同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)能促使机体生成氧化性低密度脂蛋白，对冠状动脉等血管内皮细胞具有间接细胞毒性[1]，诱导血管内皮细胞损伤或凋亡，而血管内皮细胞损伤或凋亡是引起冠状动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的重要启动步骤，同时也贯穿了动脉粥样硬化的整个发生、发展过程。脂蛋白(a)[lipoproteino(a)，Lpo(a)]其由载脂蛋白[apolipopr-otein(a)，Apo(a)]构成[2]，表达可受基因调控，故可从基因层面寻找阻止其生成的有效手段，达到根本上或显著控制Lpo(a)表达[3]。部分研究前期[4-5]通过生物信息学、miR芯片及基础实验证实，miR-23是降Apo(a)效果最显著的内源性miRs。目前，已有研究证实miR-23通过抑制Apo(a)表达，可显著缓解血管内皮细胞损伤，但关于其是否可缓解hcy对血管内皮细胞的间接毒性，尚无研究探讨。研究证实[6]，正常状态下Apo(a)在细胞内呈现极低表达，而E26转录因子-1(E26 Transformation-specific 1，ETS-1)为Apo(a)的正调节转录因子之一，Apo(a)基因表达也受到其协同转录激活。故本研究拟通过以ETS1为靶基因预测和选取显著调控Apo(a)的内源性miR-23b，以验证其抑制血管内皮细胞内经高hcy激活小分子Apo(a)表达的效果，为治疗高hcy引起的As提供指导。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells，HCAECs)购自湖南丰晖生物科技有限公司，hcy粉购自美国OriGen公司，LipofectamineTM 2000试剂购自武汉锐博生物科技有限公司，兔抗人eNOS一抗、兔抗人Apo(a)一抗、兔抗人akt/p-akt一抗、兔抗人GAPDH一抗、兔抗人β-actin一抗、羊抗兔HRP标记二抗均购自美国Santa Cruz公司，pmir GLO质粒购自上海宸功生物技术有限公司，科华ST-360酶标仪购自山东博科生物产业有限公司，PCR仪购自上海皓庄仪器有限公司，MP-510电泳仪购自美国Major Science公司，双荧光素酶报告基因系统购自美国Promega公司。
1.2 方法 1.2.1 设计miR-23b-3p mimic/inhibitor进入http://www.targetscan.org/网站，以调控Apo(a)的ETS1为靶基因预测其内源性miRs，得到miR-23b-3p调控性最强，设计miR-23b-3p minics：5′-AUCACAUUGCCAGGG-AUUACC-3′，miR-23b-3p inhibitor：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′，交由广州易锦生物技术有限公司合成。
1.2.2 构建pmirGLO- ETS1 3′-UTR质粒以Apo(a)基因序列设计合成引物，HCAECs细胞为DNA模板作PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性4 min，循环：94 ℃变性1 min、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃ 8 min，总体系50 μL，产物1.5%凝胶电泳后回收纯化，通过SacⅠ和XbaⅠ双酶切载体pmirGLO连接高感受态细胞，提取质粒双酶切鉴定、测序，获得pmir GLO-ETS1 3′-UTR质粒，将ETS1基因mRNA的3′-UTR内miR-23a/b种子序列结合位点内的5个碱基做定点突变，同法构建靶基因突变型质粒pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut，荧光报告载体如下：pmirGLO-ETS13′-UTR正义链5′-CGCGAGCTCTGTTCAATAATGTCCC-3′，反义链5′-GCTCTAGATTCCAAACACAAG-GGGC-3′；pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut正义链5′-GCGC-GTCAATTTTAAGAAATAATATTTTA-3′，反义链5′-CG-CGCGAATTAATACAAACTTTCAAAG-3′。
1.2.3 测定转染细胞荧光素酶活性HCAECs细胞常规复苏后，含10%胎牛血清DMEM(高糖)培养基中，于37 ℃、5%CO2下培养4 d，PBS洗10 min，胰酶消化、重悬，1 100 r/min离心，弃上清液，胎牛血清重悬细胞，3×105/孔接种于6孔板，培养3 d后，2×104/孔移至96孔细胞板，每组设置6个复孔，接种12 h后，取对数期细胞依次转染分组：A组转染pmirGLO-ETS1 3′-UTR；B组转染miR-23b-3p inhibitor+pmirGLO-ETS1 3′-UTR；C组转染miR-23b-3p minics+pmirGLO-ETS13′-UTR；D组转染pmirGLO-ETS13′-UTR mut；E组转染miR-23b-3p minics+pmirGLO-ETS13′- UTR mut；F组共转染miR-23b-3p inhibitor+pmirGLO-ETS13′- UTR mut。各组3个复孔，置于37 ℃5%CO2，取相应转染质粒加入到50 μL opti-MEM无血清培养基混匀，1 μL Lipo2000溶解于50 μL opti-MEM无血清培养基中，混匀，室温下静置10 min。将上述2种试剂混合后孵育20 min。加1.9 mL血清培养基于70%细胞密度的六孔板，然后加入孵育后的转染试剂，混匀后培养箱培养48 h，双荧光素酶报告基因系统测定转染后细胞基因活性，公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。
1.2.4 分组转染HCAECs细胞取对数期HCAECs细胞，以1×106/孔接种于6孔板内，置于37 ℃、5%CO2下转染培养至细胞密度70%，分为：对照组、阴性对照组(接受miR-23b-3p inhibitor转染)和实验组(接受miR-23b-3p mimic转染)，3组细胞均置于含1.0 mmol/L hcy培养基中培养，每组细胞按1×104/孔接种于96孔内，于37 ℃、5%CO2下继续培养7 d，每组设置6个复孔。
1.2.5 测定HCAECs细胞存活率取各组HCAECs，接种于96孔细胞培养板，每孔加5 g/L MTT液20 μL，孵育2 h去上清液，加DMSO 100 μL，振荡15 min待均匀后，移除培养液后，活细胞荧光染色试剂盒染色后，上荧光显微镜(×400)观察染色图片，计数1个视野内存活细胞。MTT法检测HCAECs细胞存活率，酶标仪测定490 nm波长处光密度值[D(490)]。每组设置5个复孔和1个空白对照组，重复测量3次取平均值，HCAECs细胞存活率=[D(490)测定组-D(490)对照组]/D(490)对照组×100%，同期测定未接受hcy诱导正常HCAECs细胞存活率。
1.2.6 反转录PCR(RT-PCR)测定细胞内miR-23b-3p和Apo(a) mRNA表达各组细胞培养7 d后，取细胞液20 μL，裂解30 s后，11 269×g离心10 min。TRIzol法提取各组细胞总RNA，逆转录成cDNA，使用反转录试剂盒对miR-23b-3p和Apo(a) mRNA进行RT-PCR检测，miR-23b-3p以U6为内参，Apo(a)以β-actin为内参，引物如下：miR-23b-3p正义链5′-CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC-3′，反义链5′- TGTA-GCTGCCTCGCCAGAGGC-3′；U6正义链5′-TGCGGGT-GCTCGCTTCGGCAGC-3′，反义链5′-CCAGTGCAGGG-TCCGAGGT-3′；Apo(a)正义链5′-TGGACGGGAGACAGAGTGAAGCAT-3′，反义链5′-GGCATAGCTGGTA-GCTGGGAACA-3′；β-actin正义链5′-CCTCATGCCATCCTGCGTCTG-3′，反义链5′-TTGCTCGAAGTCTAGGG-CAACATAG-3′。
扩增长度123 bp，反应体系：荧光试剂SYBR10 μL、cDNA 1.0 μL、无RNA酶水8.0 μL、上游及下游引物各1 μL，共21 μL。反应产物1.5%琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，凝胶成像，测定mRNA表达。
1.2.7 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞内akt、p-akt、和eNOS蛋白表达各组细胞培养7 d后，取细胞液细胞裂解，11 269×g离心10 min，取上清液，BCA法定量蛋白质，取30 μg蛋白上样沸煮、电泳、PVDF膜转印，加入兔抗人akt、p-akt、eNOS、GAPDH一抗、羊抗兔HRP标记二抗，Western blot法测定akt、p-akt、eNOS蛋白表达，以GAPDH为内参，测定灰度值，计算灰度系数比，实验操作均根据实验试剂盒说明书执行。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，多组计量资料分析选择单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，不同时间检测使用重复测量的方差分析，组间比较采取配对t检验或独立t检验。
2 结果 2.1 Targetscan预测以ETS1为靶基因的miR进入http://www.targetscan.org/，点击“Submit”，ETS1的3′-UTR内包含miR-23b-3p的2~8nt“种子序列”的互补结合位点，见图 1，说明ETS1可能是miR-23b-3p靶基因。
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| ∣：ETS1 mRNA 3′-UTR与miR-23b-3p的互补位点；↓：示ETS1 mRNA 3′-UTR突变位点 图 1 Targetscan预测以ETS1为靶基因的miR |
2.2 pmirGLO-ETS1 3′-UTR质粒及突变质粒构建结果
ETS1 mRNA的3′-UTR内有miR-23b-3p的2~8 nt“种子序列”互补结合位点，通过PCR扩增这些位点和克隆插入pmirGLO质粒，后将ETS1 mRNA的3′-UTR内miR-23a/b种子序列结合位点相关5个碱基作定点突变，同法构建mRNA 3′-UTR野生型质粒和突变型质粒，后均通过SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定生成306 bp片段，经DNA序列测定，可得插入序列和预计ETS1基因3′-UTR序列、定点突变序列相符(图 2)，证明成功构建质粒。
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| M：标准；1：pmirGLO-ETS1 3′-UTR质粒；2：pmirGLO-ETS1 3′-UTR突变质粒(mut) 图 2 RT-PCR测定pmirGLO-ETS1 3′-UTR质粒及突变质粒构建 |
2.3 双荧光素酶报告基因实验验证结果
双荧光素酶报告系统检测各组细胞荧光素酶活性显示，pmirGLO-ETS1 3′-UTR+miR-23b-3p minics转染细胞荧光素酶活性低于pmirGLO-ETS1 3′-UTR+miR-23b-3p inhibitor转染(P < 0.01，图 3)，pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut+miR-23b-3p minics转染细胞荧光素酶活性和pmirGLO-ETS1 3′-UTR+miR-23b-3p inhibitor无明显区别，表明miR-23b-3p能够和ETS1 3′-UTR直接结合，可得ETS1是miR-23b-3p直接靶基因。
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| A：pmirGLO-ETS1 3′-UTR转染组；B：miR-23b-3p inhibitor+pmirGLO-ETS1 3′-UTR转染组；C：miR-23b-3p minics+pmirGLO-ETS1 3′-UTR转染组；D：pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut转染组；E：miR-23b-3p minics+pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut转染组；F：miR-23b-3p inhibitor +pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut转染组a：P < 0.01，与C组比较 图 3 双荧光素酶报告实验测定各组细胞荧光素酶活性(n=6，x±s) |
2.4 各组HCAECs细胞存活率
实验组HCAECs细胞存活率(66.22±5.17)%、阴性对照组HCAECs细胞存活率(42.12±2.35)%、对照组HCAECs细胞存活率(38.36±2.21)%均低于正常HCAECs细胞存活率(85.22±7.87)%(P < 0.01)，说明hcy可损伤正常HCAECs，减少HCAECs存活。实验组、阴性对照组、对照组HCAECs细胞存活率比较差异具有统计学意义(F=54.53，P < 0.01)，实验组HCAECs细胞存活率显著高于阴性对照组和对照组细胞(P < 0.01，图 4)。
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| A：对照组；B：阴性对照组；C：实验组；D：正常对照组 图 4 荧光显微镜观察各组HCAECs细胞存活率 |
2.5 各组HCAECs细胞miR-23b-3p和Apo(a) mRNA表达
转染后，实验组miR-23b-3p mRNA(82.34±3.86)%表达显著高于阴性对照组(44.21±3.72)%和对照组(42.18±3.64)%(P < 0.01)，实验组Apo(a) mRNA表达(30.82±3.59)%显著低于阴性对照组(102.52± 4.02)%和对照组(99.51±3.94)%(P < 0.01)，阴性对照组和对照组miR-23b-3p和Apo(a) mRNA均无明显差异(P > 0.05，图 5)。
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| M：标准；1：对照组；2：阴性对照组；3：实验组A：HCAECs细胞miR-23b-3p mRNA；B：HCAECs细胞Apo(a) mRNA 图 5 RT-PCR测定各组HCAECs细胞miR-23b-3p和Apo(a) mRNA表达 |
2.6 各组细胞akt、p-akt和eNOS蛋白表达
转染后，实验组p-akt表达和eNOS蛋白相对表达显著高于阴性对照组和对照组(P < 0.01)，阴性对照组和对照组p-akt表达和eNOS蛋白相对表达均无明显差异(P > 0.05，图 6)。
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| A：akt、p-akt和eNOS蛋白表达蛋白质免疫印迹检测 1：对照组；2：阴性对照组；3：实验组；B：各组HCAECs细胞akt、p-akt和eNOS蛋白表达(n=6，x±s) a：P＜0.01，与对照组和阴性对照组比较 图 6 蛋白质免疫印迹检测HCAECs细胞akt、p-akt、eNOS蛋白的表达 |
3 讨论
文献[7]报道，hcy是诱发冠状动脉粥样的独立危险因素之一，可直接引起血管壁炎症、血管内皮细胞损伤、血栓和血管平滑肌增生等病理性改变，诱发血管内皮细胞氧化，引起血液及机体内活性氧含量增加，氧化低密度脂蛋白使其具备细胞毒性，毒化、破坏动脉血管内皮细胞内纤维肌动蛋白，从而提升内皮细胞通透性，导致大量黏附因子穿透进入动脉血皮细胞内，恶化内皮细胞损伤，加重As[8]。本研究结果显示，hcy诱导后的HCAECs细胞存活率(38.36±2.21)%显著低于正常HCAECs细胞存活率(85.22±7.87)%(P < 0.01)，说明hcy可损伤正常HCAECs，减少HCAECs存活。由此可见，通过研究可抑制hcy对冠状动脉血管内皮细胞的间接毒理作用的机制，对有效治疗As具有显著的临床指导意义。
资料显示，LDL-C血症患者Lp(a)表达越高，其早发性冠心病的发病率越高，高Lp(a)患者在未诊出As斑块时，其乙酰胆碱舒张反应呈现下降趋势，而As斑块内检出高Lp(a)表达时，容易破裂，且破裂斑块伴有泡沫细胞[9]。ZENG等[10]和PENÇE等[11]研究报道，Lp(a)还参与冠状动脉血栓形成、动脉内皮血管壁泡沫细胞形成和致炎进程，直接损伤血管内皮细胞和内皮祖细胞。ZHAN等[12]研究也证明，Lp(a)和小颗粒Apo(a)高表达与管状动脉血管疾病发病率具有显著相关性，Apo(a)颗粒越小，血管疾病发病率越高。因此，部分研究者通过降低Apo(a)表达，阻断其转录为Lp(a)，并通过反义寡核苷酸抑制Apo B100 mRNA，显著降低血清Lp(a)表达，证明阻断Lp(a)基因启动子上游DNA内区段与特质基因结合，可显著影响Apo(a)转录成Lp(a)，由此推断通过抑制Apo(a)表达可在一定程度上缓解As进程[1, 13]。
文献[14]报道反义核苷酸可抑制Apo(a)表达，而miR对基因表达的调控原理与反义核苷酸接近，其通过结合到靶基因的3′-UTR、5′-UTR或蛋白编码区促进或抑制靶基因表达，但其调控能力远大于反义核苷酸。相关资料也表明[15-16]，miRs可通过HNF4家族基因、PKCα基因等靶基因间接调控Apo(a)表达转录。本文通过生物学信息筛查检出miR-23b-3p作用于靶基因ETS1时，能够显著调控Apo(a)表达，同时双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-23b-3p能够和ETS1 3′-UTR直接结合，证实ETS1是miR-23b-3p调控Apo(a)的直接靶基因。本研究以含有ETS1 mRNA的3′-UTR内的miR-23b-3p的“种子序列”为互补结合位点，与pmirGLO质粒结合成功构建pmirGLO-ETS1 3′-UTR和pmirGLO-ETS1 3′-UTR mut质粒，转染实验组管状动脉血管内皮细胞后，其miR-23b-3p mRNA表达显著高于阴性对照组和对照组(P < 0.01)，Apo(a) mRNA表达显著低于阴性对照组和对照组(P < 0.01)，提示经过miR-23b-3p抑制调控后，能够降低hcy诱导作用下血管内皮细胞内Apo(a)表达，这可能因为特定基因信号可与Apo(a)基因启动子上的DR-1位点结合，加快其基因转录，而ETS1靶向构建的miR-23b-3p下游靶基因SHR被激活后，能够竞争性结合这些特定基因信号启动子域内结合位点，降低其表达，从而抑制Apo(a)基因转录[17]。由于Apo(a)表达与As发生及发展存在相关性，同时结果也显示，实验组HCAECs细胞存活率显著高于阴性对照组和对照组细胞(P < 0.01)，由此推断miR-23b-3p通过抑制Apo(a)表达，能提升HCAECs细胞存活率，可能缓解As进程。
研究发现[18]，akt/eNOS信号通路由多个信号分子组成，其中akt是该通路的中心信号分子，也是其发挥调控作用的主要靶酶。akt经磷酸化生成p-akt，能够调控细胞凋亡及细胞内蛋白合成等。NOS包括结构型和诱导型，前者为eNOS和nNOS，后者为iNOS。研究显示[19]，eNOS处于应激状态时，能够缓解或抑制冠状动脉等血管痉挛，降低炎性因子侵入血管内皮细胞，缓解动脉粥样硬化，eNOS还可在Ca2+和钙调蛋白作用下，激活机体内的L-精氨酸合成内源性一氧化氮(NO)，NO能够扩张血管、抗凝，阻断或抑制血小板聚集。周涛龙[20]研究证明，微小RNA能够激活akt磷酸化过程，调高p-akt蛋白表达，增加eNOS活性，加快细胞释放NO，从而显著抑制血管内皮细胞损伤。本研究结果显示，实验组p-akt表达和eNOS蛋白相对表达显著高于阴性对照组和对照组(P < 0.01)，这表明miR-23b-3p通过靶向下调hcy诱导损伤的内皮细胞中Apo(a)表达，降低Apo(a)对血凝素样ox-LDL受体(LOX-1)及其配体JAG1的抑制作用[21]，而LOX-1/JAG1信号通路能够调节下游基因血管生成因子(VEGF)，增加内皮细胞p-akt蛋白和eNOS蛋白表达[22]，可能是miR-23b-3p降低hcy对内皮细胞间接毒性损伤的机制之一，从而缓解As进程。
综上所述，miR-23b-3p能够以ETS1为靶基因，可能通过akt/eNOS信号通路下调hcy诱导损伤的内皮细胞中Apo(a)表达，从而保护冠状动脉血管内皮细胞。但本研究未对miR-23b-3p调控Apo(a)保护hcy诱导内皮细胞损伤是否存在时间和剂量依赖进行更深层次的探讨，存在不足，需要进一步研究以完善。
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