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长链非编码RNA LINC00324对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响
周征宇1, 向颖1, 袁帅1, 吴龙1, 邬娜1, 谢薇佳1, 许斌1, 李成英1, 张耀1, 马翔宇1, 蔡同建1, 余祖滨2, 白莉3, 李亚斐1     
1. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系军队流行病学教研室;
2. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院:胸外科;
3. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院:全军呼吸内科研究所,全军呼吸病研究重点实验室
[摘要] 目的 观测长链非编码RNA LINC00324在非小细胞肺癌中的表达情况,探讨其对非小细胞肺癌细胞系生物学功能的影响。方法 通过qRT-PCR检测LINC00324在65对配对肺癌组织及癌旁正常组织中的表达,检测不同非小细胞肺癌细胞系(4株非小细胞肺癌细胞系:A549、SPCA1、H460和H1299;1株支气管上皮细胞系:HBE)中LINC00324基因的表达;构建LINC00324基因的过表达载体,构建LINC00324过表达细胞系;采用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测过表达LINC00324基因后对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。结果 LINC00324在肺癌组织中较癌旁正常组织低表达(P < 0.05);以HBE作为对照,LINC00324在A549和H460细胞系中相对低表达(P < 0.05),在H1299和SPCA1细胞系中相对高表达(P < 0.05);成功构建LINC00324过表达A549和H460细胞系,LINC00324基因在A549和H460过表达细胞系中表达均升高(P < 0.05);CCK-8实验显示,过表达LINC00324基因能够抑制H460和A549肺癌细胞的增殖(P < 0.05);Transwell实验显示,过表达LINC00324基因较空质粒对照组能够显著降低H460和A549肺癌细胞的侵袭和迁移(P < 0.05);流式细胞术检测结果显示,过表达LINC00324基因较空质粒对照组能够显著增加H460和A549肺癌细胞的凋亡(P < 0.05)。结论 长链非编码RNA LINC00324可能通过调节肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,在肺癌的发生、发展中起着重要的抑癌基因作用。
[关键词] 非小细胞肺癌     长链非编码RNA     LINC00324     细胞增殖     细胞迁移     细胞侵袭     细胞凋亡    
Effect of long non-coding RNA LINC00324 on biological functions of non-small cell lung cancer cells
ZHOU Zhengyu1, XIANG Ying1, YUAN Shuai1, WU Long1, WU Na1, XIE Weijia1, XU Bin1, LI Chengying1, ZHANG Yao1, MA Xiangyu1, CAI Tongjian1, YU Zubin2, BAI Li3, LI Yafei1     
1. Department of Epidemiology, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
2. Department of Thoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China;
3. Institute of Respiratory Diseases, Key Laboratory of Respiratory Diseases, Second Affiliated Hospital of Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA LINC00324 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and explore its effect on the biological functions of the tumor cells. Methods qRT- PCR was used to detect the expression of LINC00324 in 65 paired lung cancer tissues and adjacent normal tissues. The expression of LINC00324 was also detected in 4 different non-small cell lung cancer cell lines (A549, SPCA1, H460 and H1299) and human bronchial epithelial cell line HBE by qRT-PCR. The overexpression vector of LINC00324 gene was designed and constructed, and the LINC00324 overexpression cell lines were constructed through transfection. The effects of overexpression of LINC00324 on the proliferation, invasion, migration and apoptosis of NSCLC cells were measured by cell counting kit-8 (CCK-8) assay, Transwell assay, and flow cytometry respectively. Results LINC00324 was down-regulated in the lung cancer tissues than adjacent normal tissues (P < 0.05). The expression of LINC00324 was observed in 4 NSCLC lines and HBE cells. The expression of LINC00324 was lowest in A549 and H460 cells (P < 0.05), and highest in H1299 and SPCA1 cells (P < 0.05). LINC00324 overexpression was successfully constructed in A549 and H460 cells. The expression of LINC00324 gene was increased in both A549 and H460 overexpressed cell lines (P < 0.05). The overexpression of LINC00324 gene inhibited the proliferation (P < 0.05), reduced the invasion and migration (P < 0.05), and promoted apoptosis (P < 0.05) in the H460 and A549 cells, when compared with the cells transfected with blank plasmids. Conclusion Long non-coding RNA LINC00324 may play an important anti-oncogene role in the development and progression of lung cancer by regulating the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of lung cancer cells.
[Key words] non-small cell lung cancer     long non-coding RNA     LINC00324     cell proliferation     cell migration and invasion     cell apoptosis    

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症造成死亡的主要原因之一,其发病率居世界第2位,死亡率居世界第1位[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)为其中的主要类型,约占肺癌类型的85%。长链非编码RNAs (long non-coding RNA,lncRNAs)是人类基因组中一类大于200 nt没有蛋白质编码能力的基因转录本[2-4]。研究表明,大多数lncRNAs可以对靶基因的转录进行调控[5],且lncRNAs参与了多种生物学机制,如细胞增殖、凋亡、迁移、信号传递等,在转录水平和转录后水平上调控基因表达,参与多种疾病(包括肿瘤)的发生、发展[6]。LINC00324是新近发现的一个lncRNA,在不同疾病的发生、发展中发生作用。研究表明,LINC00324的表达量在系统性红斑狼疮患者中明显上调, 可作为诊断和疗效评估辅助指标[7];LINC00324与胃癌[8]和白血病[9]的发生、发展相关。LINC00324(Ensembl:ENSG00000178977)是基因间lncRNA,基因长度为2 115 bp。但是,LINC00324在肺癌发生、发展中的生物学功能及机制仍不清楚。因此,本研究通过构建lncRNA LINC00324过表达的细胞模型,探究其对肺癌细胞增殖、迁移以及侵袭的影响,为lncRNA LINC00324在肺癌中的作用及其分子机制的研究奠定基础。

1 资料与方法 1.1 资料与试剂

1.1.1 临床资料

收集2012年7月至2018年5月陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院胸外科就诊的非小细胞肺癌患者65例。入选标准:①经病理学检查确认为非小细胞肺癌;②手术前未接受放化疗治疗;③患者知情并签署知情同意书。排除标准:①手术前接受过放化疗治疗的患者;②有慢性阻塞性肺病、哮喘、肺结核及其他肺部疾病的患者;③合并其他慢性疾病的患者(糖尿病、冠心病等)。其中男性49例,女性16例,年龄(56.08±8.08)岁,在手术过程中收集患者的肺癌组织及配对的正常肺组织。本研究2017年3月经陆军军医大学(第三军医大学)伦理委员会批准,并获得患者知情同意。

1.1.2 细胞株

人非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、SPCA1、H460)和人支气管上皮细胞(HBE)分别来自中国科学院(上海)细胞库和美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.1.3 试剂

主要有:RPMI1640培养液、Trypsin(HyClone公司, 美国);胎牛血清(Lonsera公司,美国);LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司,美国);DMSO(Sigma公司,美国);细胞培养皿、Transwell小室(Corning公司,美国);Cell Counting Kit-8(Dojindo公司,日本);Matrigel基质胶(BD Biosciences公司,美国);结晶紫染液(碧云天公司,中国);LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素、甘油(上海生工公司,中国);质粒提取试剂盒(Omega公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 LINC00324过表达细胞系的构建

在NCBI中找到长链非编码RNA LINC00324的全长序列,交由上海吉玛公司在pcDNA3.1中构建LINC00324过表达质粒。使用E.coli DH5α感受态细胞进行转化并提取质粒;使用经过验证的LINC00324过表达质粒对非小细胞肺癌细胞系A549和H460进行转染;培养48 h后提取总RNA,使用qRT-PCR方法鉴定LINC00324在两种非小细胞肺癌细胞系内的过表达效果。

1.2.2 细胞的培养及质粒的转染

复苏细胞株,液氮中取出,37 ℃水浴融化,接种在配制的营养培养基中(89% RPMI1640培养基、10%胎牛血清和1%双抗),培养箱中培养(培养箱条件为37 ℃、5% CO2及饱和湿度),期间进行常规换液及传代。取对数生长期的非小细胞肺癌细胞株,用Trypsin消化后,以合适的密度接种于6孔板中。使用LipofectamineTM 2000对pcDNA3.1空质粒(对照组)和pcDNA3.1-LI/C00324过表达质粒(实验组)进行转染。

1.2.3 细胞总RNA的提取

使用TRIzol对细胞总RNA进行提取,将6孔板中的对照组和实验组细胞,使用Trypsin消化后进行离心弃上清,加入PBS重悬后再次离心弃上清。在沉淀中加入750 μL TRIzol裂解细胞提取总RNA,对获得的总RNA采用分光光度仪进行定量,检测纯度及检查总RNA是否存在有机溶剂污染或降解。

1.2.4 LINC00324基因表达量的检测

使用TaKaRa公司的逆转录试剂盒进行逆转录,获得细胞的cDNA。然后把cDNA作为模板进行qRT-PCR检测基因表达量。LINC00324基因上游引物序列为5′-GTGGATGACAGTGTTCGGGA-3′,下游引物序列为5′-ACCGAAAGAGACAGAGTGCC-3′。内参基因β-actin上、下游引物序列及反应体系(使用25 μL体系,反应条件:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环)参考文献[10]报道的方法。lncRNA LINC00324相对表达量计算,使用2-ΔΔCt法进行分析,计算实验组、对照组的ΔCt,然后代入即可计算2-ΔΔCt(ΔCt=Ct靶基因-Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组)。

1.2.5 细胞增殖检测

根据CCK-8说明书进行操作,以合适的密度(第2天细胞汇合度可以达到70%~ 80%)将细胞铺至6孔板,使用LipofectamineTM 2000分别将pcDNA3.1-LINC00324过表达质粒和pcDNA3.1空质粒转染至A549和H460细胞中,孵育培养48 h后收集细胞,按每孔3 000个细胞铺至96孔板(每组3个复孔)。分别在1、2、3、4、5 d时加入CCK-8试剂染色孵育2 h,测定450 nm的光密度值[OD(450)]。实验重复3次。

1.2.6 细胞迁移检测

细胞铺板及转染过程同上,孵育培养48 h后将细胞消化离心,用无血清无双抗的培养液重悬两组细胞,按照5×104个细胞每孔接种于Transwell小室,下室内加入500 μL营养培养基(含10%胎牛血清),继续培养12 h,用湿润的棉签小心刮除小室内膜上细胞,使用100%甲醇进行固定,30 min后缓冲液清洗3次后晾干,染色15 min(0.1%结晶紫染液),缓冲液清洗3次后晾干。显微镜下5个随机视野计数(重复3次)。

1.2.7 细胞侵袭检测

Matrigel基质胶用4 ℃预冷的无血清无双抗培养基进行稀释(1 mg/μL)。在Transwell上室每孔加入100 μL稀释后的基质胶,放置于37 ℃培养箱中孵育1 h。无血清无双抗培养液重悬两组细胞后,按照5×104个细胞每孔接种于Transwell小室,下室内加入500 μL营养培养基(含10%胎牛血清),继续培养24 h,用湿润的棉签刮除小室内膜上细胞,使用100%甲醇进行固定,30 min后缓冲液清洗3次后晾干,染色15 min(0.1%结晶紫染液),缓冲液清洗3次后晾干。显微镜下5个随机视野计数(重复3次)。

1.2.8 细胞凋亡检测

根据细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物)说明书操作,简要如下:将1×105个细胞铺板至6孔板,待细胞汇合度达到70%~80%时,利用LipofectamineTM 2000分别将pcDNA3.1- LINC00324过表达载体和pcDNA3.1空载体转染至细胞中,培养48 h后消化收集,PBS洗涤细胞2次后加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞,加入5 μL Annexin V-APC混匀后,加入5 μL 7-AAD混匀,反应5~15 min (室温避光)。使用流式细胞仪检测,Annexin V-APC通过FL4通道检测;7-AAD通过FL3通道检测。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 LncRNA LINC00324在肺癌组织和癌旁组织中的表达

检测65例配对非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中LINC00324的表达,发现肺癌组织中LINC00324的表达明显低于癌旁正常组织(P < 0.01,图 1)。

a:P < 0.01,与癌旁组织比较 图 1 LINC00324在肺癌和正常肺组织中的表达差异

2.2 LINC00324在肺癌细胞系中的表达

对4株非小细胞肺癌细胞系H1299、SPCA1、A549、H460和人支气管上皮细胞系HBE中LINC00324的相对表达情况进行qRT-PCR检测,结果显示,以HBE作为对照,LINC00324在SPCA1和H1299细胞系中表达相对较高,而在A549和H460细胞系中表达相对较低(图 2),与HBE细胞系比较差异有统计学意义(P < 0.01)。根据上述LINC00324在细胞系中的表达情况,我们选择表达量相对较低的H460、A549细胞系构建过表达细胞模型,研究LINC00324基因在非小细胞肺癌细胞株生物学功能中发挥的作用。

a:P < 0.01,与HBE比较 图 2 LINC00324在非小细胞肺癌细胞系中的表达

2.3 LINC00324过表达细胞模型的构建

我们设计构建pcDNA3.1-LINC00324过表达载体,在实验开始前,先使用HindⅢ/EcoRⅠ对pcDNA3.1- LINC00324质粒载体进行酶切,凝胶电泳验证目的条带的大小符合所需目的基因片段大小(图 3A)。验证过后,将pcDNA3.1-LINC00324转染至H460及A549非小细胞肺癌细胞系,构建完成肺癌细胞过表达模型。使用qRT-PCR技术检测转染后细胞系中的LINC00324表达量表明,转染pcDNA3.1-LINC00324的H460、A549细胞中LINC00324的表达量明显高于pcDNA3.1空质粒对照组,分别为142倍(P < 0.01)与678倍(P < 0.01),证明LINC00324过表达细胞系构建成功(图 3BC)。

1:DNA标准;2:过表达载体;3:空载体;a:P < 0.01,与对照组比较;A:HindⅢ和EcoRⅠ双酶切产物电泳结果; B:质粒转染48 h后qPCR检测H460细胞中LINC00324的表达;C:质粒转染48 h后qPCR检测A549细胞中LINC00324的表达 图 3 LINC00324过表达载体构建及过表达效果鉴定

2.4 LINC00324对细胞增殖的影响

将LINC00324基因过表达后,与空载体对照组相比,在细胞培养2、3、4 d时可以降低非小细胞肺癌细胞A549及H460的增殖能力,差异有统计学意义(P < 0.05,图 4)。

A:A549细胞;B:H460细胞  a:P < 0.05,b:P < 0.01,与对照组比较 图 4 CCK-8检测LINC00324过表达对非小细胞肺癌细胞系A549和H460生长的影响

2.5 LINC00324对细胞迁移的影响

运用Transwell小室,在无基质胶的条件下进行体外透孔试验。结果显示LINC00324过表达实验组比空载体对照组穿过小室细胞的数量明显减少(PA549 < 0.01,PH460 < 0.01)。表明LINC00324基因过表达可以降低非小细胞肺癌细胞的迁移能力(图 5)。

A:Transwell迁移实验检测结果(结晶紫×200);a:P < 0.01, 与对照组比较  B:A549细胞迁移细胞数;C:H460细胞迁移细胞数 图 5 LINC00324过表达对非小细胞肺癌细胞系迁移的影响

2.6 LINC00324对细胞侵袭的影响

我们使用Transwell小室,在有基质胶的条件下进行体外透孔试验。结果显示,LINC00324过表达实验组比较空载体对照组穿过小室细胞的数量明显减少(PA549 < 0.01,PH460 < 0.01)。表明LINC00324基因过表达可以降低非小细胞肺癌细胞的侵袭能力(图 6)。

A:Transwell侵袭实验检测结果(结晶紫×200);a:P < 0.01, 与对照组比较;B:A549细胞侵袭细胞数;C:H460细胞侵袭细胞数 图 6 LINC00324过表达对非小细胞肺癌细胞系侵袭的影响

2.7 LINC00324对细胞凋亡的影响

细胞在转染48 h后使用流式细胞仪进行了细胞凋亡分析,结果显示,LINC00324过表达实验组与空载体对照组相比,细胞凋亡数明显增多(PA549 < 0.01,PH460 < 0.01),提示LINC00324可以促进非小细胞肺癌细胞的凋亡能力(图 7)。

A:流式细胞术检测结果;a:P < 0.01, 与对照组比较;B:A549细胞凋亡比例;C:H460细胞凋亡比例 图 7 LINC00324过表达对非小细胞肺癌细胞系凋亡的影响

3 讨论

自从OKAZAKI等[11]首次在小鼠的DNA转录产物中发现lncRNAs以来,越来越多的研究发现,lncRNAs在疾病的发生、发展中扮演着重要的角色,尤其是癌症的发生、发展更与lncRNAs的调节作用密切相关。目前对于非小细胞肺癌相关的lncRNA的研究主要集中在识别度较高,且与多种肿瘤密切相关的lncRNA,例如MALAT1、H19、HOTAIR等与多种癌症的发生、发展密切相关,包括肺癌、胃癌和肝癌[12-14],因此研究新的与非小细胞肺癌相关的lncRNA,对于非小细胞肺癌的诊断、预后具有重要意义。在本研究中,我们发现LINC00324在肺癌组织中显著下调,低于癌旁正常肺组织。在细胞功能实验中,LINC00324基因能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,并且促进细胞的凋亡。提示LINC00324在肺癌的发生、发展中可能起到抑癌作用。

LncRNAs可以按其基因组位置分为:基因内、基因间、双向、正义和反义lncRNAs。基因间lncRNAs是从2个编码基因间转录产生的。基因间lncRNAs可以参加各级邻近基因的调节[15],例如,lncRNA lncPRESS1为基因间lncRNA,上游和下游基因分别为P53和SIRT6,其主要接受P53的调控进而干扰SIRT6的活性来保护hESC;也可作为转录调节器[16]及通过RNA与RNA之间的相互作用改变mRNA的稳定性[17],例如,LIU等[18]发现lncRNA HOTAIR可能扮演ceRNA的角色,与miR-331-3p结合,从而调节HER2的表达,进而从转录后水平调控胃癌的发生、发展,ZHANG等[19]发现lncRNA HOTAIR可以通过与雄激素受体(AR)直接结合,抑制E3泛素酶MDM2介导的AR降解,从而上调AR表达水平,并以雄激素非依赖的方式激活AR下游基因转录表达,促进前列腺癌细胞的生长和侵袭。UCSC基因组浏览器显示,LINC00324是一种基因间lncRNA,在AURKB以及CTC1基因之间。因此,我们后期希望通过亚细胞定位,确定LINC00324在非小细胞肺癌中的分布情况,进而从这两个方面对LINC00324发挥功能的机制进行深入研究。

近年来,细胞外囊泡的临床应用越来越受到人们的关注。研究发现在细胞外囊泡中,LINC00324是所有lncRNAs中表达量最高之一的基因[20]。LINC00324在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用,且在细胞外囊泡表达量较高,因此,LINC00324可能通过细胞外囊泡排出细胞并且与肺癌的发生、发展密切相关,可能成为肺癌诊断、预后及治疗的新的靶点。

本研究还存在一定的不足,主要运用细胞模型进行了细胞功能试验,未使用动物模型进行体内实验,未对细胞外囊泡中的LINC00324的表达量进行检测,进而探索LINC00324是否能够通过细胞外囊泡排出细胞,也未对LINC00324作用的具体分子机制深入研究,而且LINC00324在肺癌诊断和预后中的临床意义也值得进一步研究。

综上所述,本研究表明LINC00324在非小细胞肺癌中呈低表达,在细胞水平可以抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且促进凋亡,从而作为抑癌基因发挥作用。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201811031
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

周征宇, 向颖, 袁帅, 吴龙, 邬娜, 谢薇佳, 许斌, 李成英, 张耀, 马翔宇, 蔡同建, 余祖滨, 白莉, 李亚斐.
ZHOU Zhengyu, XIANG Ying, YUAN Shuai, WU Long, WU Na, XIE Weijia, XU Bin, LI Chengying, ZHANG Yao, MA Xiangyu, CAI Tongjian, YU Zubin, BAI Li, LI Yafei.
长链非编码RNA LINC00324对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响
Effect of long non-coding RNA LINC00324 on biological functions of non-small cell lung cancer cells
第三军医大学学报, 2019, 41(4): 331-338
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(4): 331-338
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201811031

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收稿: 2018-11-06
修回: 2018-12-05

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