2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院口腔科
2. Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
舍格伦综合征(Sjögren’s syndrome,SS),又称干燥综合征,被认为是一种慢性自身免疫性疾病,典型特征表现为外分泌腺的多发淋巴细胞浸润和腺体分泌量的减少[1-2]。近年来头颈部的恶性肿瘤发病率呈上升趋势,常规外科手术后多会采用放射治疗,反复大剂量的放射治疗往往会造成唾液腺的损伤, 导致腺泡细胞的损坏、唾液分泌量减少, 出现类似SS的症状[3]。
随着研究的不断深入,水通道蛋白(aquaporins, AQPs)在SS的发病过程中的作用逐渐被学者们所重视[4]。AQPs家族的蛋白相对分子质量约为28×103,在哺乳动物体内,至少已经发现13种亚型(AQP0-AQP12)[5]。这个细胞跨膜家族的发现,从分子水平上揭示了水跨膜转运调节的基本机制[6]。在已知的AQPs家族中,AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8分布于哺乳动物的涎腺。目前的研究表明,AQP5在涎腺分泌过程中发挥主要的作用[7]。水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)是一种高水溶性促水分子快速转运的跨膜蛋白,在人类基因中位于第12号染色体长臂12q13,含有795 bp,编码265个氨基酸,相对分子质量约为27×103,主要分布于肺泡上皮细胞,外分泌腺的腺泡上皮细胞的顶膜、侧膜、闰管,导管上皮细胞中和角膜上皮细胞的顶质膜,它构成了腺体的分泌通道,起到了转运水的作用。研究表明,AQP5的表达下调是SS的主要致病性因素。研究还发现,干燥综合征患者的AQP5启动子区存在高甲基化的CpG岛。AQP5的甲基化状态与其功能密切相关,但作为甲基化体系中的重要组成部分,MBD2是否参与AQP5的表达调控尚不清楚。本实验尝试在HSG细胞中调节MBD2的表达,检测AQP5的表达是否会随之产生变化,拟构建MBD2参与AQP5表达的模型,为干燥综合征的基因治疗提供可能的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料HSG细胞购于中科院上海细胞库,DMEM培养液、胎牛血清(100 mL)购自美国GIBCO公司,MBD2过表达质粒、MBD2-siRNA及AQP5启动子质粒由上海吉玛生物科技有限公司合成;引物由Invitrogen公司合成,MBD2、AQP5抗体购于Santa Cruz公司,β-actin抗体购于Thermo公司;RNA提取、反转录及SYBR定量PCR试剂购于Takara公司,蛋白提取及SDS-PAGE电泳试剂购于碧云天生物科技公司,质粒提取及双荧光素酶报告基因检测试剂购于Progema公司。
1.2 细胞培养传代人下颌下腺细胞(HSG)用含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养,细胞生长至90%融合时开始传代,细胞贴壁生长,每2~3日传代1次,等细胞处于对数生长期时用于实验。
1.3 细胞转染 1.3.1 AQP5启动子质粒与MBD2-siRNA或MBD2过表达质粒共转染将转染试剂、siRNA混合液及启动子质粒、内参质粒混合液加入培养液中,混匀,将细胞放置CO2培养箱内培养,4~6 h后可更换培养基,继续培养18 h后检测启动子活性。实验分为对照组、siRNA#1、siRNA#2等3组(n=9),实验重复3次以上。将转染试剂、过表达质粒混合液及启动子质粒、内参质粒混合液加入培养液中,混匀,将细胞放置CO2培养箱内培养,4~6 h 后可更换培养基,继续培养18 h后检测启动子活性。实验分为对照组和过表达质粒0.1、0.2、0.3 μg等4组(n=12),实验重复3次以上。
1.3.2 MBD2- siRNA转染上海吉玛基因公司设计合成特异性MBD2干扰RNA:MBD2-siRNA#1(序列:顺义链5′-GCCAGUGCUUUGCACACAATT-3′, 反义链:5′-UUGUGUGCAAAGCACUGGCTT-3′)、siRNA#2(序列:顺义链5′-CCGGUAACCAAAGUCACAATT-3′,反义链:5′-UUGUGACUUUGGUUACCGGTT-3′)。细胞接种于孔板中,将转染试剂和MBD2-siRNA混合液加入培养液中,混匀,放置CO2培养箱内培养;4~6 h后更换培养基,继续培养18 h后检测。实验分为对照组、siRNA#1、siRNA#2等3组(n=9),实验重复3次以上。
1.3.3 MBD2过表达质粒转染将转染试剂和过表达质粒混合液加入培养液中混匀,放置CO2培养箱内培养;4~6 h后更换培养基,继续培养18 h后检测。实验分为对照组及MBD2过表达质粒1、2 μg等3组(n=9),实验重复3次以上。
1.4 AQP5启动子活性检测(双荧光素酶报告基因检测)取50 μL萤火虫荧光素酶检测试剂到EP管中,加入细胞裂解液,轻微旋涡震荡混合后,置于荧光检测仪Modulus 9200中进行测量;随后加入50 μL海肾荧光素酶检测试剂,轻微旋涡震荡混合后,置于荧光检测仪Modulus 9200中进行测量;荧光素酶报告基因启动子活性分析:标准化相对荧光素酶单位光单位(Normalized Relative luciferase units, NRLU)=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.5 RNA提取及反转录RNA的提取、纯化及反转录参照Takara公司的细胞总RNA提取试剂盒及反转录试剂盒说明书进行。提取RNA后测定浓度,取适量RNA用于反转录,反转录条件为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,而后置于4 ℃保存备用。
1.6 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物由Invitrogen公司合成,MBD2基因引物的序列(上游:5′-AAGTGATCCGTCTGGGC-3′,下游:5′-TGCCAACTGAGGCTTGCTTC-3′引物长度:95 bp)、AQP5基因引物的序列(上游:5′-CGGGCTTTCTTCTACGTGG-3′,下游:5′-GCTGGAAGGTCAGAATCAGC-TC-3′引物长度:169 bp)、β-actin基因引物的序列(上游:5′-CATGGAGTCCTGTGGCATCC-3′,下游:5′-AATGCCAGGGTACATGGTGG-3′引物长度:124 bp)。RT-qPCR扩增条件如下:95 ℃,30 sec预变性;然后95 ℃,变性5 sec;60 ℃,退火延伸30 sec;循环40次;72 ℃终末延伸120 s。扩增结束后进行溶解曲线反应,排除引物二聚体或非特异性扩增。得到的目的基因Ct值参照内参基因(β-actin)Ct值采用2-△△Ct公式计算出各基因的mRNA相对表达量(Q)。
1.7 Western blot取MBD2干扰和过表达样品,加入细胞裂解液裂解15 min,95 ℃变性5 min后加样进行SDS-PAGE电泳,转膜,加入一抗孵育过夜后洗涤,再加入相应二抗孵育1 h洗涤,放入凝胶成像分析仪中进行显色观察,拍照保存。用图像编辑软件对蛋白条带进行灰度扫描及图像处理。
1.8 统计学处理每个实验重复3次以上,数据用x±s表示,采用SPSS22. 0进行数据的统计学分析,计量资料采用t检验分析,计数资料采用Fisher确切概率法分析。
2 结果 2.1 MBD2对HSG细胞中AQP5启动子活性的影响MBD2-siRNA及AQP5启动子质粒共转染HSG细胞后,AQP5启动子活性增加,说明MBD2表达抑制后,AQP5启动子活性升高(P < 0.05,图 1)。MBD2过表达质粒及AQP5启动子质粒共转染HSG细胞后,AQP5启动子活性降低,表明MBD2表达上调后,AQP5启动子活性降低(P < 0.05,图 2)。
2.2 MBD2对HSG细胞中AQP5 mRNA水平的影响
MBD2-siRNA转染HSG细胞后,在mRNA水平上,MBD2的表达下调,AQP5的表达上调,结果表明,MBD2表达抑制后,AQP5的表达在mRNA水平上呈上调趋势(P < 0.05,图 3)。MBD2过表达质粒转染细胞后,在mRNA水平上,MBD2的表达上调,AQP5的表达下降,结果表明,MBD2表达上调后,AQP5的表达在mRNA水平上呈下降趋势(P < 0.05,图 4)。
2.3 MBD2对HSG细胞中AQP5蛋白水平表达的影响
MBD2-siRNA转染HSG细胞:MBD2显影灰度降低,AQP5灰度加深,表明在蛋白水平上,MBD2表达抑制后,AQP5表达上调(P < 0.05,图 5)。MBD2过表达质粒转染HSG细胞后,MBD2显影灰度加深,AQP5显影灰度呈减淡趋势,表明在蛋白水平上,MBD2表达上调后,AQP5表达水平呈下降趋势(P < 0.05,图 6)。
3 讨论
SS是一种外分泌腺被淋巴细胞浸润的慢性自身免疫性疾病,临床上多见于40岁以上的中老年女性,约为男性患者的9倍[8],但男性患者更难诊断,一旦确诊,病情更重[9]。流行病学调查显示,我国成人患病率约0.33%~0.77%[10]。SS病因复杂,可能与遗传、病毒及性激素等诸多因素相关[11],所以目前仍无较好的治疗方式。SEINFELD等[12]的研究结果表明,SS模型鼠的唾液分泌量减少、颌下腺指数降低与颌下腺AQP5表达显著下调有关,而学者WU [13]的研究发现,白芍总甙通过上调AQP5及其mRNA的表达可以改善NOD小鼠颌下腺的病理损害。这些研究说明颌下腺AQP5表达的降低与SS发病具有相关性[14]。目前针对AQP5的研究主要局限于啮齿类动物上,对SS患者的研究还不够全面[15]。LEE等[16]通过对人颌下腺细胞的研究表明抗M3R自身抗体与受体的结合抑制了AQP5向胞膜的转运,可导致SS患者唾液分泌量的减少。但AQP5在SS发病过程中所扮演的角色及作用等问题仍有诸多争议。明确AQP5发挥效应的信号通路及其机制,对SS的治疗可能会有重大的意义。
研究发现,AQP5启动子区的CpG岛(-406到+1)有43个CG,其中第24号和第31号两个位点的CG发生去甲基化对AQP5的表达起到了重大的作用。MOTEGI等[17]的研究认为,这两个位点的CG可协同调节AQP5的表达。在哺乳动物的基因组中,大约有70%~80%的CpG发生了甲基化,这就为甲基化CpG结合构域蛋白(MBD)提供了大量可结合的位点。MBD家族中共有六个成员:MBD1-4、MeCP2及Kaiso。其中MBD1-3及MeCP2与基因转录调节的抑制有关,MBD4与DNA修复有关[18]。MBD蛋白本身就是基因转录的抑制子,当MBD结合到甲基化的CpG位点后,可与其他转录复合抑制因子相互作用或招募组蛋白修饰酶,一起改变染色质的结构,可以达到抑制目标基因表达的目的[19]。
MBD2作为MBD家族的成员之一,是唯一报道的具甲基化沉默基因的能力同时又具去甲基化酶活性的DNA甲基化调控蛋白,因其在基因表达的表观遗传学调控中的作用而被广泛关注。大部分MBD蛋白保持单独的MBD域和TRD域,但这两个域在MBD2蛋白序列的中心发生了重叠,表明MBD2具有紧密结合甲基化DNA和抑制转录的功能[20]。最新的研究还发现MBD蛋白可以调整DNA甲基化的模式,并作为更高级别的表观基因组织动态地促进DNA甲基化,在基因的转录和表达中发挥重要作用[20]。这些均提示MBD2作为一种甲基化依赖型转录抑制因子,可以通过组织甲基化作用,进而调节细胞基因表达。
MBD2作为甲基化CpG的结合域蛋白,可以结合到甲基化的CpG位点,但是否参与AQP5的表达调控尚不清楚,在干燥综合征疾病的临床意义目前尚无定论。我们的研究结果表明体外HSG细胞中上调MBD2表达后,AQP5的表达受到抑制;下调MBD2的表达后,AQP5的表达出现上调。实验较全面地探讨了HSG细胞中MBD2对AQP5的表达的影响,建立了相对完善的MBD2参与AQP5表达的模型。具体MBD2通过何种机制和途径对AQP5的表达产生影响,进而影响SS的疾病进程,后期课题组预备通过增加EMSA或CHIP实验作更深入的探讨、研究。
总之,本阶段的研究表明,MBD2在HSG细胞中可以下调AQP5的表达,与干燥综合征的发病机制密切相关,为SS的基因治疗提供了一个全新的视角。因此,MBD2可作为SS发病的标志物及基因治疗的全新靶点进行关注。
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