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CaMKⅡ和PLB在房颤心房重构中的作用及意义
曹哲哲, 马瑞彦, 蹇朝, 唐富琴, 肖颖彬     
400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院全军心血管外科研究所
[摘要] 目的 分析风湿性心脏病(风心病)患者右心房组织受磷蛋白(phospholamban,PLB)及其调节蛋白钙调蛋白(CaMKⅡ)的mRNA水平、蛋白及磷酸化水平,探讨CaMKⅡ和PLB在心房纤颤(房颤)与心房重构中的作用机制。方法 收集本院2017年7-10月30例风心病患者右心房组织标本[男性12例,女性18例,年龄24~68(50.8±11.4)岁],其中窦性心律组11例,房颤心律组19例。RT-PCR检测两组CaMKⅡ和PLB的mRNA,Western blot检测两组CaMKⅡp286、PLBp17和PLB的表达情况。结果 与窦性心律组比较,房颤心律组CaMKⅡ(0.006±0.003)和PLB(1.704±1.008)的基因表达量均显著增加(P < 0.05),CaMKⅡp286(0.812±0.227)和PLBp17(0.649±0.354)蛋白水平显著增加(P < 0.05),而PLB蛋白水平则显著降低(0.886±0.364,P < 0.05)。结论 心房组织内CaMKⅡ和PLB的mRNA水平以及CaMKⅡp286和PLBp17的水平与房颤呈正相关,从而PLB单体水平降低,调节PLB来调控心房肌细胞钙离子循环有望成为房颤心房重构治疗的靶点。
[关键词] 钙调蛋白     受磷蛋白     心房重构     心房纤颤    
Roles and significance of CaMKⅡ and PLB in atrial remodeling in patients with atrial fibrillation
CAO Zhezhe, MA Ruiyan, JIAN Zhao, TANG Fuqin, XIAO Yingbin     
Institute of Cardiovascular Surgery, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
[Abstract] Objective To investigate the mRNA and protein and phosphorylation levels of phospholamban (PLB) and its regulatory protein Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ (CaMKⅡ) in right atrial tissue of patients with rheumatic heart disease (RHD), and explore their roles and significance in atrial fibrillation and atrial remodeling. Methods Right atrial tissue samples from 30 patients with rheumatic heart disease [12 males and 18 females, aged 24~68 (50.8±11.4) years] were collected from our institute during July and October 2017. The patients were assigned into the sinus rhythm group (n=11) and the atrial fibrillation rhythm group (n=19).The mRNA levels of CaMKⅡ and PLB were examined by RT-PCR, and protein levels of CaMKⅡp286, PLBp17 and PLB were measured by Western blotting. Results Compared with the sinus rhythm group, the mRNA levels of CaMKⅡ (0.006±0.003) and PLB (1.704±1.008) were significantly higher in the atrial fibrillation rhythm group (P < 0.05). While, similar trends were seen in the protein levels of CaMKⅡp286 (0.812±0.227) and PLBp17 (0.649±0.354) (P < 0.05), but the expression level of PLB was opposite (0.886±0.364, P < 0.05). Conclusion The mRNA levels of CaMKⅡ and PLB and the protein levels of CaMKⅡp286 and PLBp17 in atrial tissues are positively correlated with severity of atrial fibrillation. Therefore, decreasing PLB monomer and thus regulating PLB to control the cycle of calcium ions in atrial myocytes might be expected to a target for atrial remodeling therapy in atrial fibrillation.
[Key words] CaMKⅡ     phospholamban     atrial remodeling     atrial fibrillation    

心房纤颤(房颤)是临床常见的心律失常之一,并且随着年龄的增长,发病率也逐渐增加[1]。近年来的研究表明,心房的电重构会引起有效不应期的缩短、延长或不协调,而结构的重构会引起电信号在心房内传导的不及时,继而引起心房收缩功能的障碍[2]。心房细胞内钙离子循环是心肌收缩和舒张过程中重要的离子流动。心肌细胞内钙离子的处理不当和钙超载是心肌细胞发生凋亡,继而纤维化修复是心肌纤维化形成的重要因素[3]。本课题组前期研究表明,房颤患者的心房组织纤维化程度相比窦性心律患者更为严重[4]。当房颤发生时,CaMKⅡp286以及单体PLB和五聚体PLBp17水平的变化直接影响着胞质内钙离子的水平,因钙离子参与心肌电活动,其异常是心房电重构的表现之一,而钙离子的水平又与心肌细胞凋亡后纤维化形成导致心房结构重构息息相关。因此,CaMKⅡ-PLB通路的改变在房颤心房重构中起着重要的作用。本研究通过检测PLB及其调节激酶CaMKⅡ的mRNA和蛋白磷酸化水平,初步探讨CaMKⅡ-PLB通路在房颤心房重构中的作用及意义。

1 资料与方法 1.1 研究对象

收集本院2017年7-10月风心病患者30例,其中男性12例,女性18例,年龄24~68(50.8±11.4)岁,窦性心律组11例,房颤心律组19例。患者心功能为Ⅱ~Ⅲ级(NYHA标准),近6个月内均未服用血管紧张素转换酶抑制剂类药物,均未患有高血压、冠心病、慢性肺源性心脏病、心肌病、甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等。本研究通过本院伦理委员会审查(20170313)。

1.2 标本的采集

在体外循环建立后心脏停跳前取右心房组织100 mg,去除脂肪组织,洗净残留血液,分为两部分,分别用于组织总蛋白提取和总RNA提取。

1.3 心房组织CaMKⅡ和PLB的mRNA水平检测

液氮研磨心房组织,按照TRIzol(Invitrogen)法提取组织总RNA。使用核酸仪测总RNA浓度及纯度,使用反转录试剂盒[prime script RT Regent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)TaKaRa]将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板对上述基因的编码区扩增,反应体系为:10 μL Eve-Green qPCR master mix(Bio-rad),1 μL PCR上游引物,1 μL PCR下游引物,PLB正义链:5′-CCAATACCTCACTCGCTCAGCTATAAG-3′,反义链:5′-TCACGATGATACAGATCAGCAAGA-GAC-3′;CaMKⅡ正义链:5′-GAAGTCGGATGGCGGTGTCAAG-3′,反义链:5′- GTCCTCATCTTCTGTGGTGGTGTTG-3′;GAPDH正义链:5′- TGGAAGGACTCATGACCACA-3′,反义链:5′-GAGGCAGGGATGATGTTC-TG-3′。再加入1 μL cDNA,7 μL DEPC水。每个检测指标设3个平行复孔,将混合均匀的反应液于qTOWER 2.2 PCR仪完成反应,反应条件为95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s,40个循环。以GAPDH为内参计算获得2-△Ct值表示基因表达水平。

1.4 心房组织Western blot法检测蛋白表达水平

将心房组织用液氮研磨法提取组织总蛋白,BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳:检测CaMKⅡp287(Badrilla)、SERCA2a(Abcam)使用Tris/Glycine/SDS系统(Bio-rad)配合10%预制胶(Bio-rad)电泳,PLB(Badrilla)及PLBp17(Badrilla)使用Tris/Tricine/SDS系统(Bio-rad)配合16.5%预制胶(Bio-rad)电泳。电泳完成后封闭1 h,一抗4 ℃过夜,二抗室温孵育1 h,ECL显影。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以x±s表示,采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 心房组织基因表达检测

与窦性心律组比较,房颤心律组心房肌组织中CaMKⅡ基因表达水平(0.006±0.003)显著增加(P < 0.05,图 1);同样,房颤心律组心房肌组织中PLB基因表达水平(1.704±1.008)较窦性心律组也显著增加(P < 0.05)。提示CaMKⅡ和PLB可能在房颤发生和维持中起作用。

a: P < 0.05, 与窦性心律组比较;A:CaMKⅡ;B:PLB 图 1 窦性心律组和房颤心律组CaMKⅡ和PLB的基因相对表达量散点图

2.2 心房组织相关蛋白的表达

Western blot检测结果见图 2,CaMKⅡp286的α亚型50×103,β亚型60×103,故显影有两条带。与窦性心律组比较,房颤心律组CaMKⅡp286蛋白水平(0.812±0.227)显著增加(P < 0.05);PLBp17蛋白水平(0.649±0.354)也显著增加(P < 0.05);但PLB蛋白水平(0.886±0.364)显著减少(P < 0.05)。PLB调节的SERCA2a在两组表达差异无统计学意义。在PLB调节的SERCA2a表达无明显变化的情况下,PLB的减少会增加其活性。

A:Western blot检测结果;B~D:分别为CaMKⅡp286、PLBp17和PLB蛋白相对表达量a: P < 0.05, 与窦性心律组比较 图 2 两组心房组织相关蛋白的表达

3 讨论

本研究显示,房颤心律组CaMKⅡ的mRNA表达增加,磷酸化活化形式的CaMKⅡp286相对于窦性心律组增多,CaMKⅡp286能将PLB第17位点的苏氨酸磷酸化使五个PLB形成一个五聚体PLBp17[5],试验得出PLBp17在房颤心律组的表达同样增高,虽然PLB的mRNA表达增加,可能由于五聚体增多,房颤心律组心房肌细胞内的PLB单体含量相对于窦性心律组仍然显示减少。一般来讲,肌浆网钙泵(SERCA2a)利用三磷酸腺苷(ATP)水解产生的能量将钙离子从胞质中转运到肌浆网[6]。在心肌细胞中,受磷蛋白(phospholamban PLB)可以调控SERCA2a活性,当单体PLB与SERCA2a结合时可抑制其活性,减少钙离子泵入肌浆网,其调节蛋白钙调蛋白(CaMKⅡ)是细胞内一个重要的激酶,CaMKⅡ的增加会导致其自身发生第286位点的氨基自磷酸化即形成磷酸化活化的CaMKⅡp286[7],CaMKⅡp286能够使PLB17位点上的氨基磷酸化,使PLB形成PLBp17,PLBp17是由五个PLB单体形成的五聚体,而PLBp17五聚体则没有对SERCA2a的抑制作用[8-9]。PLB在调节SERCA2a的机制方面已有研究做了分子动力学试验进行了详细的证明[10]。研究表明,CaMKⅡp286使PLB磷酸化后,由于SERCA2a本身的表达并没有明显改变,通过减弱对SERCA2a抑制,使钙离子被过度泵回肌浆网,心肌舒张期的钙离子泄露和收缩期过多释放的钙离子引起细胞内钙超载,与各种包括房颤在内的心律失常的发生关系密切[11-12]。心肌缺血缺氧是房颤发生的原因之一[13],而在房颤时耗氧量会进一步增加,加重心肌缺氧。SERCA2a活动本身就是耗能的过程,当单体PLB减少时,对SERCA2a的抑制作用减弱时,SERCA2a活动的增加会加重细胞内缺氧。心房肌细胞的负担增加,这可能是加速心肌细胞凋亡的一个重要原因。心肌细胞凋亡后纤维化修复形成折返环,是房颤发生的重要机制[14]。还有相关研究发现,PLB通过增加钙离子从细胞质泵入核膜腔或者核周内质网腔,参与了细胞核内钙离子浓度的调节[15]。探讨机制的目的是利用其进行治疗,有学者已经开始通过动物实验使用药物干预PLB的磷酸化水平来改善大鼠的心肌功能和钙动力[16-17]

房颤的发生和维持是一个复杂的机制,既往众多的研究聚焦于肌成纤维细胞的激活及其分泌的细胞活性物质引起的心房重构。心房肌细胞本身的电生理以及活力的改变同样是心房重构的重要因素。PLB作为心肌细胞内调节钙离子重要的分子,其磷酸化调节以及表达的变化不但影响着心肌细胞的收缩机制,还影响着心肌细胞的生存。本研究结果表明在房颤发生时PLB的mRNA表达增多,其是否与房颤引起细胞的调节相关,仍有待进一步研究。调节PLB表达水平和磷酸化水平有望成为房颤心房重构治疗的新靶点。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201809032
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曹哲哲, 马瑞彦, 蹇朝, 唐富琴, 肖颖彬.
CAO Zhezhe, MA Ruiyan, JIAN Zhao, TANG Fuqin, XIAO Yingbin.
CaMKⅡ和PLB在房颤心房重构中的作用及意义
Roles and significance of CaMKⅡ and PLB in atrial remodeling in patients with atrial fibrillation
第三军医大学学报, 2019, 41(3): 243-246
Journal of Third Military Medical University, 2019, 41(3): 243-246
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201809032

文章历史

收稿: 2018-09-05
修回: 2018-12-08

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