大脑的炎症反应是围术期脑外伤、脑缺血再灌注损伤、脑出血等多种脑部疾患所经历的一个共同的病理生理过程[1-3]。小胶质细胞的激活在大脑的炎症反应中起着关键作用，激活的小胶质细胞产生并释放大量的炎症细胞因子从而加重脑损伤[4]。因此，关于小胶质细胞炎症因子产生和调控机制的研究十分重要。而炎症因子的产生受到细胞内多种基因与蛋白的表达调控，其具体的机制目前仍不清楚。
我们前期研究通过质谱鉴定的方法从缺血性心脏病患者灌流液中发现了LOC339524蛋白，在缺血再灌注损伤后其高表达于心肌细胞[5]，生物信息学预测显示它的138~236位氨基酸为脯氨酸富集区[6]，此前研究证实脯氨酸富集区的蛋白质具有调节炎症的作用[7]，且基于课题组前期实验发现，LOC339524在缺血再灌注后脑组织表达也显著增加；因此我们猜测LOC339524蛋白可能是一种炎症应答因子，它有可能参与小胶质细胞炎症反应的调控。
为验证上述假设，我们选择小鼠小胶质细胞系bv2细胞作为研究对象，利用LPS刺激建立炎症反应模型，研究LOC339524基因在小胶质细胞炎症反应中所起的调控作用，从而为阐明小胶质细胞炎症反应机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试剂与器材脂多糖购自Sigma公司, DMEM/High Glucose培养基、胎牛血清购自HyClone公司，0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司，RIPA细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒、化学发光液(ECL)、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)均购自上海碧云天公司，聚偏二氟乙烯(PVDF膜)购自Millipore公司，Lipofectamine3000、TRIzol购自Invitrogen公司，siRNA和NControl片段由广州锐博合成，引物由上海生工合成，逆转录试剂盒和SBRY GReen Ex Taq mixture试剂盒购自TaKaRa公司，电泳仪与湿转仪购自Bio-Rad公司，超灵敏凝胶成像系统购自GE公司, 实时荧光定量PCR仪购自新加坡ABI公司。GAPDH、TNF-α、IL-6一抗及HRP标记羊抗兔和抗鼠二抗购自Proteintech公司。LOC339524蛋白抗体5D3实验室自备，专利号：ZL201310078163.7[8]。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与LPS处理bv2细胞接种于含DMEM/High Glucose和10%胎牛血清、100 /mL的青霉素与链霉素的培养瓶中，置于潮湿的恒温培养箱中培养。细胞长满时用0.25%胰酶消化后，显微镜下计数，按1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，待细胞汇合度达80%左右，根据实验分组利用不同浓度LPS刺激细胞及最佳浓度的LPS处理不同时间。
1.2.2 siRNA沉默LOC339524基因表达由广州锐博合成3条siRNA干扰片段，筛选出干扰效果最佳的1号干扰片段，靶序列为GCAAGTCCATCTCATCGCT。按5×104个/孔的细胞密度接种于6孔板，待其汇合度达30%左右时，将细胞分为3组，空白对照组不加任何试剂处理，无关片段组和SiRNA组参照Lipofectamine3000操作步骤分别配成Ncontrol和siRNA混合溶剂，以100 nmol/L的终浓度瞬时转染细胞，48 h后提取RNA与蛋白质，分别用qPCR和Western blot检测。
1.2.3 慢病毒转染构建过表达LOC339524的细胞株接种293T细胞至25 mL培养瓶中，待细胞长到培养瓶80%密度时，参照Lipofectamine3000操作步骤用无血清培养基配成5 μg(PMD2G :PSPAX2 :LOC=2 :3 :4)质粒和脂质体混合溶剂，静置10 min后，转染到293T细胞中，更换为无血清培养基培养，培养6 h后，换含1% FBS培养基培养3 d，将上清经0.45 μm一次性过滤器过滤后-80 ℃冰箱保存备用。培养bv2细胞，以2×105个/孔的细胞密度接种至6孔板，放培养箱中培养。12 h后置显微镜下观察，细胞状态良好。实验分组为：正常组、过表达组。正常组细胞换成1.5 mL DMEM/高糖培养基培养，过表达组换成1 mL DMEM高糖培养基同时加入500 μL含LOC病毒上清，置培养箱培养。2 d后，将细胞中培养基吸掉，加入2 mL DMEM/HG培养基，并加入Blasticidin(Blasticidin终浓度为5 μg/mL)，轻轻混匀后，放入培养箱中培养，2 d后换液同时继续加药刺激，直到正常组细胞全部死亡。然后将存活细胞扩大培养，提取基因和蛋白后检测转染效率。
1.2.4 Western blot检测预冷的PBS清洗细胞2遍后加入RIPA裂解液和PMSF(100 :1)冰上裂解10 min。收集裂解液于EP管中，4 ℃, 13 000 r/min离心15 min后取上清。BCA法测蛋白浓度，40 μg蛋白上样电泳。将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，按GAPDH(1 :5 000), TNF-α(1 :2 000)，IL-6(1 :2 000), LOC339524(1 :400)，4 ℃过夜孵育一抗，0.1% TBST洗膜3次，15 min/次后，室温下孵育HRP标记的二抗，0.1% TBST洗膜3次，每次10 min后，加入化学发光剂进行显影。ImageJ软件对条带进行灰度值分析，计算各蛋白质的相对表达量。
1.2.5 RNA提取逆转录和qPCR检测按照RNA提取步骤，6孔板中每孔加入1 mL TRIzol提取总RNA。测得浓度后，取1 μg总RNA按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书逆转为cDNA。生工合成引物，β-actin正向引物为5′-CGATGGGTTGTACCTTGTCTAC-3′反向引物5′-GCAGAGAGGAGGTTGACTTTC-3′，TNF-α正向引物5′-CGATGGGTTGTACCTTGTCTAC-3′反向引物5′-GCAGAGAGGAGGTTGACTTTC- 3′, IL-6正向引物5′-CTTCCATCCAGTTGCCTTCT-3′反向引物5′-CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG-3′, LOC339524正向引物5′-CTTCCATCCAGTTGCCTTCT-3′反向引物5′-CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG-3′。实时PCR用SYBR-Green qPCR配成20 μL反应体系，按95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s进行扩增40个循环。以β-actin为内参，根据2-ΔΔCt计算各基因的相对表达量。
1.3 统计学分析用SPSS 13.0统计软件进行分析。两组间的比较采用t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析。独立样本的结果以x±s表示。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 LPS刺激诱导bv2细胞上调表达炎症细胞因子100 ng/mL LPS处理bv2细胞不同时间后，TNF-α表达增加，3 h达到高峰，而后维持较高水平(P < 0.05，图 1A、B)。IL-6表达随刺激时间增加而增加，12 h时达到高峰(P < 0.05, 图 1C、D)，故选择12 h作为后续炎症反应研究的时间点。
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| a：P < 0.05，与0 h比较 A、C：qPCR检测TNF-α和IL-6 mRNA水平 1: 0 h; 2: 3 h; 3: 6 h; 4: 9 h; 5: 12 h; B、D：Western blot检测TNF-α和IL-6蛋白水平 图 1 LPS诱导bv2细胞上调表达炎症细胞因子(n=3, x±s) |
2.2 LPS刺激诱导bv2细胞表达LOC339524蛋白增加
利用不同浓度的LPS 10、100、1 000、10 000 ng/mL处理bv2细胞后，LOC339524蛋白表达增加(P < 0.05, 图 2A、B); 采用100 ng/mL LPS刺激时，LOC339524蛋白表达随刺激时间增加而表达增加(P < 0.05, 图 2C、D)。
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| A：Western blot检测不同LPS浓度LOC339524蛋白水平；B：半定量分析不同浓度蛋白水平 a: P < 0.05，与0 ng/mL比较; C：Western blot检测100 ng/mL LPS处理不同时间LOC339524蛋白水平；D：半定量分析不同时间蛋白水平 a: P < 0.05，与0 h比较 图 2 LPS诱导bv2细胞表达LOC339524蛋白(n=3, x±s) |
2.3 siRNA瞬时转染bv2细胞48 h有效下调LOC339524的表达
因LPS刺激能上调表达LOC339524蛋白，为研究LOC339524蛋白在炎症反应中的作用，故选择沉默LOC339524基因，沉默48 h时LOC339524 mRNA和蛋白水平较空白对照组和无关片段组显著下调(P < 0.05, 图 3A、B)。故选择48 h作为siRNA沉默bv2细胞LOC339524的最佳时间点。
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| 1:空白对照组；2：无关片段组；3：SiRNA组 A：qPCR检测LOC339524 mRNA水平；B：Western blot检测LOC339524蛋白水平组 a: P < 0.05，与空白对照组和无关片段组比较 图 3 siRNA有效下调bv2细胞LOC339524表达(n=3, x±s) |
2.4 使bv2细胞LOC339524下调表达可增加LPS刺激引起的炎症因子TNF-α和IL-6表达
siRNA组较无关片段组LOC339524蛋白表达下降(P < 0.05，4A、B)，说明siRNA有效沉默了LOC339524基因。在LPS处理12 h后，无关片段组TNF-α和IL-6表达增加(P < 0.05)，说明LPS刺激诱导产生炎症反应，而siRNA组较无关片段组TNF-α和IL-6表达较无关片段组明显增加(P < 0.05，图 4C~F)，这就说明下调表达LOC339524促进了炎症因子的表达。因此，LOC339524基因可能介导了LPS诱导的炎症反应，LOC339524在其中发挥着抑制作用。
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| A、B：Western blot检测LOC339524蛋白表达水平；C、E: qPCR检测TNF-α和IL-6 mRNA水平；D、F：Western blot检测TNF-α和IL-6蛋白水平 1：无关片段组；2：si-RNA组；3：无关片段+LPS 12 h处理组；4：siRNA+LPS 12 h处理组；a: P < 0.05, 与无关片段组比较；b：P < 0.05，与无关片段+LPS 12h处理组比较 图 4 下调LOC339524表达增加LPS诱导的炎症因子表达(n=3, x±s) |
2.5 过表达细胞株的构建及鉴定
慢病毒转染构建过表达LOC339524的细胞株，对照为空病毒载体细胞株，qPCR和Western blot检测LOC339524表达水平(P < 0.05, 图 5A、B)。结果显示，过表达细胞株构建成功。
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| 1：正常组；2：过表达组；A：qPCR检测LOC339524 mRNA水平；B：Western blot检测LOC339524蛋白水平 a: P < 0.05, 与正常组比较 图 5 LOC339524过表达细胞株构建成功(n=3, x±s) |
2.6 过表达LOC339524能下调LPS刺激诱导bv2细胞炎症因子TNF-α和IL-6的表达
过表达组较正常组LOC339524蛋白表达增加(P < 0.05，图 6A、B)，说明LOC339524过表达细胞株稳定高表达LOC339524蛋白。在LPS处理12 h后，正常组TNF-α和IL-6表达增加(P < 0.05)，说明LPS刺激诱导产生炎症反应，而过表达组TNF-α和IL-6的表达较正常组显著降低(P < 0.05，图 6C~F), 这就说明上调表达LOC339524可以减少炎症因子的表达。
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| A、B：Western blot检测LOC339524蛋白水平；C、E: qPCR检测TNF-α和IL-6 mRNA水平；D、F：Western blot检测TNF-α和IL-6蛋白水平 1：正常组；2：过表达组；3：正常+LPS 12 h处理组；4:过表达+LPS 12 h处理组；a: P < 0.05, 与正常组比较；b：P < 0.05，与过表达+LPS 12 h处理组比较 图 6 过表达LOC339524下调炎症因子的表达(n=3, x±s) |
3 讨论
本研究中以小鼠小胶质bv2细胞系为研究对象，利用LPS刺激建立炎症反应模型，发现LPS可诱导LOC339524蛋白表达增加，为研究LOC339524在炎症反应中的调控作用，我们通过siRNA片段有效沉默LOC339524，加入LPS处理后siRNA组较NControl组炎症因子表达明显增加，反之，通过慢病毒方式转染bv2细胞成功构建LOC339524载体，加入LPS处理后过表达组较空载组炎症因子表达下降。为此，说明LOC339524是一种炎症应答因子，介导了脂多糖诱导的bv2细胞的炎症反应。
小胶质细胞激活后释放的炎症细胞因子，如TNF-α具有诱导神经元的凋亡、坏死[9]，破坏血脑屏障的作用[10]，IL-6可导致患者术后认知功能障碍[11]，常被用来预测患者的预后[12]。因它们的表达具有时效性，为选择一个合适的炎症反应时间点，本研究中我们利用100 ng/mL LPS刺激bv2细胞3 h后，TNF-α表达达到高峰，随后下降，但仍维持于较高水平，结果与白玉娟等[13]的研究一致。IL-6的表达随刺激时间增加而增加，在12 h时达到高峰，与李乔俊等[14]的研究结果一致。两者的表达在12 h一致，为此，我们选择LPS处理bv2细胞12 h进行后续研究。
LOC339524蛋白是最先在心肌灌流液中发现并通过质谱鉴定得到的一个29×103大小的蛋白质[5]，前期我们已通过免疫组化技术对32种人体组织进行了染色，发现其在大部分细胞组织中均有表达，包括大脑的小胶质细胞，且主要表达于细胞核中，说明它是一种可由胞内分泌到胞外的蛋白质。本实验中，我们利用LPS诱导bv2细胞产生炎症反应，发现LOC339524蛋白表达增加，说明LOC339524是一种炎症应答因子，通过siRNA片段沉默LOC339524基因，加入LPS处理后，siRNA组LOC339524蛋白较无关片段组表达下调，炎症因子表达增加，说明LOC339524发挥了抑制炎症反应的作用，随后，我们通过慢病毒转染方式构建LOC339524过表达细胞株，加入LPS处理后，过表达组较正常组LOC339524表达上调，炎症因子表达下降，进一步说明LOC339524在炎症反应中发挥了抑制炎症反应的作用。关于LOC339524蛋白调节炎症反应的作用，可能与其具有脯氨酸富集区功能域有关，先前DANIELS等[15]的研究证实肺炎球菌蛋白表面蛋白A和C的抗炎作用与其含有脯氨酸富集区域有关，更早的研究也表明脯氨酸富集区的蛋白质具有抗菌[16]，保护炎症损伤的作用。但是否有关还有待进一步证实。
本研究存在许多不足与缺陷：一是该实验未能阐明LPS诱导LOC339524表达增加的机制原理。这将需要借助于免疫组化或免疫荧光等多种技术对LOC339524基因与蛋白在细胞中的定位及其活化后的变化进行探索，以便掌握其对LPS应答后的变化规律。二是LOC339524激活后如何调控炎症因子表达尚未进行深入研究。因此，对于LOC339524基因介导炎症反应的机制还不清楚。三是此研究仅局限于细胞层面，缺少动物和人体临床试验，没有体现出过多的临床研究价值。这些将是下一步亟待解决的问题。
但LOC339524抑炎作用的发现，为我们围术期炎性脑损伤的防治提供了新的思路与方向。LOC339524将成为研究麻醉药物脑保护作用机制的新靶点，并且随着研究的深入，它的功能与作用机制将被一一揭示，这将为我们更好地做好围术期脑保护奠定基础。
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