2. 400016 重庆，重庆医科大学：基础医学院组织与胚胎教研室，干细胞与组织工程研究室;
3. 404120 重庆，三峡医药高等专科学校
2. Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Department of Histology and Embryology, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
3. Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing, 404120, China
吴茱萸碱(evodiamine, EVO)提取自吴茱萸，具有多种生物活性，例如扩张血管、抗炎、抗肿瘤等[1-3]。作为世界上发病率第三高的恶性肿瘤，结肠癌(colorectal cancer, CRC)每年会导致超过600 000人死亡[4-5]。有研究显示EVO可以显著诱导结肠癌肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，然而其对于结肠癌肿瘤细胞的迁移以及侵袭的抑制机制仍不明确[6]。NF-κB家族包括：p65 (RelaA), RelB, c-Rel, p105/p50 (NF-κB1)以及p100/52 (NF-κB2)。作为一种核转录因子，调控着肿瘤的发生、增殖、分化、迁移、侵袭等[7-9]。NF-κB的转录活性受到细胞定位、磷酸化、乙酰化的调节[10-11]。因此本研究旨在对EVO抑制结肠癌SW480细胞迁移和侵袭的机制进行初步探讨。
1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器细胞株：人结肠癌上皮细胞SW480由重庆医科大学附属第一医院馈赠。药品、试剂：EVO购自美国Selleck公司(货号：S2382)；LPS和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司(货号：L2630, V90090)；胎牛血清购自乌拉圭Lonsera公司(货号：S711-001S)；高糖培养基DEME购自美国赛默飞世尔公司；蛋白浓度测定试剂盒、凝胶配制试剂盒、青链霉素购自中国碧云天公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购于日本DOJINDO公司；Matrigel胶和Transwell小室(直径6.5 mm，孔径8.0 μm)均购于Corning公司；一抗抗体IκBα、p-IκBα、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、β-actin购自美国Santa Cruz公司，MMP-9、MMP-13购自上海生工公司，MMP-2购自万类公司，二抗抗体购自Cell Signaling Technology公司，荧光二抗抗体购自Abbkine公司。主要仪器：低温高速离心机(平凡仪器，TGL-185)；SDS-PAGE电泳仪：Bio-Rad(Power Pactm Basic)；荧光显微镜：Leica(DMi8)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与收集SW480细胞复苏后，用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DEME培养基混匀细胞，在37 ℃、5%CO2条件下培养。EVO使用二甲基亚砜溶解为10 mmol/L的原液进行实验，二甲基亚砜的使用浓度小于0.1%。
1.2.2 CCK-8法检测细胞活性当细胞生长至对数期后，分别加入0、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μmol/L的EVO培养24、48、72 h，在波长450 nm处测定光密度值[D(450)]。再根据公式计算细胞增殖率。
细胞增殖率=加药组D(450)值/对照组D(450)值×100%。
1.2.3 划痕实验将SW480细胞用胰蛋白酶消化重悬后，调整细胞数至5×106/L，接种于6孔细胞培养板，直至细胞长成单层后，用灭菌的10 μL枪头在细胞中划出笔直的划痕，用PBS冲去悬浮的细胞，用显微镜拍照。按实验设计分别加入含有不同浓度的EVO的培养基，培养24 h后，显微镜下拍照。
1.2.4 细胞侵袭实验预先将Matrigel用无血清的DEME培养基按1 :8的比例稀释，取80 μL稀释液铺于Transwell小室膜上，置于37 ℃，6 h凝固后，加入100 μL无血清的DEME培养基水化1 h。用胰蛋白酶消化无血清培养基重悬后，接种4×104/L的细胞于Transwell小室的上室。在小室下室分别加入500 μL不同浓度的EVO的培养基，置于37 ℃、5%CO2条件下培养。24 h后，用棉签擦去小室上室未侵袭的细胞和Matrigel，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS冲洗，结晶紫染色5 min，显微镜下拍照。
1.2.5 Western blot检测将SW480细胞分成4组，分别加入不同浓度(0、0.375、0.75、1.5 μmol/L)的EVO，作用24 h后收集细胞，抽提细胞全蛋白。蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(p-IκBα, p-NF-κB-p65和MMP-9，稀释比例均为1 :1 000)4 ℃孵育过夜。TBST液洗膜3次后，加入对应的二抗(稀释比例均为1 :10 000)室温孵育1 h，再用TBST洗膜，用ECL系统检测蛋白表达情况。用TBST再次洗膜，并用膜再生液于室温中摇床孵育30 min，重新进行封闭等步骤(一抗更换为IκBα、NF-κB-p65，稀释比例均为1 :2 000)，并再次ECL系统检测蛋白表达情况。MMP-9、MMP-2、MMP-13以β-actin作为内参，p-IκBα、p-NF-κB-p65以IκBα、NF-κB-p65作为对照，独立实验重复3次。
1.2.6 免疫荧光实验取对数生长期的SW480细胞，2×105个细胞接种于铺有灭菌爬片的24孔板内培养24 h后，对照组加入完全培养基，加药组加入含1.5 μmol/L的EVO完全培养基。待药物作用24 h后，PBS(pH 8.0)洗3次，甲醛固定30 min后，PBS(pH 8.0)洗3次；0.1% Triton X-100作用30 min，PBS(pH 8.0)洗3次；山羊血清封闭60 min后，加入一抗抗体(p-NF-κB-p65和MMP-9，稀释比例均为1 :100)，4 ℃孵育过夜；PBS(pH 8.0)洗3次，避光加入荧光二抗(稀释比例为1 :100)摇床上孵育2 h，避光加入DAPI(每孔10 μL)染核10 min，最后PBS(pH 8.0)洗3次，取出细胞爬片进行封片，荧光显微镜下拍照。
1.2.7 NF-κB-p65激活剂LPS预处理实验将SW480细胞分成3组，第1组不做药物处理；EVO组使用1.5 μmol/L的EVO处理24 h；激活剂组先用2.5 μmol/L的LPS预处理SW480细胞1 h后，再使用1.5 μmol/L的EVO处理24 h。实验结束后收集细胞，进行Western blot分析。
1.3 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，两组之间的比较采用两两比较的独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 EVO对SW480细胞增殖的影响使用CCK-8法检测不同浓度EVO作用于SW480细胞24、48、72 h后细胞的增殖率。如图 1所示，EVO能抑制SW480细胞的增殖，且呈时间和浓度依赖性。EVO作用SW480细胞48 h的IC50为12 μmol/L。
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| 图 1 CCK-8法检测EVO对SW480细胞增殖的影响 |
2.2 EVO对SW480细胞迁移的影响
划痕实验检测SW480的迁移能力，如图 2所示：相较于对照组，加入0.375 μmol/L的EVO后，SW480迁移的距离减少，而随着EVO浓度的增加，SW480细胞的迁移距离愈加缩短(P < 0.01)。结果表明不同浓度的EVO对SW480的迁移具有抑制作用，并且呈现出浓度依赖性。
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| A~E：划痕法检测不同浓度EVO(0 h 0 μmol/L，24 h 0, 0.375，0.75，1.5 μmol/L)对SW480细胞迁移的影响(×40)；F:不同浓度EVO对SW480细胞迁移的影响；a: P < 0.01，与对照组(0 μmol/L)比较 图 2 EVO抑制SW480细胞的迁移 |
2.3 EVO对SW480细胞侵袭的影响
在Transwell小室上室铺上基质胶，以检测SW480的侵袭能力。如图 3所示：不同浓度的EVO对SW480的侵袭均有抑制作用，在1.5 μmol/L的EVO作用下，仅有约27个SW480细胞穿过了Transwell小室的上室。该结果表明随着浓度提高，EVO对SW480细胞侵袭的抑制作用也随之增强，呈现出浓度依赖性(P < 0.01)。
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| A~D：Transwell法检测不同浓度EVO(0，0.375，0.75，1.5 μmol/L)对SW480细胞侵袭的影响(结晶紫×200)；E：EVO对SW480细胞侵袭能力的影响a: P < 0.01，与对照组(0 μmol/L)比较 图 3 EVO对SW480细胞侵袭能力的影响 |
2.4 EVO对NF-κB-p65信号通路的影响
用不同浓度的EVO作用于SW480细胞后，抽提全蛋白，Western blot检测NF-κB-p65信号通路的相关蛋白。结果如图 4所示：EVO可显著抑制迁移与侵袭的相关蛋白MMP-9、MMP-2的表达(P < 0.05)，但MMP-13的表达没有发生明显变化。尽管IκBα、NF-κB-p65的表达未受影响，但p-IκBα、p-NF-κB-p65的蛋白水平却明显下降(P < 0.01)。
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A: Western blot检测结果；B:半定量分析结果 a: P < 0.05, b: P < 0.01，与对照组(0 μmol/L)比较 图 4 EVO对SW480细胞NF-κB-p65信号通路的影响 |
2.5 EVO对p-NF-κB-p65和MMP-9表达的影响
免疫荧光结果显示：在无EVO诱导的情况下p-NF-κB-p65主要分布于SW480细胞的细胞核中，MMP-9主要分布于细胞胞质中；而用1.5 μmol/L的EVO作用于SW480细胞24 h后，p-NF-κB-p65和MMP-9的表达均显著减少(P < 0.01)。见图 5。
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| A:免疫荧光检测NF-κB-p65的表达；B：免疫荧光检测MMP-9的表达；C:半定量分析结果 a: P < 0.01，与EVO组(1.5 μmol/L)比较 图 5 EVO对SW480细胞NF-κB-p65和MMP-9表达的影响 |
2.6 LPS削弱EVO对NF-κB-p65通路的抑制作用
在使用NF-κB-p65的激活剂2.5 μmol/L LPS预处理SW480细胞1 h后，EVO对NF-κB-p65信号通路的抑制作用被显著削弱(P < 0.05，图 6)。
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| A: Western blot检测结果；B:半定量分析结果 a: P < 0.05，b: P < 0.01，与EVO组(1.5 μmol/L)比较 图 6 LPS削弱EVO对NF-κB-p65通路的抑制作用 |
3 讨论
相关报道显示，EVO可以显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌[12-15]。EVO也可以通过激活JNK信号通路来诱导结肠癌细胞的凋亡，阻滞其细胞周期于G2/M期，但其对于迁移和侵袭的影响却不明确[3]。因此，本研究着重探讨EVO对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响，并初步探索其潜在的分子机制。
本研究首先使用CCK-8法检测EVO对SW480细胞的增殖抑制作用，结果显示，EVO能够显著抑制SW480细胞的增殖，且呈时间和浓度依赖性。在1.5 μmol/L的EVO作用24 h后，SW480细胞没有发生明显的增殖抑制。因此在后续的实验中选用0、0.375、0.75、1.5 μmol/L作为加药浓度，进一步研究EVO对SW480细胞迁移和侵袭的影响。
本研究划痕实验与Transwell实验结果显示EVO可以显著抑制结肠癌细胞SW480的迁移和侵袭，且呈浓度依赖性。结肠癌细胞的迁移和侵袭过程复杂，其中包括细胞的粘附、释放酶来降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、细胞的增殖等[16]。在肿瘤的转移过程中，细胞与ECM之间的相互作用不可忽视[17]。基质金属蛋白酶家族(MMPs)已经被证明在各种ECM蛋白分解过程中扮演重要的角色。基质金属蛋白酶家族包括明胶酶、胶原酶、基质、弹性酶、膜型MMPs[18]。作为基质金属蛋白酶家族的重要成员，MMP-9能显著降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原蛋白，调控肿瘤细胞的迁移和侵袭[19]。在结肠癌中，存在着MMPs的过表达现象，其中MMP-9的过表达尤其明显，MMPs的过度表达促进了结肠癌细胞的迁移与侵袭，因此抑制MMPs的表达可以作为一种潜在的治疗结肠癌的方式[20]。Western blot实验结果显示，MMP-9和MMP-2的蛋白表达被EVO明显的抑制, 并且随着EVO浓度的提高，抑制作用愈加明显，但MMP-13的表达没有明显变化。以上结果说明了EVO可以通过抑制MMPs的表达来抑制结肠癌的迁移与侵袭。
MMP-9和MMP-2的基因表达受到各种转录因子的调控，如AP-1、NF-κB、Sp-1等[21]。NF-κB-p65在细胞核内调节MMPs的表达，其转录活力受到其细胞定位、磷酸化的调节[22]。未激活状态下的NF-κB与IκBα结合形成复合体，存在于细胞质中。当IκBα被磷酸化后，其会发生泛素化并降解，释放出结合的NF-κB-p65[23]。而释放出的NF-κB-p65会被进一步磷酸化，随之增强其核定位信号，进入细胞核促进下游基因的表达[24]。通过Western blot和免疫荧光实验，发现1.5 μmol/L的EVO可以显著抑制IκBα、NF-κB-p65的磷酸化，从而抑制下游迁移与侵袭相关蛋白MMP-9和MMP-2的表达。在经过NF-κB-p65的激活剂LPS预处理后，发现EVO对NF-κB-p65的抑制作用被显著削弱，这说明EVO是通过抑制NF-κB-p65的活性来抑制MMP-9和MMP-2的基因表达，而不是通过抑制AP-1或者Sp-1来发挥抑制作用。在结肠癌细胞中，均存在着NF-κB-p65的持续性激活，NF-κB-p65的激活会促进下游目的基因如Bcl-2、c-Myc、MMP-9和MMP-2的高表达，促进了结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[25]。因此，抑制NF-κB-p65的活性可以作为一种潜在的治疗结肠癌的方法，而EVO可以通过抑制NF-κB-p65的激活来抑制结肠癌迁移和侵袭。
本实验结果显示，EVO可以明显抑制结肠癌SW480细胞的迁移与侵袭，其机制是通过抑制IκBα/NF-κB-p65信号通路的激活来抑制迁移与侵袭相关蛋白的表达。该结果表明，EVO是一种潜在的治疗结肠癌的药物。
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