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降钙素原时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立及性能评价
黄德智, 应昊俊, 刘飞, 蒲晓允     
400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院检验科
[摘要] 目的 建立一种时间分辨荧光免疫层析定量降钙素原(procalcitonin, PCT)的检测方法并评价其性能。方法 利用双抗体夹心法原理,以时间分辨荧光的纳米微球作为标记示踪物,运用免疫层析技术建立PCT免疫检测方法,并对该方法进行线性、灵敏度、精密度、特异性、相关性等性能指标的测定。结果 本检测方法线性良好,线性范围为0.05~100 ng/mL,方程为Y=0.074 7X+0.524 6,R2=0.990 4,灵敏度为0.03 ng/mL,批内精密度CV≤5.42%,批间精密度CV≤6.86%,与AE-180全自动化学发光免疫分析仪结果一致性较好,阳性符合率96.61%,阴性符合率94.44%,假阳性率5.56%,假阴性率3.39%和诊断符合率95.53%。结论 本研究建立了PCT时间分辨免疫层析检测方法,该方法简便、经济、快速、并可以定量,各项性能参数均达到临床检测要求,可用于临床血清PCT浓度的检测。
[关键词] 降钙素原     时间分辨荧光微球     免疫层析    
Evaluation of a time-resolved fluorescence immunochromatography for procalcitonin
HUANG Dezhi, YING Haojun, LIU Fei, PU Xiaoyun     
Department of Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
[Abstract] Objective To evaluate the performance of a time-resolved fluorescence immunochromatographic assay for quantitative detection of procalcitonin (PCT). Methods Based on double antibody sandwich method and using time-resolved fluorescent nano-microspheres as the marker, we established an immunochromatographic assay for detecting PCT. We evaluated the performance of this method for PCT detection in terms of linearity, sensitivity, precision, specificity, and correlation. Results This immunochromatographic assay had a good linearity for PCT detection within the linear range of 0.05-100 ng/mL, and the linear equation was Y=0.074 7X+0.524 6 (R2=0.990 4). The sensitivity of this method was 0.03 ng/mL with an inter-assay precision CV≤5.42% and an intra-assay precision CV≤6.86%. The detection results by this method were well correlated with those by AE-180 automatic chemiluminescence immunoanalyzer and showed a positive coincidence rate of 96.61% and a negative coincidence rate of 94.44%; The false positive rate, false negative rate and diagnostic coincidence rate of this assay were 5.56%, 3.39%, and 95.53%, respectively. Conclusion This time-resolved immunochromatographic assay allows simple, economic, rapid and quantifiable detection of PCT and shows a good performance for potential application in the detection for clinical serum samples.
[Key words] procalcitonin     time-resolved fluorescent microspheres     immunochromatography    

降钙素原(procalcitonin,PCT)是一种由甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)产生的糖蛋白,由116个氨基酸组成,相对分子质量为13×103,是降钙素的前体[1-3]。1993年,自从PCT第一次在脓毒血症和感染患者的血浆中检测到,其在感染中作为炎症标志物的地位已毋庸置疑[4-6]。PCT与感染和脓毒症的相关性很好,经过近20年的研究和实践,已经被推荐用于细菌感染性脓毒症的诊断、分层、治疗监测和预后评估[7]

市面上较常用的方法有酶联免疫吸附法、化学发光法、免疫层析法等。但酶联免疫吸附法操作繁琐;化学发光法需要大型仪器设备,成本高,不利于基层医院推广[8-9];免疫层析法中有胶体金[10]、上转换发光[11]、荧光胶乳微球[12-13]、Eu荧光微球[14]等均作为标记物被制作成试纸条检测PCT,但其线性范围较窄,线性范围最高为51.4 ng/mL;量子点[15-16]也被用于制作试纸条检测PCT,其灵敏度和线性均较好,但量子点在生物环境中的化学性质和胶体不稳定性可能导致定量分析不准确[17]。而时间分辨免疫层析以铕(Eu)荧光微球为标记物,与传统荧光标记物相比,其有独特的荧光特性:荧光寿命长、stokes位移大、激发光谱和发射光谱无交叉、特征峰非常尖锐、标记物体积小、灵敏度高、可定量,解决了普通荧光分析中材料和样品中的非特异荧光而产生的高背景问题[18]

本研究拟以Eu荧光微球为标记物建立一种快速、简便、灵敏、经济、宽线性范围的双T线式试纸条,以满足门急诊和基层医院的需求。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

PCT重组抗原、PCT配对抗体(PCT-MJG03和PCT-MJG05)、鸡IgY和羊抗鸡IgY购自杭州启泰生物技术有限公司;200 nm Eu时间分辨荧光微球购自美国Bangs lab;硝酸纤维素膜(NC)购自德国Sartorius公司;PVC板、玻璃纤维膜和吸水纸等购自上海飞测生物科技有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自日本TCI;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海国药;其余化学试剂均为Sigma或国产分析纯。临床血清样本来自陆军军医大学第二附属医院,均由AE-180全自动化学发光免疫分析仪测定(苏州长光华医生物医学工程有限公司)检测。

1.2 PCT标准品

把PCT重组抗原用样本稀释液稀释,得到浓度为0.05、0.5、2、5、10、20、50、100 ng/mL的标准液。

1.3 制备与检测方法

1.3.1 Eu荧光微球与抗体标记

Eu荧光微球通过EDC和NHS活化后,分别与PCT-MJG03和IgY偶联,最后500 μL偶联储存液复溶,超声分散,得到Eu-MJG03和Eu-鸡IgY,4 ℃保存备用。

1.3.2 PCT试纸条制备

样品垫和结合垫分别在样品垫预处理液(50 mmol/L硼酸缓冲液,1%Triton X-100,1%PVP,2%NaCl,pH9.0)和结合垫预处理液(2 mmol/L硼酸缓冲液,0.1%PEG 20000,0.2%酪蛋白,0.1%BSA,0.1%Tween-20,pH 9.0)中分别浸泡0.5 h,37 ℃干燥箱中干燥4 h备用;NC膜贴在PVC板上,在NC膜上分别包被羊抗鸡IgY(1 mg/mL)和PCT-MJG05作为C线和T1、T2线,划膜量为1 μL/cm,37 ℃干燥箱中干燥6 h;在结合垫上喷上被喷膜稀释液稀释的Eu-鸡IgY和Eu-MJG03,Eu-鸡IgY为150倍稀释,喷膜量为5 μL/cm,37 ℃干燥箱中干燥6 h;在30%湿度环境下依次把结合垫、样品垫和吸水纸贴上PVC板,切成4 mm宽的试纸条,装入塑料卡壳中,铝箔袋密封室温保存备用。

1.3.3 试纸条检测

把试纸条从铝箔袋中取出,加入100 μL样本或标准品,放置一定时间后,把板条插入荧光检测仪中检测,微球被365 nm的激发光照射发出610 nm的发射光,根据发射光强度得到(T1+T2)/C(简化为T/C)的比值,再根据芯片内置的标准曲线,以此计算得到PCT的浓度。

1.4 试纸条优化

1.4.1 T线划膜浓度的优化

计划A:双T线浓度分别为1 mg/mL和0.5 mg/mL;计划B:双T线浓度分别为1 mg/mL和1 mg/mL;计划C:双T线浓度分别为1 mg/mL和1.5 mg/mL;计划D:单T线浓度为2 mg/mL。以此确定合适的包被浓度。

1.4.2 结合垫喷膜浓度的优化

对Eu-MJG03分别进行3、4和5倍稀释,以此确定合适的喷膜浓度。

1.4.3 检测时间的选取

选取PCT浓度为0.5、5和20 ng/mL的标准液分别在5、8、10、12、15、18、20、22和25 min对试纸条进行检测,以此确定合适的检测时间。

1.5 试纸条性能评估

1.5.1 线性和灵敏度

用浓度为0.05、0.5、2、5、10、20、50、100 ng/mL的标准液进行检测,计算得到直线方程Y=aX+b及线性相关系数R。根据冯仁丰[19]编著的《临床检验质量管理技术基础》,把空白样本和0.05 ng/mL的标准液各测试10次,计算得到灵敏度。

1.5.2 精密度

选取浓度为0.5、5和20 ng/mL 3个包含低、中、高浓度水平的PCT标准液进行批内和批间精密度测定。批内精密度为一个批次的试纸条1 d内检测完成,3个浓度水平的标准液各做5次重复测试。批间精密度为取3个批次的试纸条,3个浓度水平的标准液各做5次重复测试。计算其平均值、标准差和变异系数。批内精密度要求 < 10%,批间精密度要求 < 15%。

1.5.3 特异性

选取CRP、IL-6、IL-8、RF和TNF-α阳性而PCT阴性的标本测试。

1.5.4 回收率

准确度以回收实验来评估。把临床检测为26.74 ng/mL的标本分别进行1/2、1/4和1/8稀释,然后计算其实际浓度,实际浓度除以理论值浓度得到回收率。

1.5.5 比对试验

选取各浓度水平的PCT标本做临床比对,血清样本由陆军军医大学第二附属医院提供,共95份血清标本,血清标本均由AE-180全自动化学发光免疫分析仪测定。40 μL血清与40 μL样本稀释液混匀后加到加样孔。以参比结果为准,以0.25 ng/mL为临界值(cut-off值),计算出本方案的阳性符合率、阴性符合率、假阳性率、假阴性率和诊断符合率。率的比较通过χ2检验,P < 0.05有统计学差异,通过Kappa一致性分析得出两种方法一致性,K值大于0.75为一致性较好,在0.40~0.75之间一致性一般,小于0.4为一致性较差。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 25.0统计软件进行分析。相关分析采用Pearson线性相关分析法。用ROC分析法分析诊断效能,以约登指数确定cut-off值,在cut-off值下计算诊断符合率。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 工艺条件的优化

2.1.1 最适捕获抗体包被浓度

本方案采取的是双T线,由图 1可以看出,T1和T2划膜浓度分别为1和0.5 mg/mL、1和1 mg/mL、1和1.5 mg/mL时,1和1 mg/mL的T/C梯度差和线性最好,然后再和单T线划膜浓度为2 mg/mL的方案比较,仍是1和1 mg/mL的双T线更优。

图 1 PCT-MJG05包被浓度与T/C

2.1.2 最适Eu-MJG03的喷膜浓度

图 2所示,在4倍稀释时梯度差异和线性最好。

图 2 Eu-MJG03稀释倍数与T/C

2.1.3 最佳检测时间

图 3所示,0.5 ng/mL和5 ng/mL的T/C在10 min时就已较为稳定,而20 ng/mL的T/C在15 min时才较为稳定,综合快速准确的原则,故本实验检测时间采取15 min。

图 3 检测时间与T/C

2.2 性能评估

2.2.1 灵敏度与线性

结果显示在0.05~100 ng/mL范围内线性较好,见图 4,直线方程Y=0.074 7X+0.524 6及线性相关系数R2=0.990 4。空白样本和0.05 ng/mL的标准液各测试10次,空白样本T/C均值0.170,SD为0.017,0.05 ng/mL的标准液T/C平均值0.251,计算得到灵敏度为0.03 ng/mL。

图 4 PCT试纸条标准曲线

2.2.2 精密度

精密度分析结果见表 1,批内精密度CV≤5.42%,批间精密度CV≤6.86%。

表 1 PCT试纸条精密度分析
批次 标准品浓度(ng/mL) 检测次数 均值(ng/mL) SD CV%
第1批 0.5 5 0.48 0.02 4.37
5.0 5 4.95 0.07 1.39
20.0 5 19.23 0.93 4.85
第2批 0.5 5 0.54 0.02 3.26
5.0 5 5.09 0.09 1.76
20.0 5 21.27 1.15 5.42
批间 0.5 5 0.51 0.03 6.22
5.0 5 5.02 0.10 2.00
20.0 5 20.25 1.39 6.86

2.2.3 特异性

PCT浓度小于0.03 ng/mL,证明与CRP、IL-6、IL-8、RF和TNF-α均无交叉反应,特异性良好,见表 2

表 2 PCT试纸条特异性测试
样本 浓度 PCT浓度/ng·mL-1
CRP 118 mg/L < 0.03
IL-6 200 pg/mL < 0.03
IL-8 1 860 pg/mL < 0.03
TNF-α 12.8 pg/mL < 0.03
RA 248 IU/mL < 0.03

2.2.4 回收率

表 3所示,该方法的回收率达95%~101%。

表 3 PCT试纸条回收率实验
样本稀释倍数 理论值
/ng·mL-1
实测值
(x±s)/ng·mL-1
回收率
(%)
1:02 13.37 13.52±0.17 101
1:04 6.69 6.68±0.03 100
1:08 3.34 3.18±0.04 95

2.2.5 与临床标本比对

两种方法各浓度区间结果一致性例数见表 4,在cut-off值取0.25 ng/mL时PCT试纸条诊断效能如下:阳性符合率96.61%,阴性符合率94.44%,假阳性率5.56%,假阴性率3.39%,诊断符合率95.53%。本方案荧光试纸条和AE-180全自动化学发光免疫分析仪结果相关性较好(P < 0.05),K值为0.91。

表 4 两种方法各浓度区间结果一致性例数
AE180
/ng·mL-1
PCT试纸条/ng·mL-1
< 0.25 0.25~0.5 >0.5~2 >2~10 >10
< 0.25 34 2 0 0 0
0.25~0.5 2 5 0 0 0
>0.5~2 2 0 6 0 0
>2~10 0 0 0 16 2
>10 0 0 0 0 22

3 讨论

PCT是一种优秀的炎症反应检测指标。PCT < 0.05 ng/mL为健康人群;>0.05~0.5 ng/mL为无或轻度全身炎症反应;>0.5~2 ng/mL为中度全身感染;>2~ 10 ng/mL很可能为脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克;PCT>10 ng/mL几乎均为严重细菌性脓毒症或脓毒性休克[7]。所以对PCT检测要求高灵敏度、宽的线性和准确性。

目前市售PCT检测试剂盒均有其不足之处。美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP9-A2文件要求,以Roche-e601全自动电化学发光免疫分析检测系统作为参考方法,灵敏度高,特异性好,定量检测,但其需要大型仪器设备,成本较高,检测时间较长;酶联免疫吸附法操作繁杂,反应时间长,操作人员专业要求高;放免法灵敏度高,但其操作复杂,耗时长,有放射性污染,在临床上已少用。免疫层析技术(immunochrom-atography assay,ICA)是20世纪60年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,具有定量、快速、简便、经济等特点[20-21]

本实验用双抗体夹心法,以Eu时间分辨微球为标记物,分别标记鸡IgY和PCT-MJG03,形成Eu-鸡IgY和Eu-MJG03,把其按一定比例混合后喷到结合垫上;然后在NC膜上分别包被羊抗鸡IgY和PCT-MJG05作为控制线(C线)和双检测线(T1、T2线)。把样本加到样品垫上后,样品中的PCT层析至结合垫,抗原抗体发生免疫反应,形成荧光Eu-MJG03-PCT复合物,继续层析,被T1和T2线上的MJG05捕获,形成Eu-MJG03-PCT-MJG05复合物,荧光微球被固定,在激发光照射下,固定了的Eu微球发出荧光,得到荧光强度T1和T2,它们之和为T; 无论样品中有无抗原,检测线上的羊抗鸡IgY均能捕获固定量的Eu-鸡IgY,形成Eu-鸡IgY-羊抗鸡IgY复合物,在激发光照射下,固定了的Eu微球发出荧光,得到荧光强度C。样品中抗原与T线荧光值和C线荧光值的比值(T/C)呈正相关,根据T/C在标准曲线上找到对应的PCT浓度值。

本实验研制的双T线PCT试纸条,通过两条T线以抓住更多的抗原,进而T线上有更多的荧光微球和更高的荧光强度,T/C更大,使得线性范围更宽,在0.05~100 ng/mL线性关系良好,线性方程Y=0.074 7X+ 0.524 6,R2=0.990 4;由于时间分辨纳米微球是由纳米微球包裹上万个的Eu3+组成的,其本身有着很强的荧光[22-23],通过365 nm的激发光照射发射610 nm的发射光,达到了很高的灵敏度,最低检测限为0.03 ng/mL,比胶体金[10]、上转换发光[11]、荧光胶乳微球[12-13]有着更高的灵敏度和更宽的线性范围,更适合于临床的使用;精密度良好,批内精密度CV≤5.42%,批间精密度CV≤6.86%;特异性良好,CRP为118 mg/L、IL-6为200 pg/mL、IL-8为1 860 pg/mL、TNF-α为12.8 pg/mL和RA为248 IU/mL时,PCT均 < 0.03 ng/mL;与AE180相关性良好,阳性符合率96.61%,阴性符合率94.44%,假阳性率5.56%,假阴性率3.39%和诊断符合率95.53%。表 4中显示通过AE180检测在0.25~0.5 ng/mL和0.5~2 ng/mL的标本通过本方法检测分别有2例均测出在0~0.25 ng/mL的区间,这是由于PCT值不高,测试出现了偶然误差,得到了假阴性的结果,而在中高值范围时全都符合;与酶联免疫吸附法和化学发光法比,检测快速,操作更为简便,15 min便可出结果;检测仪器小型简单,成本低,标本用量少,仅需40 μL,利于门急诊和基层医院推广使用。本实验建立的双T线PCT时间分辨免疫层析试纸条配合上海飞测便携式荧光检测仪,可以定量、快速、简便、经济、准确检测PCT。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201810210
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

黄德智, 应昊俊, 刘飞, 蒲晓允.
HUANG Dezhi, YING Haojun, LIU Fei, PU Xiaoyun.
降钙素原时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立及性能评价
Evaluation of a time-resolved fluorescence immunochromatography for procalcitonin
第三军医大学学报, 2019, 41(6): 581-586
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(6): 581-586
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201810210

文章历史

收稿: 2018-10-30
修回: 2019-01-10

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