的相关报道符合[25]。本研究证明了TRIM21在HCC细胞中可以负调控ATG4B的表达水平，在上调或下调TRIM21的蛋白水平后，ATG4B的表达也相应地降低或升高。然而，TRIM21与ATG4B相互作用的具体方式以及TRIM21能否通过泛素化-蛋白酶体途径降解ATG4B尚需进一步研究证实。
细胞周期是细胞增殖中细胞通过控制DNA的复制和分离，最终由1个亲本细胞生成2个子代细胞的生物学过程。在哺乳类生物中，细胞周期可分为分裂期和分裂间期，根据DNA合成的情况，细胞间期可被进一步划分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)。其中，G1期作为DNA复制的准备期，它的时间长度是影响细胞周期时间的关键[26]。本研究发现ATG4B的表达水平可以影响细胞周期进程。当ATG4B表达水平高时，G1期的细胞比例减少，推动细胞周期加快，细胞增殖随之增强；当ATG4B表达水平低时，G1期的细胞比例增多，细胞周期发生阻滞，细胞增殖也随之减弱。结合TRIM21对ATG4B的调控作用，说明TRIM21影响细胞增殖的重要机制就是通过负调控ATG4B改变细胞周期进程，进而对细胞增殖产生作用。
综上所述，HCC中TRIM21的低表达导致了ATG4B的水平升高，促进了细胞的增殖。在此过程中，如果特异性上调TRIM21的表达，则使得ATG4B的水平降低，细胞周期阻滞，抑制细胞的增殖。本研究揭示了TRIM21作为一种潜在的抑癌蛋白可以调控细胞增殖，从而为后续探索以其为靶标的HCC治疗新策略提供了理论和实验依据。
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