0
文章快速检索  
高级检索
Carabin过表达对人心室肌细胞AC16氧糖剥夺后凋亡的影响
吴庆1, 姚浩旗1, 程阔菊1*, 唐建芳1, 黄河1Δ, 陈建2, 李洪1, 杨天德1     
1. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院麻醉科;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)高原军事医学系
[摘要] 目的 探讨Carabin基因过表达对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)诱导的人心室肌细胞株AC16凋亡的作用。方法 构建Carabin过表达及空载稳定细胞株,将AC16细胞分为空载常氧组、Carabin过表达常氧组、空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组。空载常氧组及Carabin过表达常氧组置于正常条件下培养;空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组置于Hanks液中放入缺氧恒温细胞培养箱培养24 h(1%O2-5%CO2-94%N2)。采用倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率及存活率;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;通过酶标仪检测心肌细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和心肌细胞损伤标志物LDH的活性;Western blot检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达水平。结果 AC16细胞OGD 24 h后,细胞内Carabin的mRNA及蛋白水平显著降低。与空载常氧组比较,空载OGD 24 h组及Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)。与空载OGD 24 h组比较,Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)。结论 Carabin过表达能显著减轻OGD诱导后AC16细胞的凋亡。
[关键词] 人心室肌AC16细胞     Carabin     氧糖剥夺     细胞凋亡    
Effect of Carabin overexpression on oxygenglucose deprivation-induced apoptosis in cultured human ventricular myocytes
WU Qing1, YAO Haoqi1, CHENG Kuoju1*, TANG Jianfang1, HUANG He1Δ, CHEN Jian2, LI Hong1, YANG Tiande1     
1. Department of Anesthesiology, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037;
2. Faculty of High Altitude Military Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81370210)
Corresponding author: YANG Tiande, Tel: 86-23-68763638, E-mail: 31011@sina.com
[Abstract] Objective To investigate the effect of Carabin overexpression on apoptosis of human ventricular myocytes induced by oxygenglucose deprivation (OGD) in vitro. Methods Human ventricular myocyte AC16 cell line was transfected with a lentiviral vector carrying Carabin gene to induce Carabin overexpression or with a negative control vector. The transfected cells were cultured for 24 h under routine conditions or under OGD conditions (in Hank's solution in a hypoxia incubator with 1% O2, 5% CO2, and 94% N2). The changes in the morphology of AC16 cells were observed under an inverted microscope, and flow cytometry was used to determine the apoptosis rate and survival rate of the cells. The apoptotic cells were detected with TUNEL staining, and the activity of Caspase-3 and LDH in the cells were evaluated with enzyme labeling. Western blotting was performed to determine the protein expression of Caspase-3 in the cells in different culture conditions. Results OGD for 24 h significantly lowered the mRNA and protein levels of Carabin in AC16 cells. In the cells transfected with Carabin-overexpressing vector and the negative control vector, OGD for 24 h resulted in significantly increased cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, LDH activity, and Caspase-3 protein expression as compared with the routinely cultured cells transfected with the negative control vector (P < 0.05). Compared with the negative control cells, the cells overexpressing Carabin were more resistant to OGD and showed significantly lower apoptotic rate, Caspase-3 and LDH activities, and Caspase-3 protein expression after OGD for 24 h (P < 0.05). Conclusion The overexpression of Carabin can significantly reduce the apoptosis of AC16 cells induced by OGD.
[Key words] human ventricular myocytes cells AC16     Carabin     oxygenglucose deprivation     cell apoptosis    

缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)是冠状动脉的供血不足或中断,造成心脏能量不足,进而造成细胞凋亡、坏死,严重时将发展成心功能不全、心衰等,已成为全球死亡率较高的疾病之一[1-2]。由于心肌细胞属终末分化细胞,几乎无再生能力,如果能在心肌缺血早期进行干预,可逆性抑制心肌细胞凋亡,将会对缺血心肌细胞起保护作用[1]。Carabin是近年发现的TBC1蛋白家族的成员[3],可通过CaN和Ras信号通路防止心肌肥厚[4-6]。然而在心肌缺血的研究中,Carabin是否起着重要的作用尚无定论。我们前期实验结果显示人心室肌细胞AC16在氧糖剥夺(OGD)24 h后Carabin的蛋白表达显著下调。那么Carabin是否与心肌细胞氧糖剥夺后的损伤相关联呢?本研究拟建立氧糖剥夺诱导AC16细胞凋亡模型,通过Carabin过表达观察Carabin对氧糖剥夺诱导AC16细胞凋亡的影响,以期为缺血性心脏病的防治提供一些科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

人心室肌细胞株AC16购自美国模式培养物集存库(American type culture collection, ATCC)[7],其培养于含10%胎牛血清的高糖培养基中,置于37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。当细胞长至约90%融合度时,用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.2 主要试剂

DMEM基础培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国HyClone公司;Caspase-3活性检测试剂盒、胰酶细胞消化液、Western及IP细胞裂解液和BCA蛋白检测试剂盒均购自碧云天公司;Annexin V-APC/7-AAD双染法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;TUNEL凋亡试剂盒购自美国Roche公司;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Carabin抗体购自Abcam公司;Caspase-3、β-actin抗体购自CST公司;Hanks液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 Carabin基因过表达慢病毒载体的构建

提取阳性克隆质粒,并进行酶切反应及测序[8]。挑选鉴定正确的重组质粒进行病毒包装,将携带目的基因的重组质粒pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro,以及系统包装质粒导入293T细胞,产生携带目的基因的高滴度慢病毒,同时用重组质粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro包装空载对照病毒(rLV-NC)。将成功包装的过表达慢病毒载体(rLV-hTBC1D10C)及阴性对照载体(rLV-NC)分别感染AC16细胞;用嘌呤霉素筛选得稳转的过表达细胞株及空载细胞株,qPCR和Western blot分别检测Carabin的mRNA和蛋白表达效果。选取稳定感染过表达慢病毒载体(rLV-hTBC1D10C)并有效过表达Carabin的AC16细胞作为过表达组;将稳定感染慢病毒空载体(rLV-NC)的AC16细胞作为空载对照组。用含有10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养细胞,并置于37 ℃、5% CO2常氧培养箱中培养。待细胞融合度约90%时,消化传代。

1.4 心肌细胞的分组及处理

将AC16细胞分为空载常氧组、过表达常氧组和空载OGD 24 h组、过表达OGD 24 h组。常氧组培养条件为37 ℃,21%O2-5%CO2-74%N2,10%FBS DMEM培养基,OGD组培养条件为37 ℃,1%O2-5%CO2-94%N2,Hanks平衡液。

1.5 指标检测

1.5.1 流式细胞术检测细胞凋亡

将成功构建的空载组和过表达组AC16细胞分别消化传至六孔板中培养24 h后,将空载常氧组和过表达常氧组换液后继续常氧环境培养24 h;空载OGD 24 h组和过表达OGD 24 h组换为Hanks液后置于缺氧环境培养24 h。用不含EDTA的胰酶消化细胞,800 ×g离心5 min收集细胞,弃上清液,留细胞沉淀。用预冷PBS洗涤细胞2次(800 ×g离心5 min)收集细胞。将按照2 μL Annexin V-APC、2 μL 7-AAD和100 μL binding buffer比例的混合液200 μL重悬细胞,冰上避光孵育15 min后C6流式细胞仪检测。

1.5.2 TUNEL检测细胞凋亡

将空载组和过表达组AC16细胞分别消化传至放有盖玻片的12孔板中培养24 h后,空载常氧组和过表达常氧组换液后继续常氧环境培养24 h;空载OGD 24 h组和过表达OGD 24 h组换为Hanks液后置于缺氧环境培养24 h。TUNEL染色的操作按说明书进行,简要如下:PBS洗2次,预冷的75%乙醇固定15 min,PBS洗2次,0.2%的Triton X-100通透5 min,PBS洗2次,加入TUNEL反应混合液(50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP),37 ℃避光反应1 h;加入DAPI染核7 min;取出盖玻片,加入抗摧灭剂,盖至载玻片上,在荧光显微镜下观察。

1.5.3 Caspase-3活性检测

将空载组和过表达组AC16细胞分别接种至直径10 cm培养皿中,如前所述进行常氧及缺氧培养24 h。用胰酶消化并收集细胞,600×g 4 ℃离心5 min,PBS洗涤1次;加入100 μL裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15 min;4 ℃ 20 000×g离心15 min;收集上清至冰浴预冷的离心管中。按照以下反应体系依次加入检测缓冲液40 μL、样品50 μL、Ac-DEVD-pNA (2 mmol/L)10 μL共100 μL混匀,37 ℃孵育120 min,酶标仪检测波长405 nm处光密度值[D(405)]。Bradford法检测蛋白浓度校准。

1.5.4 乳酸脱氢酶(LDH)活性检测

如前所述接种细胞分别进行常氧及缺氧培养24 h。收集培养上清进行LDH测量。简要如下:取20 μL样本加入96孔板中,每孔分别加入25 μL基质缓冲液和5 μL辅酶Ⅰ应用液,对照组加入5 μL双蒸水,混匀,37 ℃水浴15 min,再加入2,4-二硝基苯肼25 μL,混匀,37 ℃水浴15 min,最后加入0.4 mol/L NaOH溶液250 μL,混匀,室温静置5 min,在波长450 nm处酶标仪检测光密度值[D(450)]。

1.5.5 Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3的表达

如前所述接种细胞至直径10 cm皿中,分别进行常氧及缺氧培养24 h。加入细胞裂解液100 μL,并全部刮取细胞至1.5 mL预冷离心管中,10 000 ×g,4 ℃离心10 min后取上清,BCA法测定蛋白浓度。调平样品浓度为2.5 μg/μL。用10% SDS-PAGE电泳分离,电泳条件80 V电泳30 min,100 V电泳100 min。转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST洗3次后一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗3次后二抗室温孵育2 h。TBST洗3次后显影。

1.6 统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件分析,计量资料以x±s表示。多组间比较采用双因素方差分析。

2 结果 2.1 氧糖剥夺后AC16细胞Carabin的mRNA及蛋白表达

随着OGD处理时间的延长,AC16细胞内Carabin的mRNA水平呈逐渐减低趋势(P < 0.01, 图 1A);Carabin的蛋白表达也呈逐渐减低趋势(图 1B)。

A:实时荧光定量PCR检测Carabin mRNA相对表达量(x±sn=3)  a:P < 0.01,与0 h比较;B:蛋白质免疫印迹检测Carabin蛋白表达 图 1 AC16细胞在氧糖剥夺(OGD)后Carabin的mRNA及蛋白变化

2.2 Carabin过表达对AC16细胞氧糖剥夺条件下细胞形态的影响

AC16细胞在常氧或OGD 24 h后的细胞形态(图 2)。在倒置显微镜下观察:空载常氧组(图 2A)及过表达常氧组(图 2B)的细胞生长状态良好,形态完整,贴壁牢固,边界清楚,大小均匀,细胞均长满;空载OGD 24 h组(图 2C)细胞生长状态差,形态不完整,大多数呈圆形漂浮状,仅少数贴壁,大小不均匀;过表达OGD 24 h组(图 2D)细胞生长比空载OGD 24 h组(图 2C)较好,虽细胞融合度不及常氧组细胞,但比空载OGD 24 h组(图 2C)较高,细胞呈圆形漂浮状较少,大多数细胞仍贴壁。

A:空载常氧组;B:过表达常氧组;C:空载OGD 24 h组;D:过表达OGD 24 h组 图 2 倒置显微镜下观察各组AC16细胞形态变化

2.3 Carabin过表达减轻AC16细胞氧糖剥夺条件下细胞凋亡

流式细胞术检测AC16细胞在常氧或OGD 24 h后细胞凋亡见图 3表 1。空载OGD 24 h组和过表达OGD 24 h组与空载常氧组相比,凋亡率均升高(P < 0.01),存活率均降低(P < 0.01);然而,与空载OGD 24 h组比较,过表达OGD 24 h组凋亡率明显降低(P < 0.01),存活率明显升高(P < 0.01)。TUNEL染色检测AC16细胞在常氧或OGD 24 h后细胞凋亡见图 4。空载OGD 24 h组和过表达OGD 24 h组与空载常氧组相比,凋亡数目均增多;过表达OGD 24 h组与空载OGD 24 h相比,凋亡数目减少。

A:空载常氧组;B:过表达常氧组; C:空载OGD 24 h组;D:过表达OGD 24 h组 图 3 流式细胞术检测各组AC16细胞的凋亡情况

表 1 AC16细胞OGD各时间点细胞凋亡定量分析(n=6,x±s)
组别 凋亡率/% 存活率/%
空载常氧组(0 h) 6.50±2.35 92.43±2.08
过表达常氧组(0 h) 5.80±1.51 93.07±1.19
空载OGD24 h组 34.37±3.72a 62.17±4.83a
过表达OGD24 h组 11.29±0.96ab 88.57±1.00ab
a:P < 0.01,与空载常氧组比较;b:P < 0.01,与空载OGD 24 h组比较

图 4 TUNEL法染色检测各组AC16细胞的凋亡情况

2.4 Carabin过表达降低AC16细胞氧糖剥夺条件下Caspase-3和乳酸脱氢酶的活性

AC16细胞在常氧或OGD 24 h后Caspase-3的活性检测结果显示,空载OGD 24 h组与空载常氧组相比,Caspase-3活性明显增高(P < 0.01,图 5);过表达OGD 24 h组与空载OGD 24 h相比,Caspase-3活性显著降低(P < 0.05,图 5)。乳酸脱氢酶(LDH)检测结果显示,AC16空载组细胞在OGD 24 h后LDH明显升高(P < 0.01);而AC16过表达组细胞在OGD 24 h后其LDH含量明显低于空载OGD 24 h组(P < 0.05,图 5)。表明Carabin过表达可降低AC16细胞在OGD环境中的损伤。

1:空载常氧组;2:过表达常氧组;3:空载OGD 24 h组;4:过表达OGD 24 h组; a:P < 0.01,与空载常氧组比较;b:P < 0.05,与空载OGD 24 h组比较 图 5 各组AC16细胞在OGD 24 h后Caspase-3和乳酸脱氢酶的活性(n=3)

2.5 Carabin过表达减少AC16细胞氧糖剥夺条件下Caspase-3蛋白表达

AC16细胞在常氧或OGD 24 h培养后,蛋白质免疫印迹检测结果显示(图 6),空载OGD 24 h组中的Caspase-3蛋白表达明显高于空载常氧组[(1.274 8±0.063 6)vs (1.042 1±0.036 7),P < 0.05];过表达OGD 24 h组中的Caspase-3蛋白表达(1.157 2±0.016 2)明显低于空载OGD 24 h组(P < 0.05)。

1:空载常氧组;2:过表达常氧组;3:空载OGD 24 h组;4:过表达OGD 24 h组 图 6 蛋白质免疫印迹检测凋亡蛋白Caspase-3的表达

3 讨论

心肌与其他组织不同,受损后自我修复能力有限,最终导致心肌重塑或左心室功能障碍[9-11]。目前治疗心肌缺血或梗死的方法有:药物溶栓、介入治疗、冠脉搭桥手术,以及干细胞移植等[12-14]。因此,如果能在缺血性心脏病早期进行干预,可逆性地抑制心肌细胞凋亡,将会对心肌起非常重要的保护作用。

Carabin是钙调神经磷酸酶(CaN)的结合蛋白[2],也是CaN的内源性抑制因子,可特异性抑制Ras/ERK1/2信号通路[3]。Carabin可靶向抑制Rab35负性调控B细胞BCR信号通路,抑制Carabin可促进B细胞的早期应答[15];Carabin还可以相同机制使胞内囊泡积聚,进而影响外泌体的分泌[16]。Carabin通过脯氨酸羟化酶(P4HA2)发生羟基化而降解,从而激活Ras/胞外信号调节激酶途径,促进B细胞淋巴瘤增殖[17]

BISSERIER等[4]研究发现,Carabin可通过CaN和Ras信号通路抑制心肌细胞肥大,防止心肌肥厚,起保护作用。然而ZHU等[5]研究发现,Carabin抑制心肌细胞肥大,防止心肌肥厚,主要是由于Carabin通过CaN通路实现的。VOLLAND等[6]的研究也得出同样结论,并且Carabin通过降低心率使小鼠心输出量降低,从而提高小鼠运动能力和存活率。总之,Carabin可抑制心肌细胞肥大,防止心肌肥厚,起着保护性作用,但目前尚未有Carabin在心肌缺血模型中的相关研究。

我们前期研究发现,Carabin在心肌细胞中表达相对较低,利用人心室肌细胞株AC16建立氧糖剥夺模型后发现Carabin的mRNA和蛋白表达量显著下调。为了进一步研究及明确Carabin在心肌缺血损伤中的作用,我们构建Carabin过表达慢病毒,并筛选到Carabin稳定过表达的AC16细胞株。研究结果显示, 过表达Carabin后,氧糖剥夺(OGD)导致的AC16细胞凋亡显著减轻,Caspase-3和LDH的活性均显著下降,同时Caspase-3的蛋白表达显著下降。

综上所述,Carabin过表达后能显著减轻氧糖剥夺诱导的人心室肌细胞AC16的凋亡,但其具体的作用机制目前尚不明确,可能与CaN、Ras等信号通路有关。我们实验室后续将对Carabin的具体作用机制进一步研究,并且行Carabin敲低后检测AC16在氧糖剥夺后的凋亡损伤变化,并在动物水平进一步验证Carabin的作用及相关机制。

参考文献
[1] YONEZU K, SAKAKURA K, WATANABE Y, et al. Determinants of survival and favorable neurologic outcomes in ischemic heart disease treated by veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation[J]. Heart Vessels, 2018, 33(1): 25–32. DOI:10.1007/s00380-017-1031-2
[2] ROMERO-CORRAL A, MONTORI V M, SOMERS V K, et al. Association of bodyweight with total mortality and with cardiovascular events in coronary artery disease: a systematic review of cohort studies[J]. Lancet, 2006, 368(9536): 666–678. DOI:10.1016/S0140-6736(06)69251-9
[3] PAN F, SUN L, KARDIAN D B, et al. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin[J]. Nature, 2007, 445(7126): 433–436. DOI:10.1038/nature05476
[4] BISSERIER M, BERTHOUZE-DUQUESNES M, BRECKLER M, et al. Carabin protects against cardiac hypertrophy by blocking calcineurin, ras, and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ signaling[J]. Circulation, 2015, 131(4): 390–400. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.114.010686
[5] ZHU X, FANG J, GONG J, et al. Cardiac-specific EPI64C blunts pressure overload-induced cardiac hypertrophy[J]. Hypertension, 2016, 67(5): 866–877. DOI:10.1161/HYPERTENSIONAHA.115.07042
[6] VOLLAND C, BREMER S, HELLENKAMP K, et al. Enhanced cardiac TBC1D10C expression lowers heart rate and enhances exercise capacity and survival[J]. Sci Rep, 2016, 6: 33853. DOI:10.1038/srep33853
[7] DAVIDSON M M, NESTI C, PALENZUELA L, et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2005, 39(1): 133–147. DOI:10.1016/j.yjmcc.2005.03.003
[8] 刘凯玉, 蒋维, 王瑞娜, 等. 人Carabin蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选[J]. 生物学杂志, 2016, 33(3): 1–4.
LIU K Y, JIAN W, WANG R N, et al. Construction of lentivirus expression vector of human CARABIN and screening of cell line stably expressing CARABIN[J]. J Biol, 2016, 33(3): 1–4. DOI:10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.001
[9] ROTH G A, JOHNSON C, ABAJOBIR A, et al. Global, regional, and national burden of cardiovascular diseases for 10 causes, 1990 to 2015[J]. J Am Coll Cardiol, 2017, 70(1): 1–25. DOI:10.1016/j.jacc.2017.04.052
[10] DIAS L D, CASALI K R, GHEM C, et al. Mesenchymal stem cells from sternum: the type of heart disease, ischemic or valvular, does not influence the cell culture establishment and growth kinetics[J]. J Transl Med, 2017, 15(1): 161–170. DOI:10.1186/s12967-017-1262-0
[11] NI H, XU J. Recent trends in heart failure-related mortality: United States, 2000-2014[J]. NCHS Data Brief, 2015(231): 1–8.
[12] LALIT P A, HEI D J, RAVAL A N, et al. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges[J]. Circ Res, 2014, 114(8): 1328–1345. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.114.300556
[13] MOON S H, KANG S W, PARK S J, et al. The use of aggregates of purified cardiomyocytes derived from human ESCs for functionalengraftment after myocardial infarction[J]. Biomaterials, 2013, 34(16): 4013–4026. DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.02.022
[14] AILAWADI S, WANG X, GU H, et al. Pathologic function and therapeutic potential of exosomes in cardiovascular disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(1): 1–11. DOI:10.1016/j.bbadis.2014.10.008
[15] SCHICKEL J N, PASQUALI J L, SOLEY A, et al. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4(12): 1261–1275. DOI:10.1002/emmm.201201595
[16] HSU C, MOROHASHI Y, YOSHIMURA S, et al. Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10C[J]. J Cell Biol, 2010, 189(2): 223–232. DOI:10.1083/jcb.200911018
[17] JIANG W, ZHOU X, LI Z, et al. Prolyl 4-hydroxylase 2 promotes B-cell lymphoma progression via hydroxylation of Carabin[J]. Blood, 2018, 131(12): 1325–1336. DOI:10.1182/blood-2017-07-794875
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201807146
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

吴庆, 姚浩旗, 程阔菊, 唐建芳, 黄河, 陈建, 李洪, 杨天德.
WU Qing, YAO Haoqi, CHENG Kuoju, TANG Jianfang, HUANG He, CHEN Jian, LI Hong, YANG Tiande.
Carabin过表达对人心室肌细胞AC16氧糖剥夺后凋亡的影响
Effect of Carabin overexpression on oxygenglucose deprivation-induced apoptosis in cultured human ventricular myocytes
第三军医大学学报, 2018, 40(22): 2068-2073
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(22): 2068-2073
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201807146

文章历史

收稿: 2018-07-28
修回: 2018-09-28

相关文章

工作空间