辣椒素(capsaicin)的化学名为反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺,是辣椒类物质中的主要生物活性成分[1]。研究显示印度、泰国、韩国和墨西哥等地每人每日辣椒素摄入量为25~200 mg[2]。随着辣椒素的广泛运用,辣椒素的应用领域由食品、调味品的范畴逐渐扩展到药品、保健品。
目前,已有大量研究报道辣椒素与疼痛、肥胖和神经兴奋的联系,以及在呼吸系统、心血管系统和抑制肿瘤方面的作用[3-8],但是少有研究关注长期摄入辣椒素对造血系统的影响。相关报道显示,辣椒素能够保护微波辐射对血液系统的损伤[9],促进红系造血生成[10]。而造血干细胞是造血系统中一群维持机体长久造血能力的特殊细胞群体,具有强大的自我更新、增殖和分化的能力,存在于相对稳定的微环境造血龛中[11],辣椒素与造血干细胞之间有何联系尚不清楚。本研究通过给予小鼠灌胃辣椒素构建动物模型,模拟正常摄入辣椒素情形,观察辣椒素对造血干细胞稳态影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料主要试剂:1640培养基来自美国HyClone公司,辣椒素来自美国MCE公司,抗体来自美国BioLegend公司、Thermo公司、eBioscience公司。
C57BL/6J小鼠购买于北京实验动物中心,饲养繁殖于陆军军医大学实验动物中心SPF级动物室,相对湿度51%~59%,室温(22±3)℃。
1.2 方法 1.2.1 实验动物的分组和处理同期出生的C57BL/6J小鼠8~10周龄,按随机数字表法分为实验组和对照组。实验组每天分3次给予总计600 μL PBS辣椒素溶液0.4 mg/d灌胃,对照组给予等量PBS灌胃处理,持续至检测(≥4周)。
1.2.2 外周血检测将小鼠尾用酒精棉球擦拭消毒后,剪开尾部尖端,采血针取10 μL血溶于130 μL稀释液中,通过sysmexXT-2000全自动血液分析仪检测外周血。
1.2.3 骨髓细胞分离引颈处死小鼠,分离单侧后肢骨,利用培养基将骨髓冲刷进1640培养基中。红细胞裂解液1 mL裂解5 min后,离心得到骨髓单核细胞。
1.2.4 流式细胞仪检测及分选表面抗体标记:用FITC-Lineage、PercpCy5.5-Sca-1、Apccy7-C-Kit、PE-FLK2、APC-CD3、PE-CD127、V450-CD16/32抗体标记小鼠骨髓单核细胞,室温避光孵育30 min,流式细胞仪检测或分选。
1.2.5 周期检测经表面抗体标记的小鼠骨髓单核细胞,经通透处理后,用PECY7-Ki67、Hoechst33342标记,室温孵育20 min后检测。
1.2.6 凋亡染色先用V450-Lineage、PeCy7-C-kit、APC-Sca-1、PE-FLK2、FITC-CD34标记表面marker, 再用V510-AnnexinV、7-AAD抗体孵育15 min后检测。
1.2.7 q-PCR检测经流式分选得到LSK细胞,采用Invitrogen公司RNAqueousTM-MicroKit试剂盒提取总RNA,用TaKaRa公司PimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒逆转录,SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒检测mRNA表达。CDK2上游引物:5′-ACTGAGACTGAAGGTGTA-3′, 下游引物:5′-TTGACGATATTAGGGTGATTA-3′;CDK6上游引物:5′-CTGGTGTGAGATGTTATCATT-3′, 下游引物:5′-TAGTCAGAGCAGGAAGTG-3′;β-actin上游引物:5′-GAGACCTTCACCCCAGC-3′, 下游引物:5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。
1.2.8 骨髓细胞竞争性移植实验组和对照组小鼠各取50×104个全骨髓细胞,分别和50×104个CD45.1支持小鼠全骨髓细胞混合后,通过尾静脉注射移植到接受X-RAD 320辐照仪10 Gy致死剂量辐照的CD45.1受体小鼠体内。
1.3 统计学分析每个实验独立重复≥3次,采用Prism统计软件进行数据分析。数据以x±s表示,对正态性分布资料进行两独立样本t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 实验组造血干细胞及亚群变化取小鼠骨髓进行流式染色分析,发现小鼠LSK细胞数目增加。实验组小鼠LSK细胞占比骨髓单核细胞比例为(0.299±0.041)%,显著高于对照组[(0.177±0.052)%,P < 0.01,图 1A]。分析实验组小鼠LSK细胞亚群变化结果显示,实验组长期造血干细胞LT-HSC占比LSK细胞比例为(12.17±1.43)%,与对照组(11.46±1.98)%比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。实验组短期造血干细胞ST-HSC占比LSK细胞比例为(47.48±3.22)%,显著高于对照组[(37.63±1.85)%,P < 0.01]。实验组多能造血祖细胞MPP占比LSK细胞比例为(40.59±3.04)%,显著低于对照组[(50.12±1.95)%,P < 0.01,图 1B]。亚群分析结果显示,LT-HSC数量并未发生变化,提示辣椒素并不影响LT-HSC,而同时ST-HSC数量升高并且MPP数量降低,提示辣椒素促进ST-HSC增殖和MPP分化,短期造血能力加强。
2.2 实验组造血祖细胞数目变化
实验组小鼠骨髓中淋巴系祖细胞CLP(Lineage-CD127+C-Kit+Sca-1+)为(5.45±0.81)×105,与对照组比较差异无统计学意义[(5.32±0.89)×105,P > 0.05,图 2A]。实验组小鼠骨髓中髓系祖细胞CMP (Lineage-C-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32-)数为(1.81± 0.22)×106,显著高于对照组[(1.0±0.13)×106,P < 0.01]。实验组粒系-巨噬系祖细胞GMP (Lineage-C-Kit+Sca-1-CD34-CD16/32-)为(2.02±0.14)× 106,与对照组比较差异无统计学意义[(2.12±0.21)×106,P > 0.05],巨核系和红系祖细胞MEP(Lineage- C-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32+)为(0.57±0.07)×106,与对照组比较差异无统计学意义[(0.58± 0.04)×106,P > 0.05,图 2B]。祖细胞分析结果显示实验组骨髓中髓系祖细胞增多,短期造血增强。
2.3 实验组造血干细胞增殖
流式分析结果显示,实验组G0期(Ki67-Hoechst-) LSK细胞比例为(55.8±1.9)%,明显低于对照组[(70.5±2.6)%,P < 0.01]。实验组G1(Ki67+Hoechst-)LSK细胞比例为(35.8±2.1)%,显著高于对照组[(23.6±1.6)%,P < 0.01]。实验组G2/S/M (Ki67+Hoechst+)LSK细胞比例为(9.7±1.3)%,与对照组(7.2±1.6)%比较差异无统计学意义(P > 0.05,图 3)。q-PCR结果显示实验组周期相关蛋白激酶mRNA表达升高(图 4)。结果提示辣椒素促进LSK细胞增殖。
2.4 造血干细胞凋亡并未改变
分析实验组小鼠造血干祖细胞凋亡细胞比例,实验组凋亡LSK细胞(7-AAD-AnnexinV+)比例为(3.78± 0.61)%,与对照组凋亡LSK细胞比例(3.54±0.75)%比较,差异无统计学意义(图 5)。结果提示辣椒素并不影响LSK细胞凋亡。
2.5 造血干细胞长期造血能力并未改变
分别在造血移植后4、8、12、16周检测嵌合体比例,未发现实验组和对照组供体小鼠造血干细胞比例差异(图 6)。结果提示辣椒素并不影响造血干细胞的长期造血能力。
3 讨论
辣椒是日常生活食物中广泛应用的重要香料之一,主要包含辣椒碱、酚类化合物和抗氧化剂等物质[2]。辣椒素是辣椒的主要成分,在人体内参与生热作用、脂质代谢、炎症反应和氧化应激等多种生理活动过程。研究报道,辣椒素能够抑制前列腺、结肠癌、乳腺癌等多种癌细胞增殖,阻滞其生长和诱导凋亡[1, 4, 6-7];辣椒素能够通过抑制线粒体功能从而减少活性氧的生成,在组织内主要表现为抗炎、抗氧化作用[5];辣椒素能够促进体内葡萄糖平衡,减轻高血压,改善心功能[12]。
造血干细胞作为一群数目极少的并具有特殊能力的细胞群体,其分裂有多重结局:分化成淋巴系或髓系祖细胞,形成具有与亲代一样的自我更新能力的子代干细胞,动员入外周血或者死亡[13]。生物体内仅有极小一部分干细胞处于增殖活跃状态,经由LT-HSC到MPP,再到髓系和淋系祖细胞过程,并在此过程中逐渐脱离静止状态,失去自我更新和多向分化的能力。超过80%的造血干/祖细胞在造血龛中保持静止状态以维持造血干细胞增殖分化和休眠的动态平衡,从而保持长久的造血能力[14-15]。
本实验通过小鼠灌胃辣椒素建立模型,模拟正常摄入辣椒素水平,观察长期摄入辣椒素对造血系统的影响。结果显示LSK细胞数目增多,比例增加,亚群分析显示ST-HSC比例增加,MPP比例降低,提示实验组小鼠短期造血加强。进一步检测造血LSK细胞的增殖、凋亡情况,结果显示实验组G0期细胞数目减少, G1期数目增多,凋亡并无明显差异。综合以上实验结果推论辣椒素可促进造血干/祖细胞增殖,影响短期造血功能。
辣椒素在生物体内主要通过与其受体TRPV1结合发挥作用。其原因可能是辣椒素通过刺激传入神经,神经元钙离子通道开放引起兴奋,释放多种氨基酸和肽类物质,而这些物质可能引起造血干细胞的增殖;除此之外,研究报道给小鼠喂食辣椒素后发现血清肾上腺素浓度升高,推测辣椒素具有拟肾上腺素作用,同样能够引起造血干细胞的增殖。为进一步探究辣椒素促进造血干细胞增殖的分子机制,采用q-PCR技术检测周期蛋白依赖性激酶mRNA表达情况。周期蛋白依赖性激酶能够调控干细胞稳态平衡,促进造血干细胞增殖[16]。本结果显示实验组较对照组CDK2、CDK6 mRNA表达上升。因此,我们怀疑辣椒素可能通过调控周期蛋白依赖性激酶水平而影响造血增殖。除此之外,辣椒素通过AKT-AMPK-eNOS等通路调控造血龛内血管内皮细胞、破骨细胞[17],血管龛内的内皮细胞、破骨细胞与造血干细胞稳态平衡存在错综复杂的联系[18],亦有可能辣椒素通过影响造血微环境而对造血干细胞产生影响,尽管我们在造血移植实验中观察到脱离原造血微环境后,促造血作用消失,但仍无法确认辣椒素是否通过影响造血微环境而对造血干细胞产生影响,更深入的研究工作正在进行之中。
有意思的是,我们并未观察到LT-HSC比例发生改变,提示辣椒素并不影响小鼠的长期造血干细胞的数目或影响较小。为了进一步明确辣椒素是否影响其长期造血能力,本研究进行了竞争性造血移植实验,尽管实验组受体小鼠表现出更早的恢复趋势,但和对照组小鼠相比,造血干细胞的长期造血能力并未出现明显差异。因此,辣椒素对造血干细胞的促增殖作用并未导致造血干细胞稳态失衡。造血干细胞异常的增殖作用将会导致多种结局:造血干细胞枯竭、造血干细胞衰老、异常造血甚至形成肿瘤[19]。造血干细胞增殖抑制又往往会导致贫血、骨髓异常增生综合征等血液疾病[20]。因此,造血干细胞保持稳态平衡对于生物个体维持整个生命周期的造血至关重要。
总之,随着辣椒素的广泛应用,明确辣椒素对造血系统的影响愈加成为不可忽视的问题。本实验认为辣椒素对造血干细胞有促增殖作用,并且未导致造血干细胞稳态失衡。这为临床贫血、造血功能障碍患者的治疗提供新思路。未来,探究辣椒素与造血微环境之间的复杂联系将进一步揭示辣椒素如何参与造血、炎症等生理过程。
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