阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是常见的中枢神经系统疾病，发病率和致残率高，严重影响中老年人的生活质量。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子家族中的一员，具有促进细胞增殖、分化和存活，促进长时程增强，促进突触生长、突触传递以及可塑性等作用[1-2]。而脑源性神经营养因子前体(brain-derived neurotrophic factor precursor，proBDNF)的作用与BDNF的作用截然相反[3-5]。研究表明proBDNF和BDNF广泛分布于中枢神经系统，老龄以及AD前期脑内BDNF水平降低，proBDNF含量明显升高，推测BDNF/proBDNF比例失调参与了AD发病[4]，然而其具体作用及机制尚未完全阐明。为此，本实验采用AD鼠右侧侧脑室定向注射携带有proBDNF基因的腺相关病毒基因整合载体(AAV-proBDNF)，观察AAV-proBDNF在AD鼠脑内表达情况及其对AD鼠海马齿状回神经元前体细胞微管相关蛋白(doublecortin，DCX)阳性细胞数和突触后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)表达的影响。
1 材料与方法 1.1 动物及分组采用转基因阿尔茨海默病模型小鼠(AD鼠，APPswePS1dE9，雌性，5月龄，体质量28~32 g)15只，采用抛硬币法随机分为3组，每组5只。①正常对照组：右侧侧脑室注射生理盐水；②空载体对照组：右侧侧脑室注射空病毒载体量；③AAV-proBDNF组：右侧侧脑室注射AAV-proBDNF。AAV-proBDNF由本科王延江教授提供。
1.2 AAV-proBDNF右侧侧脑室注射腹腔注射6%水合氯醛麻醉小鼠，置于立体定位仪(Stoelting公司，美国)平台上，将小鼠头部固定于水平位，头顶剪去毛发，用碘伏消毒头部皮肤，沿正中线纵向切开皮肤约1.5 cm暴露囟门周围颅骨。以囟门为中心，定位坐标点：前后0.6 mm，右侧旁开1.2 mm。使用牙科钻钻颅。再次定位后以深度2.3 mm进行穿刺，注射位置即为右侧侧脑室。AAV-proBDNF组微量注射AAV-proBDNF(4 μL, 2×1013v.g./mL)，空载体对照组微量注射AAV 4 μL，正常对照组采用同法注射生理盐水4 μL，微量注射速度为0.5 μL/min，注射结束后缓慢拔出注射针，完成微量注射后进行缝合。术后继续观察30 min，动物无异常后按1只/笼继续饲养。
1.3 海马组织取材各组AD鼠侧脑室注射后4周取材。过量麻醉处死动物(10%水合氯醛按0.01 mL/g腹腔注射)，并常规灌注、海马取材，其中左侧海马用于免疫组化检测DCX阳性细胞，右侧海马于液氮中研磨后等份分装分别用于proBDNF含量测定和PSD-95测定。
1.4 ELISA法测定海马区proBDNF含量取分装后的右侧海马组织，超声破碎和匀浆，12 000 r/min离心10 min，取上清待测。根据proBDNF Rapid ELISA Kit(Biosensis公司，澳大利亚)说明书进行proBDNF浓度测定：梯度稀释proBDNF标准品，按100 μL/孔分别加入梯度标准品和待测样品，封板膜封板后置于摇床上(140 r/min，45 min)。甩去板孔内液体，200 μL/孔洗涤液清洗5次，100 μL/孔加入生物素化检测抗体，封板膜封板置于摇床上(140 r/min，30 min)。洗涤液洗板(200 μL/孔，5次)，加入链霉亲和素-HRP复合物(100 μL/孔)，摇床上摇匀(140 r/min，30 min)。再次使用洗涤液清洗板孔(200 μL/孔，共5次)，加入100 μL TMB至每孔，4~8 min后加入终止液(100 μL/孔)。酶标仪检测波长450 nm处光密度值[D(450)]。计算浓度以及脑组织质量比浓度。
1.5 免疫组化检测海马DCX阳性细胞取左侧海马组织，福尔马林固定、蔗糖脱水后行冠状冰冻切片，每张切片厚度40 μm，每隔6张取1张切片，取其中1套(约8张含海马结构)进行免疫组化染色并计数，累加后乘6即为一侧海马齿回总的DCX阳性细胞数。3%H2O2室温孵育5~10 min；血清封闭30 min，兔DCX抗体(1：200，Abcam公司，英国)4 ℃孵育过夜；抗兔IgG生物素标记二抗溶液(1：500，Abcam公司，英国)室温孵育2 h；加入ABC(1：200)，室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察并及时终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片阴干后镜下观察拍照、细胞计数。
1.6 Western blot检测海马PSD-95表达水平取分装右侧海马组织，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，冰上裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清，采用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，美国)测定其蛋白浓度，加入Loading Buffer，100 ℃煮3~5 min，制成样品4 ℃保存待用。采用SDS-PAGE电泳，NC膜(MilliPore公司，美国)转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃过夜，一抗为兔多克隆PSD-95抗体(1：500，Santa Cruz公司，美国)及鼠β-actin(1：1 000，Sigma公司，美国)。二抗为IRDye 800CW荧光抗体(1：1 000，Licor公司，美国)。采用Odyssey Imaging System进行扫膜显影，利用Image J软件计算PSD-95和β-actin灰度值，用PSD-95/β-actin比值代表PSD-95的相对含量。
1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 AAV-proBDNF在AD鼠海马的表达侧脑室注射后4周，AAV-proBDNF组AD鼠海马proBDNF在4周时表达水平达到高峰，明显高于正常对照组(P < 0.01)。而空载体对照组AD鼠海马proBDNF表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义，但显著低于AAV-proBDNF组(P < 0.05，图 1)。
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| a：P < 0.01，与正常对照组比较；b：P < 0.05，与空载体对照组比较 图 1 AAV-proBDNF侧脑室注射前后海马proBDNF的含量 |
2.2 AAV-proBDNF对AD鼠海马齿回DCX阳性细胞的影响
采用DCX标记海马区齿状回新生的神经元。结果显示(图 2)：DCX阳性细胞大部分位于颗粒细胞层与门区之间，即海马下颗粒层区，细胞紧密排列、成簇出现，位置越偏向颗粒细胞层，胞体形态越接近颗粒细胞。AAV-proBDNF组海马DCX阳性细胞数为(202.46±24.27)，明显低于正常对照组(382.26±37.58，P < 0.05)和空载体对照组(365.48±32.68，P < 0.05)。
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| A：正常对照组；B：空载体对照组；C：AAV-proBDNF组 图 2 AAV-proBDNF对AD鼠海马齿状回DCX阳性细胞数的影响(SABC) |
2.3 AAV-proBDNF对AD鼠海马区PSD-95表达的影响
Western blot检测正常对照组、空载体对照组与AAV-proBDNF组AD鼠脑内海马区PSD-95的表达情况，结果显示：AAV-proBDNF组海马PSD-95相对含量明显低于正常对照组和空载体对照组(P < 0.05，图 3)。
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| A：Western blot检测；B：半定量分析a：P < 0.05，与AAV-proBDNF组比较 图 3 AAV-proBDNF对AD鼠海马PSD-95表达的影响 |
3 讨论
BDNF是神经营养因子家族中重要的一员，它广泛分布于中枢神经系统。BDNF首先是以前体蛋白proBDNF的形式由细胞合成和分泌，proBDNF再进一步被细胞内弗林酶、前体蛋白转化酶，或是细胞外血浆纤维溶酶和基质金属蛋白酶-9等裂解产生成熟BDNF和proBDNF前片段pro-domain[6-7]。近年研究表明proBDNF不只是BDNF的前体，本身具有与BDNF相反的作用。proBDNF对神经元的重塑、突触传递和突触可塑性具有负性调控作用[8]，proBDNF通过与p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)、sortilin结合形成功能三聚体，从而抑制新生小鼠小脑颗粒细胞的增殖、迁移[3, 9]。同时，proBDNF在多种神经精神类疾病，如精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、长期慢性压力等的发生与进展中发挥重要调控作用[10]。我们前期研究表明：proBDNF与p75NTR结合后降低海马神经发生、促进脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积，进而引起小鼠学习与记忆缺陷[11-12]，说明proBDNF可能参与AD的发生发展过程。
以往关于proBDNF功能的研究中，大多采用外源性抗裂解proBDNF进行干预研究，不能如实反映内源性proBDNF的功能。本实验将腺相关病毒(AAV)和点突变proBDNF进行基因整合形成重组基因载体AAV-proBDNF，采用侧脑室注射的方式将AAV-proBDNF转导神经细胞以表达抗裂解proBDNF。结果表明：给予AAV-proBDNF后，AD鼠脑内proBDNF表达明显上升，在注射后4周达高峰，高于空载体对照组，说明AAV-proBDNF在AD鼠脑内转染表达成功。为探讨proBDNF在AD发病中的作用，本实验进一步观察AAV-proBDNF侧脑室注射4周后，AD鼠海马神经元增殖以及突触可缩性的变化。
成年海马神经发生与学习、记忆等密切相关，齿状回颗粒下层(subgranular zone，SGZ)是神经发生的重要部位之一，而老龄以及AD患者海马神经发生能力明显下降[13]。DCX是一种微管结合蛋白，在中枢神经系统成长过程中高度表达，神经元前体细胞DCX的表达被视为成年神经发生的标志。因此，本实验选用DCX作为海马神经干细胞向神经元分化的标志，并通过向AD小鼠侧脑室注射AAV-proBDNF来观察海马神经发生的变化。结果表明：给予AAV-proBDNF后，AD鼠海马齿状回颗粒下层区中的DCX阳性细胞数明显减少。这可能是SGZ区神经元前体细胞减少所致，表明侧脑室注射AAV-proBDNF后AD鼠海马齿状回颗粒细胞增生受到一定抑制。
PSD-95属于突触后致密区核心构架蛋白，具有调节、聚合受体，稳定突触连接结构，传导膜受体信号的作用，是突触可塑性及皮质和海马神经元LTP的主要调控者，在学习和记忆的调控中起重要作用，敲除PSD-95基因可引起小鼠LTP的改变和学习记忆功能障碍[13]。PSD-95还通过不同结构域与其他蛋白相互作用，在介导和整合N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl- D-aspartate receptors，NMDARs)信号转导中具有关键作用，对记忆形成和信息传递起着重要作用[14]。而本实验结果表明：侧脑室注射AAV-proBDNF后AD鼠海马内PSD-95含量较对照组明显降低，提示其神经突触后兴奋性传递水平降低，proBDNF可能通过降低海马内PSD-95的表达，进而降低AD鼠学习记忆功能。
本实验采用立体定位的方法进行AD鼠侧脑室定向微量注射AAV-proBDNF，观察AAV-proBDNF在AD鼠海马的表达情况，以及对AD鼠海马区DCX阳性细胞数和PSD-95表达的影响，结果表明：AAV-proBDNF在AD鼠脑内成功转染并表达proBDNF，proBDNF不仅抑制海马齿状回新生神经元的产生，而且抑制海马PSD-95表达。表明proBDNF对海马神经发生和突触可塑性具有重要的负性调控作用，参与AD的发病机制。其机制可能与proBDNF促进脑内Aβ沉积有关[12]，但其具体机制有待进一步研究。
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