由椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease, DDD)所引起的腰腿痛(low back pain, LBP)是一种极为常见的中老年疾病，它具有高患病率和高发病率的特点[1]。椎间盘退行性疾病表现为椎间盘细胞活性降低、细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)成分减少以及机械负荷异常。细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)成分减少主要表现为髓核蛋白多糖和水分含量的损失，它具有遗传易感性[2-3]。DDD的治疗主要有外科手术治疗和保守治疗，外科手术治疗通常做所涉及相应水平的椎间盘切除或融合，保守治疗通常为物理治疗和药物治疗。保守治疗效果欠佳，外科手术能够缓解很多患者的症状，但会导致相邻节段不可逆的功能丧失[4]。因此，椎间盘移植和制作假体植入为外科手术治疗DDD的新思路。椎间盘移植和制作假体的植入目前仅在人体外的研究中实施，最近，全椎间盘置换术和椎间盘假体已显示出可喜的效果，但这些植入物的长期性能尚未明确[5-6]。人工合成材料所制作的椎间盘，很难模仿天然椎间盘的生物力学性能，利用分子、基因、细胞技术以及组织工程技术等生物学方法制成椎间盘成为目前研究的热点[7-8]。
组织工程髓核是研究种子细胞和髓核支架材料结合的技术。髓核细胞、脊索细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊水细胞等作为种子细胞，在以往的组织工程髓核研究中取得了一定的成绩[9-12]。有报道指出，滑膜干细胞具有天然向软骨细胞分化的潜力，能够自主分泌胶原蛋白以及蛋白多糖等细胞外基质，可能存在有利于细胞生长、分化的成分[13-14]。组织工程髓核支架的主要功能是模拟人体正常髓核组织的生物环境，为种子细胞的粘附、增殖、基因表达和蛋白质合成提供良好基础。基于以上考虑，我们获取滑膜干细胞，在体外扩增并收集细胞外基质，制成组织工程髓核支架，然后植入种子细胞进行常规培养，构建组织工程髓核，以期具有天然髓核组织的外形和功能。
1 材料与方法 1.1 实验材料和实验分组收集干细胞外基质并制备若干脱细胞细胞外基质(decellularized stem cell matrix, DSCM)，将滑膜干细胞(synovium-derived stem cells, SDSCs)接种至DSCM进行体外培养，分为空白组(DSCM)、实验组(SDSCs-DSCM)和对照组(正常髓核)。
1.2 实验动物和主要试剂成年新西兰大白兔5只，6月龄，体质量为2.0~2.5 kg，购自重庆医科大学实验动物中心；DMEM/F-12(1 :1)培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；常规细胞培养液为含有10%胎牛血清的DMEM/F-12(1 :1)的培养基；小鼠抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)-细胞表面抗原决定簇(CD)29、FITC-CD90抗体购自美国Abcam公司；小鼠抗兔FITC-lgG抗体购自美国Santa公司；CollagenⅡ与Aggrecan荧光免疫组化试剂盒购自南京建成生物科技研究所。
1.3 SDSCs的体外分离与培养无菌条件下获取兔膝关节滑膜组织，经消化、过滤后提取原代细胞，接种到25 mL塑料培养瓶内放入培养箱常规培养；经3 d半量换液、5 d全量换液后每3天换液，细胞长满培养瓶底面积后消化、传代，在倒置显微镜下观察。
1.4 SDSCs表面抗原的流式鉴定获取第3代SDSCs，经消化、固定、洗涤等过程，制成1×107/mL的细胞悬液；取EP管，加入100 μL细胞悬液后，分别加入20 μL小鼠抗兔FITC-lgG(同型阴性对照)、FITC-CD29、FITC-CD90抗体，混匀并在37 ℃的恒温箱中孵育1 h；加入100 μL PBS液混匀、离心、弃上清液，然后加入200 μL PBS液混匀后送流式细胞仪检测。
1.5 材料预处理将预制备好的支架经无菌处理后放入无菌PBS液中浸泡24 h，之后在含有50%胎牛血清的LG-DMEM培养液中浸泡24 h，800 r/min离心5 min，小心吸取多余培养液。将支架覆盖在12孔培养板的底表面，置入培养箱中孵化1 h，种植生长良好的第3代SDSCs细胞(2×102/cm2)，放入培养箱常规培养，每2~3天换液。分别在7、21 d取实验组进行相关指标的检测。
1.6 实验组大体观察、电镜观察常温下，肉眼观察实验组培养7 d的大小、外形、色泽、透明度，并与对照组髓核进行对比，光镜下观察实验组的形态、大小、透亮度；实验组培养7、21 d后，取空白组(n=3)及实验组(n=3)样本经2.5%戊二醛固定12 h，脱水，真空干燥，喷金，SEM观察。
1.7 HE染色及免疫组化各组随机选取3个样本，多聚甲醛浸泡过夜，经脱水、包埋、切片、脱蜡、苏木精染色、分化、伊红染色、脱水透明过程，完成HE染色流程；样本经抗原修复，加CollagenⅡ、Aggrecan一抗及二抗，DAB染色过程完成免疫组织化学处理，光镜下观察。
1.8 实时定量PCR(qRT-PCR)检测获取各组不同培养时间点CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA样本，经提取、逆转录过程，行qRT-PCR检测。
1.9 压缩载荷检测取实验组(n=5)及对照组(n=5)样本在PBS中浸泡8 h后取出，滤纸吸干表面体，置于压缩载荷测试机进行抗压缩性能测试，加载速度为1 mm/min，重复测试5次，在相同压缩位移条件下比较两组的载荷均值。
1.10 统计学处理实验数据采用SPSS 13.7软件进行处理，计量资料用x±s表示。方差齐，数据比较用两独立样本t检验；方差不齐，采用非参数检验。检验水准：α=0.05(双尾)。
2 结果 2.1 SDSCs的形态观察及流式鉴定倒置显微镜下观察显示，第3代SDSCs形态呈长梭形，呈不均匀漩涡状生长，杂细胞较少；第3代SDSCs经流式鉴定表面抗原表达CD29、CD90阳性，见图 1。
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| A：第3代SDSCs活细胞光镜下观察(×200)；B、D：第3代SDSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达；C：第3代SDSCs HE染色观察(×200) 图 1 第3代SDSCs活细胞光镜下观察以及CD29、CD90流式鉴定 |
2.2 DSCM大体观、电镜观察
大体观显示，DSCM呈半透明状态，大小、形态与正常髓核相似。DSCM电镜下见材料纤维分布不规则，有一定的孔隙率及孔径大小，接种细胞7 d后可见种子细胞在支架表面及内部粘附，近似球形，同时支架表面细胞密度比横截面高；21 d后种子细胞呈不规则扁平状，可见细胞外基质分泌(图 2)。
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| A：肉眼下SDSCs-DSCM(箭头示)与正常髓核观察；B、C：SDSCs-DSCM与正常髓核光镜观察(×100)；D~F: DSCM(×600)、SDSCs-DSCM 7 d(×1 000)、DSCs-DSCM 21 d(×300)电镜观察，箭头示细胞外基质 图 2 肉眼、光镜及扫描电镜(SEM)观察材料和细胞的形态特征以及两组内部结构和细胞粘附情况 |
2.3 HE染色及免疫组化观察
HE染色观察显示，空白组基质染色较淡，蓝色胞核颗粒残留较少；实验组7 d后外侧基质较深，21 d后染色均匀，较对照组稍浅，可见蓝色深染胞核；对照组细胞外基质结构清晰，染色均匀；CollagenⅡ、Aggrecan免疫组化荧光染色结果显示，空白组和实验组7 d均可见少量荧光；实验组21 d和对照组荧光较多(图 3)。
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| 图 3 HE染色及荧光免疫组化染色观察材料内部细胞分布情况(×200) |
2.4 qRT-PCR检测结果
DSCM空白组未提取到RNA，SDSCs-DSCM实验组的CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA表达量随时间递增(P < 0.05)，但均低于对照组(表 1)。
| 基因 | 实验组7 d | 实验组21 d | 对照组 |
| CollagenⅡ | 0.368±0.165a | 0.543±0.038a | 0.594±0.076 |
| Aggrecan | 0.198±0.131a | 0.388±0.036a | 0.444±0.068 |
| a：P < 0.05，与对照组比较 | |||
2.5 压缩载荷测定结果
在湿润预处理状态下，将DSCM支架与正常髓核的压缩载荷均值进行比较。结果显示：在相同位移条件下，DSCM压缩载荷为(0.759±0.047)MPa，正常髓核为(0.724±0.035)MPa，差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论正常的髓核组织通常含有较多的基质成分，如CollagenⅡ、Aggrecan等，它是维持椎间盘弹性、脊柱稳定性的关键，故组织工程髓核中所选用的种子细胞必须能够增殖，表达CollagenⅡ、Aggrecan等基质成分。通常情况下，髓核细胞分离较为困难，增殖相对缓慢，而SDSCs来源相对较广，易提取，具有天然分化为软骨细胞的潜力，与脊索细胞的功能相似[15]。qRT-PCR检测结果表明，SDSCs的CollagenⅡ及Aggrecan mRNA表达量随培养时间延长而递增，但在研究周期内，与正常髓核相比，有一定差别，这可能需要进一步优化实验操作以及进行更深入的研究。
DSCM复合体在细胞外基质成分、压缩载荷与正常髓核相近。在研究周期内，DSCM-SDSCs复合体组织结构与正常髓核相似，CollagenⅡ和Aggrecan表达量逐渐接近于正常髓核。SEM下可见种子细胞在支架表层及横截面均有分布；HE染色结果显示，种子细胞随培养时间的延长，逐渐增殖并向内部迁移。同时，抗压缩载荷检测显示，DSCM支架与正常髓核在相同位移条件下的压缩载荷均值相近。
理想的组织工程支架材料要求有适合的孔径大小和孔隙率[16-17]。在SEM下观察显示，早期DSCM表层种子细胞多且集中，横截面细胞少且不均匀，这表明，DSCM表面、浅层结构的孔隙率及孔径大小与中心区域分布相对不合理，这对种子细胞均匀的迁移至髓核中心是不利的，提示我们需要进一步优化DSCM的制作。因此，探究表面、浅层结构与中心区域孔隙率及孔径理想的分布规律，是今后进一步研究的重要方面。此外，本研究尚无法判断DSCM本身对种子细胞有无诱导分化作用，仅在体外无菌环境下对去细胞基质构建组织工程髓核进行了初步的研究。
综上所述，本研究将DSCM与SDSCs复合，体外构建组织工程髓核，同时设置空白DSCM与正常髓核分别作为空白对照和正常对照，测定DSCM-SDSCs复合体的各项指标。结果表明，体外培养的DSCM-SDSCs复合体在大体形态、功能以及组织学上接近于正常髓核，这为今后更深入的动物体内实验及后续的临床研究提供参考。
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