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HSG细胞中MBD2对AQP5表达的调控作用
陈中林1,2, 聂敏海1, 贾颖1, 叶艳艳2, 邓舒婷2, 黄葳2, 刘旭倩1     
1. 646000 四川泸州;西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜科;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院口腔科
[摘要] 目的 探讨人下颌下腺细胞(human submandibular gland,HSG)中,甲基化CpG结合域蛋白2(menthyl-CpG-binding domain protein 2,MBD2)是否影响水通道蛋白调控-5(aquaporin 5,AQP5)的表达,为干燥综合征(Sjögren’s syndrome,SS)的治疗提供新的思路。方法 体外培养HSG细胞,通过AQP5的启动子质粒与MBD2-siRNA或MBD2过表达质粒共转染HSG细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测AQP5启动子的活性;再用MBD2-siRNA或MBD2过表达质粒转染HSG细胞,利用RT-PCR及Western blot技术检测MBD2和AQP5在mRNA水平及蛋白水平上表达的改变。结果 ① MBD2-siRNA转染HSG细胞后,AQP5 pro活性分别上调49.30%和58.35%(P < 0.05), AQP5在mRNA水平上表达上调35.40%和471.19%(P < 0.05),蛋白水平上调56.16%和82.78% (P < 0.05)。结果表明:MBD2-siRNA转染HSG细胞后,AQP5启动子活性增加,AQP5表达上调。②MBD2过表达质粒转染HSG细胞后,AQP5 pro活性分别下调25.36%、30.52%及34.78%(P < 0.05), AQP5在mRNA水平上表达下调8.06%和87.60%(过表达质粒1 μg组与对照组相比无统计学意义,P>0.05;过表达质粒2 μg组与对照组相比差异有统计学意义P < 0.05),在蛋白水平上表达下调44.50%和53.18%(P < 0.05)。实验结果表明:MBD2转染ASG细胞后,AQP5启动子活性降低,AQP5的表达下降(P < 0.05)。结论 MBD2可以下调AQP5的表达,这与SS患者的AQP5表达趋势一致,因此MBD2可能成为干燥综合征基因治疗的新靶点。
[关键词] 干燥综合征     MBD2     AQP5     基因治疗    
Role of methyl-CpG-binding domain protein 2 in regulating aquaporin-5 expression in human submandibular gland cells in vitro
CHEN Zhonglin1,2, NIE Minhai1, JIA Ying1, YE Yanyan2, DENG Shuting2, HUANG Wei2, LIU Xuqian1     
1. Department of Periodontal Medicine, Affiliated Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan Province, 646000;
2. Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
[Abstract] Objective To study whether methyl-CpG-binding domain protein 2 (MBD2) affects the expression of aquaporin-5 (AQP5) in human submandibular gland (HSG) cells, thereby exploring a new approach to treatment of Sjögren's syndrome (SS). Methods Cultured HSG cells were co-transfected with the promoter plasmid of AQP5 and the plasmids for MBD2 silencing (MBD2-siRNA) or overexpression. Luciferase report gene assay was used to detect the transcription level of AQP5 in the transfected cells. In HSG cells transfected with the MBD2-siRNA or the overexpression plasmids, RT-qPCR and Western blotting were performed to analyze the changes in MBD2 and AQP5 expression at both the mRNA and protein levels. Results Transfection of the cells with the 2 MBD2-siRNAs respectively increased AQP5 promoter activity by 49.30% and 58.35% (P < 0.05) and obviously upregulated the expression of AQP5 by 35.40% and 471.19% at the mRNA level (P < 0.05) and by 56.16% and 82.78% at the protein level (P < 0.05). Transfection of the cells with the three MBD2 overexpression plasmids resulted in significantly lowered AQP5 promoter activity by 25.36%, 30.52% and 34.78% (P < 0.05); while 1 plasmid produced no significant changes in AQP5 mRNA level, the other 2 plasmids significantly down-regulated AQP5 expression by 8.06% and 87.60% at the mRNA level (P < 0.05) and by 44.50% and 53.18% at the protein level (P < 0.05). Conclusion MBD2 could down-regulats the expression of AQP5 in HSG cells in vitro, which consistent with the AQP5 expression about patients with SS, and this finding indentifies MBD2 as a potential target in gene therapy for the syndrome.
[Key words] Sjogren's syndrome     methyl-CpG-binding domain protein 2     aquaporin-5     gene therapy    

舍格伦综合征(Sjögren’s syndrome,SS),又称干燥综合征,被认为是一种慢性自身免疫性疾病,典型特征表现为外分泌腺的多发淋巴细胞浸润和腺体分泌量的减少[1-2]。近年来头颈部的恶性肿瘤发病率呈上升趋势,常规外科手术后多会采用放射治疗,反复大剂量的放射治疗往往会造成唾液腺的损伤, 导致腺泡细胞的损坏、唾液分泌量减少, 出现类似SS的症状[3]

随着研究的不断深入,水通道蛋白(aquaporins, AQPs)在SS的发病过程中的作用逐渐被学者们所重视[4]。AQPs家族的蛋白相对分子质量约为28×103,在哺乳动物体内,至少已经发现13种亚型(AQP0-AQP12)[5]。这个细胞跨膜家族的发现,从分子水平上揭示了水跨膜转运调节的基本机制[6]。在已知的AQPs家族中,AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8分布于哺乳动物的涎腺。目前的研究表明,AQP5在涎腺分泌过程中发挥主要的作用[7]。水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)是一种高水溶性促水分子快速转运的跨膜蛋白,在人类基因中位于第12号染色体长臂12q13,含有795 bp,编码265个氨基酸,相对分子质量约为27×103,主要分布于肺泡上皮细胞,外分泌腺的腺泡上皮细胞的顶膜、侧膜、闰管,导管上皮细胞中和角膜上皮细胞的顶质膜,它构成了腺体的分泌通道,起到了转运水的作用。研究表明,AQP5的表达下调是SS的主要致病性因素。研究还发现,干燥综合征患者的AQP5启动子区存在高甲基化的CpG岛。AQP5的甲基化状态与其功能密切相关,但作为甲基化体系中的重要组成部分,MBD2是否参与AQP5的表达调控尚不清楚。本实验尝试在HSG细胞中调节MBD2的表达,检测AQP5的表达是否会随之产生变化,拟构建MBD2参与AQP5表达的模型,为干燥综合征的基因治疗提供可能的理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

HSG细胞购于中科院上海细胞库,DMEM培养液、胎牛血清(100 mL)购自美国GIBCO公司,MBD2过表达质粒、MBD2-siRNA及AQP5启动子质粒由上海吉玛生物科技有限公司合成;引物由Invitrogen公司合成,MBD2、AQP5抗体购于Santa Cruz公司,β-actin抗体购于Thermo公司;RNA提取、反转录及SYBR定量PCR试剂购于Takara公司,蛋白提取及SDS-PAGE电泳试剂购于碧云天生物科技公司,质粒提取及双荧光素酶报告基因检测试剂购于Progema公司。

1.2 细胞培养传代

人下颌下腺细胞(HSG)用含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养,细胞生长至90%融合时开始传代,细胞贴壁生长,每2~3日传代1次,等细胞处于对数生长期时用于实验。

1.3 细胞转染

1.3.1 AQP5启动子质粒与MBD2-siRNA或MBD2过表达质粒共转染

将转染试剂、siRNA混合液及启动子质粒、内参质粒混合液加入培养液中,混匀,将细胞放置CO2培养箱内培养,4~6 h后可更换培养基,继续培养18 h后检测启动子活性。实验分为对照组、siRNA#1、siRNA#2等3组(n=9),实验重复3次以上。将转染试剂、过表达质粒混合液及启动子质粒、内参质粒混合液加入培养液中,混匀,将细胞放置CO2培养箱内培养,4~6 h 后可更换培养基,继续培养18 h后检测启动子活性。实验分为对照组和过表达质粒0.1、0.2、0.3 μg等4组(n=12),实验重复3次以上。

1.3.2 MBD2- siRNA转染

上海吉玛基因公司设计合成特异性MBD2干扰RNA:MBD2-siRNA#1(序列:顺义链5′-GCCAGUGCUUUGCACACAATT-3′, 反义链:5′-UUGUGUGCAAAGCACUGGCTT-3′)、siRNA#2(序列:顺义链5′-CCGGUAACCAAAGUCACAATT-3′,反义链:5′-UUGUGACUUUGGUUACCGGTT-3′)。细胞接种于孔板中,将转染试剂和MBD2-siRNA混合液加入培养液中,混匀,放置CO2培养箱内培养;4~6 h后更换培养基,继续培养18 h后检测。实验分为对照组、siRNA#1、siRNA#2等3组(n=9),实验重复3次以上。

1.3.3 MBD2过表达质粒转染

将转染试剂和过表达质粒混合液加入培养液中混匀,放置CO2培养箱内培养;4~6 h后更换培养基,继续培养18 h后检测。实验分为对照组及MBD2过表达质粒1、2 μg等3组(n=9),实验重复3次以上。

1.4 AQP5启动子活性检测(双荧光素酶报告基因检测)

取50 μL萤火虫荧光素酶检测试剂到EP管中,加入细胞裂解液,轻微旋涡震荡混合后,置于荧光检测仪Modulus 9200中进行测量;随后加入50 μL海肾荧光素酶检测试剂,轻微旋涡震荡混合后,置于荧光检测仪Modulus 9200中进行测量;荧光素酶报告基因启动子活性分析:标准化相对荧光素酶单位光单位(Normalized Relative luciferase units, NRLU)=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.5 RNA提取及反转录

RNA的提取、纯化及反转录参照Takara公司的细胞总RNA提取试剂盒及反转录试剂盒说明书进行。提取RNA后测定浓度,取适量RNA用于反转录,反转录条件为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,而后置于4 ℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)

引物由Invitrogen公司合成,MBD2基因引物的序列(上游:5′-AAGTGATCCGTCTGGGC-3′,下游:5′-TGCCAACTGAGGCTTGCTTC-3′引物长度:95 bp)、AQP5基因引物的序列(上游:5′-CGGGCTTTCTTCTACGTGG-3′,下游:5′-GCTGGAAGGTCAGAATCAGC-TC-3′引物长度:169 bp)、β-actin基因引物的序列(上游:5′-CATGGAGTCCTGTGGCATCC-3′,下游:5′-AATGCCAGGGTACATGGTGG-3′引物长度:124 bp)。RT-qPCR扩增条件如下:95 ℃,30 sec预变性;然后95 ℃,变性5 sec;60 ℃,退火延伸30 sec;循环40次;72 ℃终末延伸120 s。扩增结束后进行溶解曲线反应,排除引物二聚体或非特异性扩增。得到的目的基因Ct值参照内参基因(β-actin)Ct值采用2-△△Ct公式计算出各基因的mRNA相对表达量(Q)。

1.7 Western blot

取MBD2干扰和过表达样品,加入细胞裂解液裂解15 min,95 ℃变性5 min后加样进行SDS-PAGE电泳,转膜,加入一抗孵育过夜后洗涤,再加入相应二抗孵育1 h洗涤,放入凝胶成像分析仪中进行显色观察,拍照保存。用图像编辑软件对蛋白条带进行灰度扫描及图像处理。

1.8 统计学处理

每个实验重复3次以上,数据用x±s表示,采用SPSS22. 0进行数据的统计学分析,计量资料采用t检验分析,计数资料采用Fisher确切概率法分析。

2 结果 2.1 MBD2对HSG细胞中AQP5启动子活性的影响

MBD2-siRNA及AQP5启动子质粒共转染HSG细胞后,AQP5启动子活性增加,说明MBD2表达抑制后,AQP5启动子活性升高(P < 0.05,图 1)。MBD2过表达质粒及AQP5启动子质粒共转染HSG细胞后,AQP5启动子活性降低,表明MBD2表达上调后,AQP5启动子活性降低(P < 0.05,图 2)。

a:P < 0.05,与对照组比较 图 1 MBD2-siRNA及AQP5启动子质粒共转染细胞后AQP5启动子活性改变的情况(n=9,x±s)

a:P < 0.05,与对照组比较 图 2 MBD2过表达质粒及AQP5启动子质粒共转染细胞后AQP5启动子活性改变的情况(n=12,x±s)

2.2 MBD2对HSG细胞中AQP5 mRNA水平的影响

MBD2-siRNA转染HSG细胞后,在mRNA水平上,MBD2的表达下调,AQP5的表达上调,结果表明,MBD2表达抑制后,AQP5的表达在mRNA水平上呈上调趋势(P < 0.05,图 3)。MBD2过表达质粒转染细胞后,在mRNA水平上,MBD2的表达上调,AQP5的表达下降,结果表明,MBD2表达上调后,AQP5的表达在mRNA水平上呈下降趋势(P < 0.05,图 4)。

a:P < 0.05,与对照组比较 图 3 MBD2-siRNA转染细胞后MBD2(A)及AQP5(B)表达情况(n=9,x±s)

A:MBD2 a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.01,与对照组及1μg组比较; B:AQP5 a:P < 0.05,与2 μg组比较 图 4 过表达质粒转染HSG细胞后MBD2(A)及AQP5(B)的表达情况(n=9,x±s)

2.3 MBD2对HSG细胞中AQP5蛋白水平表达的影响

MBD2-siRNA转染HSG细胞:MBD2显影灰度降低,AQP5灰度加深,表明在蛋白水平上,MBD2表达抑制后,AQP5表达上调(P < 0.05,图 5)。MBD2过表达质粒转染HSG细胞后,MBD2显影灰度加深,AQP5显影灰度呈减淡趋势,表明在蛋白水平上,MBD2表达上调后,AQP5表达水平呈下降趋势(P < 0.05,图 6)。

1:对照组;2:siRNA#1组;3:siRNA#2组;A:蛋白电泳图;B:siRNA转染细胞后MBD2蛋白表达情况;C:siRNA转染细胞后AQP5蛋白表达情况a:P < 0.05,与对照组比较 图 5 MBD2-siRNA转染细胞后MBD2及AQP5蛋白表达情况(n=9,x±s)

1:对照组;2:过表达质粒1 μg;3:过表达质粒2 μg;A:蛋白电泳图;B:过表达质粒转染细胞后MBD2蛋白表达情况(n=9,x±s) a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.05,与1 μg组比较;C:siRNA转染细胞后AQP5蛋白表达情况(n=9,x±s) a:P < 0.05,与对照组比较 图 6 MBD2过表达质粒转染细胞后MBD2及AQP5蛋白表达情况

3 讨论

SS是一种外分泌腺被淋巴细胞浸润的慢性自身免疫性疾病,临床上多见于40岁以上的中老年女性,约为男性患者的9倍[8],但男性患者更难诊断,一旦确诊,病情更重[9]。流行病学调查显示,我国成人患病率约0.33%~0.77%[10]。SS病因复杂,可能与遗传、病毒及性激素等诸多因素相关[11],所以目前仍无较好的治疗方式。SEINFELD等[12]的研究结果表明,SS模型鼠的唾液分泌量减少、颌下腺指数降低与颌下腺AQP5表达显著下调有关,而学者WU [13]的研究发现,白芍总甙通过上调AQP5及其mRNA的表达可以改善NOD小鼠颌下腺的病理损害。这些研究说明颌下腺AQP5表达的降低与SS发病具有相关性[14]。目前针对AQP5的研究主要局限于啮齿类动物上,对SS患者的研究还不够全面[15]。LEE等[16]通过对人颌下腺细胞的研究表明抗M3R自身抗体与受体的结合抑制了AQP5向胞膜的转运,可导致SS患者唾液分泌量的减少。但AQP5在SS发病过程中所扮演的角色及作用等问题仍有诸多争议。明确AQP5发挥效应的信号通路及其机制,对SS的治疗可能会有重大的意义。

研究发现,AQP5启动子区的CpG岛(-406到+1)有43个CG,其中第24号和第31号两个位点的CG发生去甲基化对AQP5的表达起到了重大的作用。MOTEGI等[17]的研究认为,这两个位点的CG可协同调节AQP5的表达。在哺乳动物的基因组中,大约有70%~80%的CpG发生了甲基化,这就为甲基化CpG结合构域蛋白(MBD)提供了大量可结合的位点。MBD家族中共有六个成员:MBD1-4、MeCP2及Kaiso。其中MBD1-3及MeCP2与基因转录调节的抑制有关,MBD4与DNA修复有关[18]。MBD蛋白本身就是基因转录的抑制子,当MBD结合到甲基化的CpG位点后,可与其他转录复合抑制因子相互作用或招募组蛋白修饰酶,一起改变染色质的结构,可以达到抑制目标基因表达的目的[19]

MBD2作为MBD家族的成员之一,是唯一报道的具甲基化沉默基因的能力同时又具去甲基化酶活性的DNA甲基化调控蛋白,因其在基因表达的表观遗传学调控中的作用而被广泛关注。大部分MBD蛋白保持单独的MBD域和TRD域,但这两个域在MBD2蛋白序列的中心发生了重叠,表明MBD2具有紧密结合甲基化DNA和抑制转录的功能[20]。最新的研究还发现MBD蛋白可以调整DNA甲基化的模式,并作为更高级别的表观基因组织动态地促进DNA甲基化,在基因的转录和表达中发挥重要作用[20]。这些均提示MBD2作为一种甲基化依赖型转录抑制因子,可以通过组织甲基化作用,进而调节细胞基因表达。

MBD2作为甲基化CpG的结合域蛋白,可以结合到甲基化的CpG位点,但是否参与AQP5的表达调控尚不清楚,在干燥综合征疾病的临床意义目前尚无定论。我们的研究结果表明体外HSG细胞中上调MBD2表达后,AQP5的表达受到抑制;下调MBD2的表达后,AQP5的表达出现上调。实验较全面地探讨了HSG细胞中MBD2对AQP5的表达的影响,建立了相对完善的MBD2参与AQP5表达的模型。具体MBD2通过何种机制和途径对AQP5的表达产生影响,进而影响SS的疾病进程,后期课题组预备通过增加EMSA或CHIP实验作更深入的探讨、研究。

总之,本阶段的研究表明,MBD2在HSG细胞中可以下调AQP5的表达,与干燥综合征的发病机制密切相关,为SS的基因治疗提供了一个全新的视角。因此,MBD2可作为SS发病的标志物及基因治疗的全新靶点进行关注。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201811163
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由第三军医大学主管、主办

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陈中林, 聂敏海, 贾颖, 叶艳艳, 邓舒婷, 黄葳, 刘旭倩.
CHEN Zhonglin, NIE Minhai, JIA Ying, YE Yanyan, DENG Shuting, HUANG Wei, LIU Xuqian.
HSG细胞中MBD2对AQP5表达的调控作用
Role of methyl-CpG-binding domain protein 2 in regulating aquaporin-5 expression in human submandibular gland cells in vitro
第三军医大学学报, 2019, 41(10): 955-960
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(10): 955-960
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201811163

文章历史

收稿: 2018-11-12
修回: 2019-01-02

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