随着白内障超声乳化手术、角膜移植等治疗技术的普及,白内障和角膜盲这两类主要的致盲性眼病逐步被攻克,而老年性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和青光眼等视网膜视神经变性类疾病成为威胁人类视力健康的主要疾病。该类疾病的共同特点是:视网膜中的关键细胞(如感光细胞、视网膜色素上皮细胞和神经节细胞)变性、死亡,患者的视功能逐渐丧失至失明。由于变性和凋亡的神经细胞不能再生,干细胞移植成为目前最具前景的治疗策略[1]。
胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)、诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)或器官特异性干细胞(又称成体干细胞)来源的各种视网膜细胞具有在视网膜视神经变性模式动物内部分再生,并挽救视功能的能力。在更为精进的移植策略中,用于治疗RP的理想细胞为视网膜祖细胞(retinal progenitor cell, RPC)或感光前体细胞(photoreceptor precursor)[2],而用于治疗AMD的理想细胞为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞。2012年,美国先进细胞公司(advanced cell technology, ACT, 后改名为Astellas公司)在国际上首次开展了人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)移植治疗AMD和青少年黄斑变性(又称Stargardt病黄斑变性)的临床试验,初步证明了干细胞治疗视网膜疾病的临床安全性[3]。国际上先后有美国、中国、日本、英国等报道了相关临床试验结果,极大地推动了干细胞转化医学的发展。本文对这些临床试验进行总结,并分析下一步的发展方向。
1 干细胞来源的RPE细胞移植治疗黄斑变性黄斑的结构与功能决定了人类中心视力的质量,黄斑变性则直接导致中心视力的丧失,引起失明。目前,AMD成为发达国家老年人失明的主要因素。我国的流行病学调查表明,50岁以上的老年人群中,早期和晚期AMD的发病率约为9.5%和1.0%[4]。晚期AMD分为湿性AMD(wet AMD, 表现为黄斑下新生血管膜形成,导致RPE细胞功能丧失)和干性AMD(dry AMD,表现为黄斑区视RPE细胞萎缩),其中,湿性AMD在中国AMD人群中占比超过80%[4-5]。尽管抗新生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor drugs, VEGF)眼内注射对湿性AMD的治疗效果显著,但视网膜下新生血管膜一旦形成,或者治疗频次下降,PRE细胞仍逐渐丢失。因此,移植健康RPE细胞成为晚期AMD患者的治疗策略之一。
我们通过检索文献和查阅国际临床试验中心注册信息及国际会议的报道,发现有5个研究团队致力于干细胞来源的RPE移植治疗干性AMD和湿性AMD的临床试验。2012年和2015年,SCHWARTZ等[3]首次开展了hESC-RPE细胞悬液移植治疗9例干性AMD及Stargardt患者的临床试验(NCT01345006和NCT01344993)。随后,他们和韩国的SONG等[5]在亚洲人群中进行了4例干性AMD的临床试验(NCT01625559和NCT01674829)。2017年,日本RIKEN研究中心的MANDAI等[6]开展了自体iPSC-RPE细胞生物膜治疗1例湿性AMD的临床试验(UMIN000011929),也是国际上首例来源于患者自体iPSC的临床试验。2018年,英国伦敦大学学院DA CRUZ等[7]开展了2例hESC-RPE生物膜治疗湿性AMD的临床试验(NCT01691261)。同年,我们团队报道了hESC-RPE细胞悬液治疗3例湿性AMD的临床试验(NCT02749734)[8]。ACT公司和英国伦敦大学学院联合开展了12例hESC-RPE移植治疗青少年黄斑变性(Stargardt遗传性眼病)临床试验[9]。综合看来,同种异体ESC-RPE细胞悬液及细胞生物膜移植术后均进行了至少4个月的抗排斥反应治疗,在术后1年的随访中,无严重并发症,频域光学相干断层扫描(spectral domain ocular coherence tomography, SD-OCT)能检测到移植细胞的存在,受试者视力有不同程度的提高。而自体iPSC-RPE细胞生物膜移植试验没有使用免疫抑制剂,1年随访未发现排斥反应,受试者视力维持术前水平。这一系列的临床试验初步证明了干细胞来源的RPE细胞移植的安全性。整个临床试验包括以下3个关键性环节。
1.1 符合质量标准的干细胞来源的RPE细胞用于临床试验的RPE细胞,无论从ESC还是iPSC诱导,都需在严格审核的GMP细胞培养间培养,培养合格的RPE细胞要达到以下关键性标准[3, 7-8, 10]:①细胞呈典型的六角形生长,移植前每个细胞的黑色素含量至少高于4.1 pg,流式细胞术检测主要的RPE蛋白标志物MITF、ZO-1、Bestrophin-1、REP-65和CRALBP的阳性率高于99%。mRNA检测胚胎干细胞相关标志物OCT4、Nanog和Sox2较ESC细胞低至少100倍。②RPE细胞功能性指标合格,包括吞噬感光细胞外节的功能检测以及细胞膜上的Na+/K+-ATP酶检测,均达到成体RPE细胞功能水平。③体外成瘤实验合格:将干细胞来源的RPE细胞注射到裸鼠眼内或皮下,随访至少3个月,无畸胎瘤产生。④动物实验证实干细胞来源的RPE细胞移植疗效的稳定性和持续性:将细胞移植到RP大鼠模型——外科皇家学院(royal college of surgeons, RCS)大鼠视网膜下,在移植后的12周,在受试大鼠视网膜中仍能观察到移植细胞的存活,同时闪光视网膜电图检测到受试动物的视功能受到保护。
1.2 干细胞来源的RPE细胞移植治疗黄斑变性的临床质量控制适合进行干细胞来源的RPE细胞移植治疗的主要病种是老年性黄斑变性(干性或湿性)和青少年黄斑变性,临床手术的关键环节主要包括以下3个方面:①受试者身体素质合格,眼部排除其他疾患。对于老年患者,要特别注意能否耐受免疫抑制剂的长期应用。②移植细胞的数量及移植生物膜的面积。采用细胞悬液移植,MEHAT[9]和SCHWARTZ等[11]开展了0.5′105、1.0′105、1.5′105 3个梯度的对比实验,没有发现移植疗效的明显差异;由于在常规的动物实验中,大鼠视网膜下移植的细胞量达到1.0′104,人的视网膜面积是大鼠的80倍。因此,我们团队采用1.0′106细胞量用于临床移植[8]。用于视网膜下移植的生物膜大小,约为1.3 mm×3.0 mm,可以覆盖黄斑中心凹[6-7]。③对于同种异体移植,需要应用免疫抑制剂,一般采用FK-506[0.1 mg/(kg·d),口服,2次/d,血药浓度维持在5 ng/mL,12周后停药]及吗替麦考酚酯胶囊(500 mg口服,2次/d,连用4周)联合应用,其应用方式及剂量因人种差异,可能会有调整[3, 8]。对于自体iPSC-RPE细胞移植,不需要使用免疫抑制剂。④细胞移植方式及部位:由于干性AMD及青少年黄斑变性主要表现为黄斑中心凹的RPE细胞萎缩,病变视网膜与脉络膜组织粘连紧密,局部功能呈不可逆损伤,细胞移植点一般选在病变视网膜边缘,即将供体RPE细胞移植到最近凋亡的受者RPE周围。这一选择理论上有利于移植细胞发挥最佳疗效。湿性AMD患者则需要手术切除黄斑下的新生血管膜,然后将新鲜的细胞悬液或细胞生物膜移植到受试者的黄斑中心凹。然而,切除视网膜下新生血管膜的手术操作将导致术中出血、血肿,以及视网膜屏障的损伤,破坏眼内的相对免疫豁免的微环境,影响移植疗效。
1.3 移植后的形态和功能检测由于活体视网膜结构与功能的易观测性及临床检测手段的丰富性,我们能直观示踪移植细胞或细胞膜片组织,并检测局部功能的改变,评价移植疗效。视网膜形态与功能的主要检测手段包括:①眼底照相。SCHWARTZ等[11]认为,移植的hESC-RPE细胞带有色素,在眼底照相中,可以清晰地看到移植细胞的色素,根据眼底逐渐增多的黑色素的分布,判断移植细胞长期存活在移植区。我们将hESC-RPE细胞悬液移植到湿性AMD视网膜下,却未观察到色素团块的增多。色素团块是否可以代表移植细胞的存在及存活,这一判断标准仍有争议[12]。只有视网膜遭受外伤、感染或色素细胞破坏(如先天性的视网膜色素变性疾病),才可以在眼底照相中发现色素团块,亦即色素团块代表RPE细胞的凋亡。在正常的视网膜中,眼底照相不可能发现黑色素团块。因此,通过眼底照相中的色素团块示踪移植细胞的方案,目前尚未取得共识。②SD-OCT检测。SD-OCT可以很好地显示视网膜各层的结构,分辨率达到5 μm,成为示踪移植细胞及细胞膜片的最佳方法。上述研究团队均通过SD-OCT检测到移植区域的高反射层,判断为移植细胞的分布。③眼底自身荧光(autofluorescence, AF)。AF主要由RPE细胞中的生色物质产生,在RPE细胞受到破坏后,AF将表现为暗黑色。因此,如果RPE细胞存活且发挥正常功能,AF将能捕捉到逐渐增强的荧光。AF不仅是移植细胞或细胞膜片的形态学检测指标,也能反映RPE的功能。④中心视力。中心视力是否改善是移植疗效最基本和最直接的检查方法。目前,研究团队都采用糖尿病视网膜病变早期处理研究(early treatment diabetic retinopathy study, ETDR)视力表进行长期追踪。⑤黄斑区微视野计及多焦视网膜电图(multifocal electroretinography, mfERG)。这两项检测措施是反映黄斑区域局部视功能的最佳组合。我们采用mfERG对移植区黄斑中心凹的功能进行了持续追踪,发现mfERG的中央一环振幅密度持续增加,佐证了移植手术的有效性[8]。DA CRUZ等[7]通过微视野检测移植区hESC-RPE生物膜组织的功能,充分证明了移植手术后细胞功能的长期有效性。
2 干细胞来源的RPC细胞移植治疗RP目前,动物实验已经证明,从人胚胎12~16周的视网膜中获取的成体RPC细胞可以有效挽救RP动物模型的视功能,国际上多个研究团队正进行胎儿RPC细胞移植治疗RP的临床试验。我们于2017年报道了RPC移植治疗8例晚期RP患者的临床试验结果(WHO注册号ChiCTR-TNRC-08000193)[13]。在国际临床试验中心检索发现,英国ReNeuron有限公司,美国jCyte、Inc及Radtke研究团队也进行了该项临床试验的注册,注册号分别为NCT02464436、NCT02320812、NCT00345917。
成体RPC细胞处于有丝分裂末期,动物实验证明该细胞没有成瘤性,较ECS来源的RPC细胞更安全。在临床移植方案中,研究者采用玻璃体切除手术,用40G的针头将细胞缓慢注入病变视网膜下,这一微创操作对受试者视网膜破坏极小,视网膜的相对免疫豁免环境能得到最大限度保护。因此,Ⅰ期临床试验中,受试者均没有服用免疫抑制剂。我们从人12~16周龄胚胎视网膜中分离获得高纯度的RPC细胞并移植到RCS大鼠视网膜下发现,RPC细胞能与供体视网膜很好地融合,并继续发育成熟。移植后3周,闪光视网膜电图(flash electroretinogram, FERG)检测发现,受体视网膜功能较对照组明显改善。移植后6周,移植疗效仍然明显,但较3周呈下降趋势。在此基础上,8例典型RP患者接受了RPC移植手术,其中男性5例,女性3例,平均年龄32.2岁,术前视力(1.21±0.36)log MAR,细胞均成功移植到视网膜下间隙。随访12个月,均发现移植细胞能与受者良好融合,光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)能检测到移植的细胞在视网膜下长期存在。眼底荧光血管造影(fluorescein angiograms,FA)检查显示,在移植后未发现移植区炎症性荧光渗漏及出血、视网膜水肿等排斥反应。功能学转归,以手术眼为研究对象,手术眼视力整体水平较术前视力改善,以3、6个月明显。但在术后12个月,视力逐渐回退至术前水平。本研究表明,同种异体RPC细胞移植治疗RP是安全的,明显的移植疗效表现在术后3~6个月。
由于成体RPC在临床中获取有限,且难以保证每批次的RPC质量和细胞生物学特征的一致性。从ESC和iPSC诱导分化为RPC,将克服以上困难。目前多个实验研究表明,采取三维培养系统,ESC和iPSC均可分化为发育期的视网膜片,并获取较为可靠的RPC[14-15]。该细胞也能有效挽救视网膜变性模式动物的视功能。可以预见,基于ESC和iPSC来源的RPC移植治疗视网膜变性的临床试验将会逐步开展。
3 前景分析及关键问题国际上干细胞移植治疗视网膜疾病临床试验的顺利开展,不仅为这些致盲性疾病的治疗带来了曙光,也推动了干细胞产业的发展。同时,我们也必须清醒地看到,这一领域的临床研究才刚刚开始,距离临床应用的距离仍很遥远,有一些关键问题尚待解决。
3.1 发展更好的细胞移植技术将细胞输送到视网膜下间隙的方法有两种:细胞悬液移植和以生物材料为基底的细胞生物膜片移植。何种方法更为优越和有效存在一定的争议。细胞悬液移植更为微创和简易,但细胞悬液容易在视网膜下间隙播散,难以完全聚集到病变区域。生物膜片移植有效克服了悬液移植的缺点,但生物材料存在组织相容性、输送到视网膜下的手术复杂性等问题。日本KAMAO等[16]进行了细胞悬液和生物膜片移植比较研究的动物实验,发现两种方法并没有明显差异,均能促进受试动物视功能的改善。而PETRUS-REUER等[17]采用ESC-RPE细胞悬液移植的动物实验中,发现移植细胞很难整合到病变视网膜中。干细胞来源的RPE细胞移植临床试验中,有2个团队采用生物膜片移植,3个团队采用细胞悬液移植。目前,随着更为优良的生物材料的开发和干细胞组织工程学技术的发展,更多的研究者倾向于细胞生物膜片移植技术。
3.2 长期疗效的维持无论ESC-RPE、iPSC-RPE移植治疗黄斑变性,还是RPC移植治疗RP,突出的关键问题在于:视网膜干细胞移植后对变性视网膜视功能的改善不能长期维持,随着时间延长,视功能逐渐衰退。在动物实验中,显著的视功能改善表现在移植后2~3周,最长功能维持约200 d,以后逐渐回退至移植前水平[18]。植入干细胞在移植后期的大量死亡可能是导致干细胞移植治疗效果下降的主要原因[19]。我们RPC移植治疗RP的Ⅰ期临床实验也观察到干细胞移植的治疗效果在移植后的3~6个月比较明显,而后效果显著下降直至消失。在ESC-RPE移植治疗黄斑变性临床试验长期随访中,疗效也逐渐回退。
尽管视网膜干细胞移植区——视网膜下腔为相对封闭空间和免疫赦免区域,但由于眼病变微环境的改变,如血-视网膜屏障破坏,同种异体干细胞移植后仍然会产生免疫排斥反应[20]。在应用免疫抑制剂的情况下,排斥反应虽然被有效控制,但AMD及RP的视网膜组织中,存在长期的慢性炎症的微环境,视网膜下腔的干细胞移植区依然有激活的小胶质细胞聚集。这一现象也普遍存在于干细胞治疗其他中枢神经变性疾病中,成为干细胞在神经系统组织中长期存活的主要障碍[21]。因此,改善移植区域的微环境,或者采用更利于细胞生存的生物材料,是今后研究的方向之一。
3.3 移植细胞与宿主的整合在RPC移植治疗RP的研究中,RPC移植可能的治疗机制如下:①植入眼治疗细胞所产生的神经营养效应及神经保护作用,即所谓的By-stander效应[22]。RADTKE等[23]报道:移植后受体原来残存的视锥细胞区域视功能明显改善,而不是移植区,这为“营养学说”提供了有力的佐证。②突触重建的机制:MACLAREN等[2]首次在形态学上观察到GFP标记的移植细胞与病变视网膜的双极细胞(PKC-α染色阳性)建立了突触联系,发现视杆细胞特异性的代谢性谷氨酸受体8(mGluR8)作用于移植细胞,使后者胞内钙离子浓度发生改变。虽然后续的其他研究者都观察到新的突触联系,但仅有不足10%的植入细胞能迁移到感光细胞所在的外核层而产生可能的突触传递,其中最高的细胞整合率也仅40%左右[2, 24]。提高有效整合率,是决定移植疗效的关键。
在ESC-RPE、iPSC-RPE移植治疗黄斑变性的研究中,移植的细胞属于上皮细胞,该细胞整合到病变视网膜的难度相对RPC较低。理论上,植入RPE细胞被期待发挥的主要功能包括:营养支持感光细胞,吞噬感光细胞外节,维持视视蛋白代谢。多数研究认为,细胞生物膜片更能利于移植细胞在形态上整合到病变视网膜中,但供体RPE细胞是否在功能上与宿主感光细胞发生整合,目前尚少见系统研究。
干细胞移植治疗视网膜疾病的转化医学研究,无论从研究深度还是广度,在近10年都取得了长足进展。中国国家卫计委于2015年颁布了《干细胞临床试验研究基地管理办法》和《干细胞临床试验研究管理办法》,正式规范了干细胞临床试验在中国的开展。近5年,国家科技部先后有5项重点研发计划资助眼科干细胞的转化医学研究。我们相信,随着国家政策的规范及经费资助力度的加大,我国的干细胞移植治疗视网膜疾病的基础与临床研究一定会取得丰硕的成果。
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