2. 300052 天津,天津医科大学总医院骨科;
3. 300211 天津,天津大学天津医院脊柱一科
2. Department of Orthopedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin, 300052;
3. First Department of Spine, Tianjin Hospital of Tianjin University, Tianjin, 300211, China
随着糖皮质激素越来越多地被应用于自身免疫性疾病、严重感染和休克患者,糖皮质激素引发的并发症不容忽视,主要包括糖尿病、肥胖和继发性骨质疏松[1]。糖皮质激素诱发骨质疏松的主要表现是腰背或全身酸痛、脊柱变形和脆性骨折。流行病学调查显示,开始服用糖皮质激素的12个月内,因为骨质疏松发生脆性骨折的概率上升至20%,降低至维持剂量也依然存在脆性骨折风险[2],因此糖皮质激素诱发骨质疏松对患者日常工作和生活的影响是广泛而持续的。临床上常用治疗糖皮质激素诱发骨质疏松的药物为双膦酸盐、特立帕肽、地诺单抗等[3],但双膦酸盐副作用较多,如颌骨坏死,而特立帕肽和地诺单抗价格十分昂贵,难以满足患者的治疗要求。因此临床上急需一种毒副作用小且价格低廉的药物治疗糖皮质激素骨质疏松。二甲双胍是经典的口服降糖药,安全性好并可长期服用。体外研究证明[4],二甲双胍可通过调节细胞代谢降低细胞内ROS水平。SHI等[5]发现糖皮质激素可上调破骨细胞内ROS水平,增强破骨细胞形成和功能,这提示细胞内ROS可能作为GIOP的治疗靶点。因此我们尝试研究二甲双胍调节糖皮质激素诱发骨质疏松骨代谢作用及可能的机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料和试剂材料:96孔细胞培养板(美国Thermo Fisher公司),35 mm玻底培养皿(NEST公司)。试剂:α-MEM(美国HyClone公司),胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco公司),小牛血清(Calf serum,CS,Gibco公司),0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司),4%多聚甲醛组织固定液,地塞米松(DEXamethasone,DEX,美国Sigma Aldrich公司),二甲双胍(metformin,美国Sigma Aldrich公司),N-乙酰半胱氨酸(NAC,美国Sigma Aldrich公司),GAPDH抗体、AKT1抗体、p-AKT抗体、cleaved Caspase-3抗体和山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司,组织/细胞总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司),TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(DeadEndTM Fluorometric TUNEL System,美国Promega公司),细胞增殖毒性试剂盒(CCK-8)、RIPA蛋白提取试剂盒、ROS检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒等Western相关试剂(上海碧云天生物工程公司)。
1.2 细胞培养和处理选择小鼠骨细胞株(MLO-Y4),由天津市中西医结合骨科研究所冻存,将MLO-Y4细胞培养在具有5%FBS和5%CS的α-MEM中,100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素,预涂布鼠尾Ⅰ型胶原。将MLO-Y4细胞接种在25 cm2细胞培养瓶中,并在5%CO2和37 ℃的环境中生长。
1.3 细胞活力测定(CCK-8)使用细胞增殖活性检测试剂盒,按照说明书进行细胞活力测定。实验分3组:DEX(10 μmol/L)+二甲双胍(1 mmol/L)组、DEX(10 μmol/L)组和空白对照组,将细胞悬液接种在96孔板中(100 μL/孔),分别处理细胞后,将培养板放在培养箱培养(37 ℃,5%CO2的条件下),细胞贴壁后,在第0、1、2、3天,将CCK-8溶液加入到每个孔的细胞中,并在37 ℃下孵育4 h。酶标仪检测450 nm波长的光密度值,统计分析各组光密度值。
1.4 TUNEL染色检测细胞凋亡使用DeadEnd TM Fluorometric TUNEL System试剂盒按照说明书进行TUNEL染色。将MLO-Y4细胞以2×104/mL的密度接种在直径35 mm培养皿上,分为DEX(10 μmol/L)组,DEX(10 μmol/L)+二甲双胍(1 mmol/L)组,空白对照组。将细胞在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗涤后,用0.2%Triton X-100透化固定的细胞。然后使用来自试剂盒的平衡缓冲液在室温下将细胞平衡10 min。制备含有荧光素标记的核苷酸混合物和末端脱氧核苷酸转移酶的反应混合物,并将其施加到细胞上,在37 ℃培养箱中遮光孵育60 min,停止反应并用SSC溶液洗涤细胞。在用DAPI复染细胞核后,荧光显微镜下观察拍照。
1.5 细胞内活性氧测量使用ROS检测试剂盒测量MLO-Y4细胞内ROS水平。分为空白对照组,DEX(10 μmol/L)组,DEX(10 μmol/L)+二甲双胍(1 mmol/L)组,DEX(10 μmol/L)+NAC(10 mmol/L)组。将细胞接种在直径35 mm培养皿上,分别与DEX(1×10 μmol/L),DEX+二甲双胍,DEX+NAC温育24 h。然后用PBS洗涤细胞3次,将无血清培养基与10 mmol/L DCFH-DA探针加入细胞,在37 ℃下孵育60 min。用PBS洗涤细胞2次以除去未标记的DCFH-DA。然后通过激光共聚焦显微镜在488 nm的激发波长和535 nm的发射波长下记录DCF荧光的分布。
1.6 实时荧光定量PCR检测SOD2,Cat,Runx2,BMP-2 mRNA表达检测各组细胞酶氧化系统标志物SOD2,Cat mRNA和成骨标志物BMP-2,Runx2 mRNA表达水平。对于细胞酶氧化系统标志物SOD2,Cat mRNA表达分析,分别用DEX,DEX+二甲双胍,DEX+NAC处理骨细胞24 h,设置空白对照,对于成骨、破骨标志物BMP-2,Runx2 mRNA表达分析,分别用DEX,DEX+二甲双胍处理骨细胞24 h,设置空白对照。Trizol等试剂提取骨细胞总RNA,测定RNA浓度及纯度,逆转录为cDNA。实时PCR的引物如下:以GAPDH为内参,上游5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下游5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′;Runx2上游5′-CCTGAACTCTGCACCAAGTCCT-3′,下游5′-TCATCTGGCTCAGATAGGAGGG-3′;SOD2上游5′-TAACGCGCAGATCATGCA-GCTG-3′,下游5′-AGGCTGAAGAGCGACCTGAGTT-3′;BMP-2上游5′-AACACCGTGCGCAGCTTCCATC-3′,下游5′-CGGAAGATCTGGAGTTCTGCAG-3′;Cat上游5′-CGGCACATGAATGGCTATGGATC-3′,下游5′-AAGCC-TTCCTGCCTCTCCAACA-3′。反应体系为10 μL,反应条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s,共40个循环,PCR扩增检测SOD2,Cat,BMP-2,Runx2 mRNA水平表达,用2-ΔΔCt法统计分析相对表达量。
1.7 蛋白印迹杂交检测AKT信号通路相关蛋白表达分别用DEX(10 μmol/L),DEX(10 μmol/L)+二甲双胍(1 mmol/L)处理骨细胞,提取骨细胞总蛋白,将细胞裂解物以1 :4的比例用蛋白质上样缓冲液(5×)稀释,并在95 ℃加热持续5 min。将蛋白质提取物在15%Fast PAGE Plus预混凝胶上120 V分离1 h,并在200 mA下印迹转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上90 min。然后将膜用TBST中的5%脱脂奶粉封闭3 h。然后将PVDF膜与一抗4 ℃孵育过夜。随后,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在37 ℃下孵育1 h,每15 min冲洗3次。免疫反应条带在37 ℃持续1 h观察免疫反应条带。
1.8 构建GIOP动物模型选择3月龄成年雄性体质量匹配的Sprague Dawley (SD)大鼠。将SD大鼠完全随机分成3组,空白对照组,DEX组,DEX+二甲双胍组,每组6只,保持相同的标准条件;提供大约等量水和食物。GIOP模型通过每天肌内注射DEX 21 mg/kg建立,持续4周。为了研究二甲双胍对DEX诱导的骨质疏松症的影响,先肌内注射DEX,然后胃饲二甲双胍2 mg/(10 g·d)来干预产生GIOP的大鼠。治疗4周后,进行显微CT扫描评估各组胫骨平台内的骨组织结构变化。
1.9 小动物micro-CT分析用西门子(德国柏林)制造的Inveon Micro PET/CT在80 kV的电压和500 mA的电流下扫描胫骨平台,从股骨头顶部到股骨干的整个扫描长度为20 mm,空间分辨率为10 mm。使用Inveon分析工作站重建3-D结构。感兴趣区域(ROI)被确定为与近端骨骺中的皮质表面和骨骺线相邻的不规则解剖学轮廓。通过自动追踪手动分离皮质骨和松质骨;使用阈值函数区分骨小梁和骨髓。计算骨体积分数(BV/TV),骨表面积/骨体积(BS/BV),骨小梁厚度(TB.TH),骨小梁数量(TB.N),骨小梁分离度(TB.SP)和骨小梁模式因子(TB.PF)。
1.10 统计学分析实验重复至少3次,数据以x±s表示。采用单因素方差分析比较多组间差异,SNK检验比较两组间差异。使用SPSS 19.0进行统计学分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 二甲双胍可促进MLO-Y4细胞增殖通过细胞增殖活性实验检测MLO-Y4细胞株的增殖情况,与空白对照组相比,24 h内DEX组骨细胞增殖活性降低50%,差异有统计学意义(P < 0.05,图 1),而DEX+二甲双胍组骨细胞增殖活性与空白对照组无明显差异。
2.2 二甲双胍可抑制MLO-Y4细胞凋亡
通过TUNEL染色观察DEX,DEX+二甲双胍,空白对照组的细胞凋亡数量。与空白对照组比较,DEX处理后可见细胞凋亡数量明显增加(图 2A),但合并二甲双胍处理骨细胞凋亡数量则不明显。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达,与空白对照组相比,DEX组Caspase-3蛋白表达增多(图 2B),而合并二甲双胍处理Caspase-3蛋白表达则不明显。因此二甲双胍可抑制DEX的促进骨细胞凋亡作用。
2.3 GIOP过程中酶抗氧化防御系统功能
DCFH-DA荧光探针染色骨细胞内ROS显示,与空白对照组相比,DEX处理后骨细胞内ROS明显增多(图 3A),而DEX+二甲双胍和DEX+NAC两组间骨细胞内ROS均较少。RT-PCR检测SOD2和Cat mRNA表达显示,DEX组SOD2和Cat mRNA相对表达量显著低于其余3组,差异有统计学意义(P < 0.05,图 3B)。表明外源性糖皮质激素会导致细胞酶抗氧化防御系统功能降低,而合并应用抗氧化剂NAC或二甲双胍均能恢复细胞酶抗氧化防御系统功能。
2.4 二甲双胍通过AKT信号途径挽救DEX处理对骨细胞增殖凋亡和成骨活性的影响
通过Western blot检测各组MLO-Y4细胞中AKT通路效应蛋白的表达水平,结果显示,DEX组p-AKT蛋白表达较空白对照组明显降低(图 4A),而合并二甲双胍则与空白对照组无明显差异。另一方面,通过RT-PCR检测Runx2,BMP-2 mRNA相对表达量,对于破骨标志物Runx2,DEX组较空白对照组增加47%(图 4B),差异有统计学意义(P < 0.05),DEX+二甲双胍组与空白对照组无明显差异。对于成骨标志物BMP-2,DEX组较空白对照组降低69%,差异有统计学意义(P < 0.05),DEX+二甲双胍组与空白对照组无明显差异。因此二甲双胍可抑制DEX对骨细胞成骨及破骨活性作用。
2.5 大鼠GIOP模型中二甲双胍促进成骨作用
micro-CT断层扫描显示,与正常大鼠相比,长期给予DEX干预的大鼠骨小梁稀疏短小,而空白对照组和DEX+二甲双胍组大鼠骨小梁则相对长而致密(图 5)。micro-CT分析骨结构参数结果显示,与空白对照组相比,DEX组的显微结构参数TB.TH,BV/TV和TB.N显著降低(P < 0.05,图 6),但合并应用二甲双胍则与空白对照组相比无明显变化。此外,与空白对照组相比,二甲双胍可抑制DEX组中TB.SP的参数显著增加(P < 0.05)。
3 讨论
糖皮质激素诱发的骨质疏松症是最常见的一种继发性骨质疏松症。由于糖皮质激素普遍应用于骨质疏松风险较高的中老年群体,因此糖皮质诱发骨质疏松在中老年患者中尤为常见。每年GIOP和其导致并发症的治疗负担数额巨大。外源性糖皮质激素可以促进成骨细胞和骨细胞凋亡,且上调RANKL因子,募集并激活破骨细胞,促进骨吸收且抑制骨形成[1]。KOUFALI等[6]发现糖皮质激素可激活线粒体内糖皮质激素受体,影响线粒体氧化、膜电位和钙保持能力,从而影响整个细胞的功能。ROS是需氧细胞代谢过程中产生的活性氧簇,通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。SHI等[5]发现外源性糖皮质激素可升高细胞内ROS水平,且细胞内ROS水平增高影响骨细胞增殖功能和破骨细胞介导骨吸收。因此降低骨组织细胞内ROS水平可能降低糖皮质激素对骨代谢的影响。
临床常用治疗GIOP药物为双膦酸盐、地诺单抗和特立帕肽。双膦酸盐虽然价格适中,易被患者接受,但其导致颌骨坏死等副作用不容忽视;地诺单抗和特立帕肽价格昂贵,很难推行到所有患者,因此需要寻求一种疗效好,毒副作用小,价格易于接受的新药。二甲双胍是经典的口服降糖药,安全性好,可长期服用。近年来有研究证实二甲双胍具有抗肿瘤、抗肾病、改善血脂、改善非酒精性肝病肝功能等多方面作用[7]。关于二甲双胍药理作用的分子机制,以往研究推断二甲双胍可能升高细胞内AMP转化为ATP的比例,激活AMPK通路,而AMPK通路能协调多个与细胞能量平衡相关的关键通路[4]。RABINOVITCH等[8]证明线粒体内ROS是AMPK蛋白的活化剂,但AMPK蛋白活化将限制线粒体内ROS产生。另一方面,二甲双胍可促进骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化,并促进成骨细胞增殖,抑制其凋亡[9-10]。但内在的作用机制研究尚少。
ROS在成骨细胞凋亡和破骨细胞生成中起着至关重要的作用[11]。ALMEIDA[12]证明外源性糖皮质激素增加细胞ROS并导致骨细胞凋亡。本研究中DCFH-DA探针荧光染色显示,DEX处理骨细胞后细胞内ROS增多,而二甲双胍可降低DEX引起的ROS水平增高,且与空白对照组细胞内ROS水平无明显差异,并且TUNEL染色显示地塞米松合并二甲双胍处理的骨细胞凋亡数量与空白对照组无明显差异。因此本研究表明,二甲双胍可抵消地塞米松导致的骨细胞凋亡和细胞内ROS升高。
PI3K/AKT信号通路是一条存在于真核生物中高度保守的信号通路,通过磷酸化一系列细胞内蛋白介导下游反应,这些反应包括细胞存活、生长、增殖、细胞迁移和血管生成。许多药物均可通过激活PI3K/AKT信号通路促进成骨细胞增殖[13-14]。有研究显示miR-216a能够通过PI3K/AKT信号通路促进成骨细胞增殖和成骨,逆转DEX抑制成骨作用[15]。多项研究表明DEX可抑制骨细胞内AKT通路,调控细胞增殖和凋亡[16-17]。本研究结果显示DEX处理后,骨细胞内AKT蛋白表达降低,细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3升高,而复合二甲双胍处理则与空白对照组无明显差异。我们的研究表明,二甲双胍能够抵消DEX处理对AKT通路的影响,并可能影响DEX对骨组织细胞增殖凋亡的调控作用,进而影响骨代谢。我们的体内实验研究也为二甲双胍治疗GIOP提供了一定依据。micro-CT结果显示,给予DEX干预会导致骨结构参数TB.TH、BV/TV和TB.N显著降低,而复合二甲双胍后这些参数与空白对照组则无明显差异。因此,二甲双胍能够通过影响骨代谢改善出现骨质疏松的骨组织结构。
综上所述,本研究从细胞内ROS水平和AKT通路调控方向研究二甲双胍的治疗作用机制,结果表明二甲双胍可降低细胞内ROS水平和激活AKT通路,为二甲双胍应用于临床治疗GIOP提供了依据。然而本研究还存在一些局限性:仅采用地塞米松复合二甲双胍干预骨细胞和大鼠,后期还应选择靶向抑制AKT通路蛋白,有针对性的研究二甲双胍对AKT通路的具体作用机制。另一方面,只研究了二甲双胍对骨细胞内AKT通路的影响。多项研究表明,二甲双胍可以作用于细胞内多种通路,产生的影响也不仅限于骨细胞增殖、凋亡和调节骨代谢[4]。因此,还需要更深入阐明其内在机制。
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