2. 518000 广东 深圳，深圳市南山区人民医院肿瘤科
2. Department of Oncology, the People's Hospital of Nanshan District, Shenzhen, Guangdong Province, 518000, China
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中居于第4位，病死率仅次于肺癌，占恶性肿瘤死因的第2位。胃癌发病隐匿，确诊时多已处于发病晚期，恶性程度高，预后差[1]。目前我国胃癌的发病率和病死率均呈上升趋势，在农村地区该疾病负担尤为严重[2]。
胃癌的发病机制十分复杂，胃癌标志物的发掘，不仅有助于早期诊断胃癌，评价肿瘤细胞的增殖、分化和迁移能力，也能加深对胃癌发生机制的认识，为胃癌治疗提供新的思路[3]。
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指一类长度大于200 bp的RNA，它可通过转录调控、RNA加工和核内运输等多种方式参与肿瘤的发病过程[1]。近些年研究表明GClnc1在胃癌组织中高表达，与胃部肿瘤的发生和增殖迁移密切相关，但具体的致病机制并不很明确[4]。有研究报道SIRT3/FOXO3/SOD2轴在肿瘤细胞中被激活，以对抗代谢过程中产生的大量活性氧，进而促进肿瘤的转移[5]。本研究通过在人胃癌细胞中转染病毒分别过表达和沉默GClnc1，研究GClnc1对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响，并检测GClnc1对SIRT3/FOXO3/SOD2的调控作用，以进一步探究GClnc1的致病机制。
1 材料与方法 1.1 培养基与试剂胎牛血清、OMEM、DMEM和RPMI1640培养液购自美国Gibco公司; 细胞裂解液RIPA、增强型化学发光试剂盒和CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; 青霉素、链霉素、Lipofectamine 2000、TRIzol和SYBR Green PCR Master Mix购自美国Invitrogen公司。
1.2 细胞培养人胃癌细胞SGC7901来源于上海生化细胞所。SGC7901细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基进行培养。
1.3 慢病毒的构建与转染慢病毒载体质粒LV3(Pglv3/H1/GFP+PURO)以及包装质粒均购于上海吉玛公司。GClnc1、sh-GClnc1和阴性片段的导入以及病毒包装均由上海吉玛公司完成。慢病毒转染方法参考上海吉玛公司慢病毒产品操作手册。
1.4 RNA干扰将si-RNA与Lipofectamine 2000以合适的比例在OMEM中孵育20 min，将混合液加入细胞培养4 h后，将培养基换为完全培养基，培养48 h后将细胞用于下一步检测。si-SIRT3、si-FOXO3和si-SOD2 (Homo)购自上海吉玛公司。
1.5 qRT-PCR检测使用试剂盒提取总RNA后逆转录为cDNA用于下一步检测。qRT-PCR引物序列：GClnc1，上游5′-TATGTACACAGTGTTGCTCACC-3′，下游5′-AGTTGTGATTTCTCAACAT-3′; SIRT3，上游5′-ACCCAGTGGCATTCCAGAC-3′，下游5′-GGCTTGGGGTTGTGAA-AGAAG-3′; FOXO3，上游5′-CGGACAAACGGCTCAC-TCT-3′，下游5′-GGACCCGCATGAATCGACTAT-3′; SOD2，上游5′-CGTGACTTTGGTTCCTTTGAC-3′，下游5′-ATTTGTAAGTGTCCCCGTTCC-3′; GAPDH，上游5′- GCATTGCCCTCAACGACCAC-3′，下游5′-CCACCACCC-TGTTGCTGTAG-3′。逆转录程序设置：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。qRT-PCR程序设置为：第1步95 ℃ 2 min; 第2步95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环; 第3步, 65 ℃ 5 min。
1.6 Western blot检测收集细胞加入RIPA细胞裂解液和SDS上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，将PVDF膜分别与对应的一抗和二抗依次进行孵育，最后用ECL试剂盒显影并曝光。抗体SIRT3、FOXO3、SOD2、COX4和GAPDH均购于美国Cell Signal公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG购自上海R&D生物科技公司。
1.7 CCK-8测定细胞增殖能力将SGC7901细胞进行转染12 h后，将各组细胞调整至相同的浓度，接种于96孔板，分别在培养12、24 h和36 h后，每孔加入适量CCK-8溶液，在细胞培养箱孵育2 h，并置于全波长酶标仪以450 nm波长测定光密度值D(450)。
1.8 划痕实验将SGC7901细胞进行转染24 h后，将各组细胞调整至相同的浓度接种于12孔板，待细胞贴壁后用移液枪枪头进行划痕，用PBS缓冲液洗去悬浮得细胞，并加入RPMI1640培养基。在显微镜下记录划痕宽度，之后将细胞放入培养箱培养24 h，再次拍照记录划痕宽度，计算迁移速率。
1.9 统计学分析采用Graphpad Prism 6对实验数据进行统计分析。计量数据以x±s表示。数据比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 GClnc1过表达慢病毒和GClnc1沉默慢病毒的鉴定在转染GFP-GClnc1慢病毒的细胞中，GClnc1 RNA水平明显上升(P < 0.01)，而在转染sh-GClnc1慢病毒的细胞中，GClnc1 RNA水平明显降低(P < 0.05, 图 1)。
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| a：P < 0.05，b:P < 0.01，与NC组比较 图 1 过表达慢病毒LV-GClnc1和沉默慢病毒LV-sh-GClnc1转染效率的鉴定 |
2.2 GClnc1调控SIRT3、FOXO3和SOD2的蛋白水平和mRNA水平
过表达GClnc1上调SIRT3、FOXO3和SOD2的mRNA水平(P < 0.05，P < 0.01)，而GClnc1的沉默则使这些分子的mRNA水平降低(P < 0.05，图 2)。同样，过表达GClnc1上调了这些蛋白的水平，而沉默GClnc1则下调其水平(P < 0.05，P < 0.01，图 3)。线粒体的标记蛋白COX4含量差异没有统计学意义(图 3)。
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| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较 图 2 qRT-PCR检测SIRT3、FOXO3和SOD2 mRNA水平 |
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| A：Western blot检测1：NC组; 2：LV-GCInc1组; 3: sh-GCInc1组; B:半定量分析a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较 图 3 Western blot检测SIRT3、FOXO3、SOD2和COX4的蛋白水平 |
2.3 GClnc1依赖于SOD2调控SGC7901细胞的增殖和迁移
CCK-8和划痕实验结果显示：GClnc1的过表达可以提高细胞活力和细胞迁移速度，而沉默GClnc1则效果相反(P < 0.05，P < 0.01)。在过表达GClnc1的同时沉默SIRT3、FOXO3或者SOD2，肿瘤细胞的增殖和迁移能力不再增加(图 4)。
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| A:CCK-8检测细胞增殖能力; B:各组细胞迁移速率变化1：NC组; 2：LV-GCInc1组; 3：sh-GCInc1组; 4：sh-GCInc1+siSIRT3组; 5：sh-GCInc1+siFOXO3组; 6：sh-GCInc1+si-SOD2组; a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较; C:划痕实验观察细胞迁移能力(×100) 图 4 GClnc1对细胞增殖能力和迁移能力的影响 |
3 讨论
lncRNA是一类长度大于200 bp的RNA，目前在人类基因组中发现约有上万条lncRNA，它们中大多不编码蛋白质[6]。lncRNA可与DNA、RNA和蛋白质相互作用，并调控染色质重构、转录和转录后修饰。最近的研究表明：lncRNA的异常表达参与了肿瘤细胞的发生、增殖和转移[7]。
通过对胃癌患者组织样本的分析，GClnc1被发现是1条与胃癌相关的lncRNA。GClnc1的上调促进了胃癌细胞的增殖、转移和化疗耐药性，而GClnc1的下调则抑制了胃癌细胞的生长、转移，并增加了胃癌细胞的化疗敏感性[4]。GClnc1在慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌的演变过程中表达量依次升高，高水平表达的GClnc1主要通过结合SOD2的启动子促进胃癌的发生，并成为人类胃癌迁移性增加的决定性因素之一[4]。但GClnc1对SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路的影响，以及SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路在胃癌演进过程中的作用尚未得到充分研究。
SIRT3是一个重要的线粒体蛋白质，它可以抑制氧化应激，并通过稳定线粒体膜电位来减少活性氧(ROS)的产生，从而维持线粒体的正常功能[8]。SIRT3与肿瘤的发生、发展关系密切，其主要通过调节氧化应激途径促进肿瘤细胞存活。在人宫颈癌细胞HeLa中SIRT3可以去乙酰化Ku70而增强Ku70-Bax结合，并防止Bax转运至线粒体，抑制肿瘤细胞凋亡的发生[9]。SIRT3在一些人口腔癌细胞高表达，在这些细胞下调SIRT3的表达可以抑制细胞生长和增殖，并且增强细胞对放疗和化疗药物的敏感性[10]。FOXO3是一类进化保守的转录因子，在细胞葡萄糖代谢、自噬、衰老和肿瘤中起着重要的作用[11]。有研究报道在人的乳腺肿瘤组织中，FOXO3呈高表达[12]。FOXO3可以诱导基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13的表达，而基质金属蛋白酶则是导致肿瘤转移的重要影响因素。SOD2主要定位在线粒体基质中，炎症因子、肿瘤坏死因子和氧化应激均能诱导SOD2的表达。为了对抗过度的氧化应激，抗氧化酶对于肿瘤细胞的生存是必要的。当ROS的积累超过SOD2等抗氧化因子的阈值后，可导致肿瘤细胞的损伤和死亡。SOD2则通过其抗氧化作用，清除肿瘤细胞线粒体所产生的ROS[13]。SOD2在结肠癌、膀胱癌、前列腺癌和肺癌组织中高表达。MYC原癌基因增加SOD2的表达，进而增强舌鳞状细胞癌细胞的迁移和迁移性表型[14]。另有研究报道：在复发性肿瘤中SOD2蛋白表达较高，并且这些复发性肿瘤对SOD2的下调十分敏感，SOD2升高与患者的预后不良相关[15]。FOXO3是SOD2的转录因子，可被SIRT3去乙酰化而激活，进而减少ROS的产生[9]。另外，SIRT3还可以直接通过去乙酰化作用使SOD2活性增强，发挥其抗氧化功能[16]。
本研究将过表达慢病毒LV-GClnc1和沉默慢病毒LV-sh-GClnc1，分别转染到人胃癌细胞SGC7901中。为了检验病毒的表达效率，通过q-PCR检测GClnc1的分子水平，发现在转染GFP-GClnc1慢病毒的细胞中，GClnc1 RNA水平明显上升，而在转染sh-GClnc1慢病毒的细胞中，GClnc1 RNA水平明显降低。这表明GClnc1的过表达病毒和沉默病毒构建成功，转染效果良好。
有研究报道SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用[5]。为了研究GClnc1是否可以调控该通路，本研究在SGC7901细胞中转染了GFP-GClnc1和sh-GClnc1，随后检测了SIRT3、FOXO3和SOD2的mRNA和蛋白水平。结果表明：过表达GClnc1增加了SIRT3、FOXO3和SOD2的mRNA水平，而GClnc1的沉默则使这些分子的mRNA水平降低。在蛋白水平，观察到了同样的变化。为了排除这些蛋白含量变化受线粒体数量的影响，我们检测了线粒体的标记蛋白COX4，发现COX4蛋白含量没有差异。以上结果说明GClnc1可以从转录水平正向调控SIRT3、FOXO3和SOD2的表达。
既然SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路可以影响肿瘤细胞的转移，而本研究发现GClnc1可以调控该通路，那么GClnc1是否通过该信号通路来影响肿瘤细胞的增殖能力和迁移能力呢？本研究在SGC7901细胞中分别过表达和沉默了GClnc1，并且在过表达GClnc1的同时分别沉默了SIRT3、FOXO3和SOD2的表达。通过CCK-8和划痕实验结果发现GClnc1的过表达可以提高肿瘤细胞的增殖能力和迁移能力，而沉默GClnc1则效果相反。在过表达GClnc1的同时沉默SIRT3、FOXO3或者SOD2，肿瘤细胞的增殖和迁移能力不再增加。这些数据表明GClnc1依赖于SIRT3/FOXO3/SOD2轴调控细胞的增殖和迁移能力。
本研究结果显示GClnc1在体外肿瘤细胞中具有促增殖和促迁移作用，并且通过研究其分子机制，发现GClnc1依赖于SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路发挥其促增殖和促迁移作用。总之，本研究在一定程度上揭示了SIRT3/FOXO3/SOD2信号通路在GClnc1促进SGC7901细胞增殖和迁移中的作用，为进一步阐明GClnc1对胃癌细胞的作用机制以及胃癌的病理机制提供了实验依据，也为胃癌的治疗研究提供了潜在的靶点。
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