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RNAi沉默S100A9对U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新的影响
陈宸, 陈松, 霍钢     
400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院神经外科
[摘要] 目的 探讨沉默S100A9蛋白对人U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力的影响和机制。方法 采用shRNA-S100A9慢病毒感染人U87胶质瘤干细胞,RT-qPCR检测S100A9 mRNA表达,Western blot检测S100A9蛋白表达,MTT法检测细胞的增殖情况,干细胞球形成实验检测自我更新能力,RT-qPCR和Western blot检测β-catenin mRNA和蛋白的表达。结果 慢病毒感染后的细胞组S100A9 mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制(P < 0.05),细胞增殖变慢(P < 0.05),干细胞球形成能力受到明显抑制(P < 0.05),β-catenin mRNA和蛋白的表达明显下调(P < 0.05)。结论 抑制S100A9蛋白的表达能明显抑制U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号转导通路有关。
[关键词] S100A9     胶质瘤干细胞     细胞增殖     自我更新     Wnt/β-catenin    
Effect of RNA interference-mediated S100A9 gene silencing on proliferation and self-renewal of U87 glioma stem cells in vitro
CHEN Chen, CHEN Song, HUO Gang     
Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
[Abstract] Objective To investigate the effect of S100A9 gene silencing on proliferation and self-renewal ability of human U87 glioma stem cells. Methods Human U87 glioma stem cells were infected with shRNA-S100A9 lentivirus for S100A9 gene silencing, and the changes in the expression of S100A9 at mRNA and protein levels were analyzed using RT-qPCR and Western blotting, respectively. The changes in the proliferation of the cells were observed using MTT assay, and the self-renewal ability of the stem cells was assessed using stem cell sphere formation assay. The expression of β-catenin at the mRNA and protein levels was detected using RT-qPCR and Western blotting. Results Infection of U87 cells with shRNA-S100A9 lentivirus caused significant inhibition of the expression of S100A9 at both the mRNA and protein levels (P < 0.05) and obviously suppressed the cell proliferation (P < 0.05) and stem cell sphere formation (P < 0.05). S100A9 gene silencing also significantly down-regulated the mRNA and protein expression of β-catenin in U87 cells (P < 0.05). Conclusion S100A9 gene silencing significantly inhibits the proliferation and self-renewal ability of U87 glioma stem cells in vitro.
[Key words] S100A9     glioma stem cells     cell proliferation     self-renewal     Wnt/β-catenin    

恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,具有病程短、进展快、预后差等特点,目前的多种治疗手段都无明显的效果,2年生存率不足30%,严重威胁着人类的生命健康[1]。目前研究认为胶质瘤干细胞是胶质瘤发生、发展与维持的基础,因此杀灭胶质瘤干细胞可能成为治愈胶质瘤的一种可行的手段。本课题组在前期蛋白组学研究中发现钙结合蛋白S100A9在胶质瘤干细胞中显著上调,S100A9蛋白属钙结合蛋白S100家族成员,广泛参与细胞骨架构建、钙离子稳态调节、分化及炎症反应等,并与肿瘤关系密切[2]。本研究采用shRNA-S100A9慢病毒感染人U87胶质瘤干细胞,观察U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力,并揭示其作用的潜在机制。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

人胶质瘤U87细胞系来源于中国科学院细胞库。试剂:表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(美国Peprotech公司),B-27(美国Gibco公司),DMEM/F12培养基(美国HyClone公司),胎牛血清(美国Gibco公司),多聚赖氨酸(中国北京Solarbio公司),嘌呤霉素(中国北京Solarbio公司),TRIzol、反转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq (日本TaKaRa公司),兔抗人巢蛋白(NESTIN)单克隆抗体、小鼠抗人SOX2单克隆抗体(美国Santa公司),Cy3标记山羊抗鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG(美国Sigma公司),MTT试剂盒(中国南京凯基生物公司),shRNA-S100A9慢病毒(中国上海吉凯基因化学技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 U87胶质瘤干细胞培养

将对数生长期的U87细胞经0.25%的胰酶消化成单个细胞,1 000 r/min,离心5 min,弃上清后加入适量无血清培养基(内含EGF、bFGF各20 ng/mL及B-27 20 μL/mL)重悬,按1:3比例传代,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。此后细胞汇合度达80%后,收集细胞沉淀胰酶消化单个细胞,依旧用上述无血清培养基按1:3比例传代培养,以供后续实验。

1.2.2 U87胶质瘤干细胞的鉴定

取无菌玻片置入24孔板内(为使细胞贴壁,在无菌玻片表面加入适量2%多聚赖氨酸进行包被,再用无菌PBS清洗)。将U87胶质瘤干细胞球接种于24孔板内,待细胞球贴壁后取出盖玻片,经PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定约30 min。PBS清洗多聚甲醛,山羊血清封闭30 min。再次用PBS洗涤后抗SOX2及抗NESTIN一抗孵育4 ℃过夜,次日用PBS漂洗3次,荧光素标记二抗孵育(37 ℃,1 h)。彻底干燥封片后,用激光共聚焦显微镜采集图像。

1.2.3 慢病毒感染U87胶质瘤干细胞

将对数生长期的U87胶质瘤干细胞球经胰酶消化成单个细胞,按每孔6×104个细胞接种于24孔培养板(24孔板需先加入适量的2%多聚赖氨酸包被),将shRNA-S100A9慢病毒按说明书与无血清培养基配置成混合液,每孔加入500 μL后置于培养箱中培养。48 h后更换培养基后继续培养,72 h观察绿色荧光表达,并更换含5 μg/mL嘌呤霉素细胞培养基进行药物筛选,待绿色荧光细胞所占比例达80%以上后改用2.5 μg/mL嘌呤霉素培养基维持细胞生长。实验分组:①空白组(未作任何处理的U87胶质瘤干细胞);②对照组shRNA-NC (无意义shRNA慢病毒感染的U87胶质瘤干细胞);③shRNA-S100A9-1、shRNA-S100A9-2、shRNA-S100A9- 3组(shRNA-S100A9慢病毒感染的U87胶质瘤干细胞)。

1.2.4 RT-qPCR检测S100A9 mRNA的表达

收集各组U87胶质瘤干细胞1×106个,按TRIzol说明书提取各组细胞总RNA。TaKaRa逆转录试剂盒合成cDNA并进行PCR扩增。以GAPDH为内参,反应体系25 μL,反应程序:95 ℃ 30 s,95℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,60 ℃ 5 min。各引物信息见表 1

表 1 各基因引物信息
基因 引物序列 产物大小
GAPDH 正义链;5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′ 205 bp
反义链;5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′
S100A9 正义链;5′-TGCCCTGGAATGGGTGTTGCT-3′ 210 bp
反义链;5′-TTCTCCACCCAGCCGCCAGG-3′
β-catenin 正义链;5′-ACCTGAGACTGGATGTAGAA-3′ 158 bp
反义链;5′-GCTGGAATGACAACTGGAT-3′

1.2.5 Western blot检测S100A9及β-catenin蛋白表达

收集各组U87胶质瘤干细胞4×106个,加入RAPI裂解液后进行超声破碎,BCA试剂盒测定蛋白浓度。将各组蛋白浓度调整一致后加入上样缓冲液煮15 min。每孔加入30 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,完毕后将蛋白电转印至PVDF膜,碧云天快速封闭液封闭15 min,小鼠抗人S100A9和β-catenin一抗(稀释至1:500)4 ℃过夜,TBST洗涤3次,每次10 min,山羊抗小鼠IgG(稀释至1:5 000)二抗室温孵育1 h,再用TBST洗涤3次,每次10 min,超敏ECL发光试剂盒显影。凝胶成像系统进行图片采集,结果采用Quantity One软件进行光密度值分析,同时设置GAPDH为内参对照。

1.2.6 MTT绘制细胞生长曲线

将各组经嘌呤霉素筛选完成的U87胶质瘤干细胞稳转株经胰酶消化成单个细胞,计数并调整细胞数为2×104/mL,按200 μL/孔(约4 000/孔)加入96孔板(96孔板需先加入适量的2%多聚赖氨酸包被),每组设5个复孔。分别培养24、48、72 h后,加入5 mg/mL MTT 20 μL(0.5%MTT),37 ℃继续培养4 h,吸去上清,再加入DMSO 150 μL于震荡器上震荡10 min,待Formazan完全溶解后,酶标仪检测490 nm处的光密度值,以时间点为横轴、光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.7 干细胞球形形成实验检测细胞自我更新能力

U87胶质瘤干细胞经嘌呤霉素筛选完成后,取shRNA-NC组和shRNA-S100A9-1组细胞经胰酶消化成单细胞悬液,按每孔100个细胞接种于24孔板中,每组设5个复孔。培养14 d后,观察并计数直径超过50 μm的细胞球数,结果以5个复孔的平均值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件,结果以x±s表示,正态分布的两组数据比较用t检验,多组数据间比较用单因素方差分析,非正态分布的数据采用非参数检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 U87胶质瘤干细胞免疫荧光鉴定

U87胶质瘤干细胞球SOX2(红色荧光)和NESTIN(绿色荧光)免疫荧光染色结果显示U87胶质瘤细胞SOX2和NESTIN染色阳性(图 1)。

图 1 U87干细胞免疫荧光鉴定  (激光共聚焦显微镜×200)

2.2 沉默S100A9后各组S100A9 mRNA的表达

Real-time qPCR结果显示:与空白组和shRNA-NC组相比,shRNA-S100A9-1中S100A9 mRNA明显降低,其抑制率为85%(P < 0.05);shRNA-S100A9-2中S100A9 mRNA表达抑制率为54%(P < 0.05);shRNA-S100A9-3、空白组及shRNA-NC比较差异无统计学意义(图 2)。以上结果显示shRNA-S100A9-3的基因沉默效果很差,因此排除shRNA-S100A9-3。

1:U87GSCs-NC组;2:shRNA-NC组;3:shRNA-S100A9-1组;4:shRNA-S100A9-2组;5:sh-S100A9-3组;a:P < 0.05,与shRNA-NC组比较 图 2 RT-qPCR检测各组shRNA-S100A9 mRNA的表达

2.3 沉默S100A9后各组S100A9蛋白表达

Western blot结果显示:与空白组和shRNA-NC组相比,shRNA-S100A9-1、shRNA-S100A9-2组中S100A9蛋白表达均下调,shRNA-S100A9-1组蛋白下调较shRNA-S100A9-2组明显,差异有统计学意义(P < 0.05),空白组和shRNA-NC组比较差异无统计学意义(图 3)。因此选用shRNA-S100A9-1进行下步实验。

1:空白组; 2:shRNA-NC组; 3: shRNA-S100A9-1组; 4: shRNA-S100A9-2组 图 3 Western blot检测各组shRNA-S100A9蛋白表达

2.4 沉默S100A9后shRNA-S100A9-1和shRNA-S100A9-2组细胞增殖能力下降

MTT结果显示:shRNA-NC组与shRNA-S100A9-1组比较,从48 h至72 h,shRNA-S100A9-1组的生长速度显著降低,shRNA-S100A9-1组细胞增殖速度明显低于空白组和shRNA-NC组,差异具有统计学意义(P < 0.05,图 4)。表明沉默S100A9表达能抑制U87胶质瘤干细胞增殖。

a:P < 0.05,与shRNA-NC组比较 图 4 慢MTT检测病毒载体感染U87干细胞后的生长曲线

2.5 慢病毒载体感染U87GSC对肿瘤细胞球形成的影响

显微镜下观察shRNA-NC组和shRNA-S100A9-1组肿瘤细胞球形成情况,拍摄每孔肿瘤细胞球的形态并统计肿瘤细胞球个数。可见shRNA-S100A9-1组肿瘤细胞球的大小、数量明显低于shRNA-NC组,差异具有统计学意义(20.00±4.32 vs 9.00±2.16,P < 0.05,图 5)。

A: shRNA-NC组;B: shRNA-S100A9-1组 图 5 显微镜下观察培养14 d shRNA-NC和sh-S100A9-1组干细胞成球  (×100)

2.6 沉默S100A9后β-catenin mRNA和蛋白的表达下降

与空白组和shRNA-NC组相比,shRNA-S100A9-1组和shRNA-S100A9-2组β-catenin mRNA和蛋白表达均降低,尤以shRNA-S100A9-1组明显,差异具有统计学意义(P < 0.05,图 6)。

1:空白组; 2: shRNA-NC组; 3: shRNA-S100A9-1组; 4: shRNA-S100A9-2组A: RT-qPCR检测β-catenin mRNA表达a:P < 0.05,与shRNA-NC组比较;B: Western blot检测β-catenin蛋白表达 图 6 慢病毒载体感染U87干细胞后β-catenin的表达

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,胶质瘤干细胞被认为在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用,是对放化疗产生耐受以及复发的根源。目前认为肿瘤干细胞能凭借自身更新能力和处于静止期的特性,逃脱药物杀伤作用,从而在放化疗后导致肿瘤的复发。具有自我更新能力的肿瘤干细胞,即使很少量也能促进肿瘤的发展以至于难以控制[3-4]。因此,针对胶质瘤干细胞的自我更新相关分子及机制研究,是阐明其致瘤原理、寻找新的治疗靶点的关键环节。

本课题组前期蛋白组学研究发现S100A9蛋白在胶质瘤干细胞中高表达[2]。S100A9蛋白属钙结合蛋白S100蛋白家族成员,具有EF手型,组成螺旋-环-螺旋的结构(helix-hoop-helix),S100蛋白作为细胞内Ca2+信号或Ca2+调节蛋白,其生物学功能涉及蛋白质的磷酸化、参与细胞骨架建立,调节钙离子稳态、调节酶活性、作为转录因子、调节细胞生长分化、参与炎症反应等,其调控基因位于人染色体lq21上。这个区段染色体稳定性差,易发生多种染色体重排,如杂合性缺失、易位、重叠等,从而与肿瘤关系密切[5]。随着近年来对肿瘤研究的不断深入,发现S100A9在肺腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种原发和浸润性肿瘤中高表达,提示与肿瘤的发生发展有关[6-8]。进一步对S100A9功能的研究发现,S100A9能促进人肝细胞癌细胞增殖、克隆形成和侵袭[9]。而靶向干预细胞内源性S100A9的表达后,骨肉瘤细胞的增殖能力会显著受抑,而且会降低咽喉癌和乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力,增加乳腺癌患者的生存能力[10-12]

虽然S100A9在其他肿瘤中有较多的研究,但S100A9在胶质瘤干细胞的功能还不十分清楚。在前期研究中我们发现S100A9能影响胶质瘤干细胞的增殖能力[2],而在本研究中我们进一步确认了S100A9能影响胶质瘤干细胞的增殖能力,并发现S100A9能影响U87胶质瘤干细胞自我更新的能力。这提示S100A9在胶质瘤干细胞自我更新中发挥着重要作用,因此对其机制更加深入的研究是极其必要的。

Wnt/β-catenin是经典的信号通路,在正常情况下,β-catenin与糖原合成酶激酶(GSK)-3β、腺瘤性息肉病(APC)和轴抑制蛋白(如Axin)相互作用形成复合物。而当胞浆中β-catenin增多后,可转移到胞核,进而与其相应的转录因子结合,导致该信号途径下游靶基因的转录激活。同时临床胶质瘤标本的证据显示,与正常脑组织相比,癌组织中β-catenin和Tcf-4表达上调[13]。且沉默β-catenin之后胶质瘤细胞增殖能力下降、凋亡增加、成瘤能力下降[14]。激活的Wnt信号通路可以促进Oct4、c-myc、Nanog等转录因子的表达,维持多种干细胞的自我更新;Wnt能够上调BMP-2、BMP-4、BMP-7的表达,还可能通过激活上调HoxB4、Notch-1以及Hes-1来抑制分化[15]。近年来研究表明,Wnt信号通路的活化促进了脑肿瘤干细胞的自我更新,引起了脑肿瘤干细胞比例的增加[16]。因此,Wnt信号通路可能是干细胞自我更新的主要途径。

最近报道S100蛋白家族的S100A6、S100A7能调节β-catenin的异常表达。研究报道S100A6与β-catenin的直接相互作用抑制β-catenin的降解,导致其在胞浆内的水平增加,从而使Wnt/β-catenin信号途径的活性增强。另外提示S100A6也可能通过与GSK-3β的直接相互作用实现对其活性的调节,从而抑制β-catenin的磷酸化,使β-catenin降解受阻而致胞浆内水平增加,S100A7能够下调β-catenin的表达起着抑制肿瘤发生的作用[17-19]。本研究在有效干扰S100A9蛋白表达后能明显下调β-catenin蛋白的表达,这提示S100A9能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响胶质瘤干细胞的增殖和自我更新。因此我们推测S100A9也能以某种机制参与调控Wnt信号通路。虽然这种机制目前尚不明确,但是我们后续会对S100A9、β-catenin和胶质瘤干细胞自我更新能力之间的联系进行深入研究。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201810047
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陈宸, 陈松, 霍钢.
CHEN Chen, CHEN Song, HUO Gang.
RNAi沉默S100A9对U87胶质瘤干细胞增殖和自我更新的影响
Effect of RNA interference-mediated S100A9 gene silencing on proliferation and self-renewal of U87 glioma stem cells in vitro
第三军医大学学报, 2019, 41(6): 575-580
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(6): 575-580
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201810047

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收稿: 2018-10-10
修回: 2018-11-18

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