近年随着全球人口老龄化,慢性心血管疾病患者增加,慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)患者数量亦急剧上升。我国流行病学调查显示,慢性肾病的发病率高达10.8%,给国家及个人带来严重经济负担[1]。慢性肾病发病机制极为复杂,其中肾脏纤维化病变是慢性肾病迁延至终末期肾病(end-stagerenal disease,ERSD)的重要病理学基础[2]。肾脏纤维化主要表现为肾小球内系膜基质增多,细胞外基质如胶原、纤维蛋白等沉积以及上皮细胞转分化等[3-4]。大量研究证实,氧化应激在肾脏纤维化发展中起着至关重要的作用[5-6]。而硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein,TXNIP)作为一种氧化应激蛋白,通过与硫氧还蛋白(TRX)结合而抑制其活性,导致氧化与抗氧化失衡进而促进氧化应激(oxidative stress, OS)发生[7]。研究表明,下调TXNIP抑制氧化应激可能延缓糖尿病肾病的发生[8-9]。同时,敲低TXNIP能通过抑制氧化应激产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成来拮抗高糖诱导下的肾小管上皮转分化[10-11]。由此推测TXNIP可能通过介导氧化应激参与肾脏纤维化疾病的发生、发展。然而,有关TXNIP在肾脏纤维化中的作用鲜有报道,其具体机制也并不明确。此外,大量研究证实,长期高脂饮食能诱导小鼠氧化应激水平上调,导致肾脏处于长期慢性低浓度炎症状态,促进小鼠肾脏纤维化的发生、发展[12-13]。因此,本研究将C57BL/6J小鼠与TXNIP基因敲除鼠(TXNIP-/-)予以普食及高脂喂养,观察TXNIP在不同喂养条件中的表达情况,探究TXNIP在肾脏纤维化中的影响及可能机制,为抑制肾脏纤维化进程治疗CKD提供一定实验基础。
1 材料与方法 1.1 材料C57BL/6J小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供,TXNIP敲除转基因小鼠(TXNIP-/-)由本院龚建平教授课题组提供,高脂饲料[45% fat kcal(%)]购自江苏美迪尔有限公司;Masson三色染色试剂盒及HE试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;兔抗TXNIP单克隆抗体、兔抗α-SMA单克隆抗体及兔抗TGF-β1 mAb购自Abcam公司;RIPA裂解液、PMSF、磷酸化酶抑制剂PI、Western一抗稀释液、兔抗β-actin抗体、HRP标记的山羊抗兔二抗购自碧云天生物科技公司。
1.2 方法 1.2.1 动物分组及取材12只8周龄C57BL/6J雄鼠(WT)及12只8周龄TXNIP敲除转基因小鼠(TXNIP-/-)均按随机数字表法分为2组,每组6只,分别予以普通饲料(正常对照组,NC)和高脂饲料(高脂饮食组,HFD),室温22~25 ℃继续喂养16周,小鼠禁食12 h,部分肾组织迅速固定于4%多聚甲醛用于制作石蜡切片,另一部分肾组织则储存于-80 ℃冰箱。
1.2.2 HE、PAS及Masson染色病理学观察4%多聚甲醛固定肾脏组织并制成石蜡包埋切片,分别进行苏木精-伊红(HE)、高碘酸-无色品红(PAS)、马松三色(Masson)染色观察。采用Image-Pro plus6.0图像分析软件分析,每个标本选取6个不同肾小球视野(×400)进行PAS染色分析,计算肾小球内PAS阳性染色面积/肾小球毛细血管袢总面积×100%;每个标本选取6个不同肾小球视野(×400)行Masson染色分析,计算肾小球胶原纤维(淡蓝色区域)相对面积。
1.2.3 免疫荧光技术检测α-SMA在肾脏组织的表达将4%多聚甲醛固定的肾脏组织进行石蜡包埋,参考免疫荧光染色试剂盒说明书检测α-SMA蛋白表达情况:石蜡切片脱蜡,柠檬酸高温修复,山羊血清封闭,滴加兔抗α-SMA单克隆抗体,4 ℃孵育过夜。再滴加适当1 :200稀释的荧光标记山羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h,PBS冲洗3次,DAPI染色10 min,PBS冲洗后晾干,滴加抗荧光淬灭剂。将染好的切片置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上,进行图像采集及半定量分析。
1.2.4 Western blot检测肾组织TXNIP、α-SMA、TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平取少量肾脏组织于液氮预冷的研钵碾碎,加入裂解液,冰上裂解30 min后低温高速离心,取上清液,测定相应蛋白浓度。检测各个目的条带,用Image Lab图像软件分析结果。
1.3 统计学分析应用SPSS 22.0以及GraphPad Prism5.0统计学软件进行数据分析,两组间比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 肾脏组织病理学变化HE染色结果显示,NC组中C57BL/6J小鼠肾小球结构完整,系膜区有轻度增生,肾小管未见明显异常,TXNIP-/-小鼠未见明显变化;HFD组可见肾小球增大、系膜细胞增生,肾小管结构模糊、小管上皮细胞空泡化,间质增生等表现,TXNIP-/-小鼠较C57BL/6J小鼠稍有改善,见图 1。在PAS染色中观察到NC组C57BL/6J小鼠系膜基质稍有增多,PAS阳性相对面积为(1.09±0.11)%,TXNIP-/-小鼠未见明显改变,且PAS阳性面积为(0.44±0.06)%(P < 0.01),HFD组C57BL/6J小鼠系膜基质增多,PAS染色强阳性且相对面积为(6.73±0.33)%,TXNIP-/-小鼠较其有明显改善,PAS阳性相对面积为(3.11±0.06)%(P < 0.01,图 2)。
2.2 肾脏组织纤维化变化 2.2.1 Masson染色改变
在NC组中,C57BL/6J小鼠肾小球胶原纤维明显增加,其胶原相对面积为(2.39±0.07)%,TXNIP-/-小鼠较其有明显改善,胶原相对面积为(0.19±0.02)%(P < 0.01);在HFD组中,C57BL/6J小鼠肾小球胶原纤维相对面积为(3.06±0.13)%,TXNIP-/-小鼠较其有明显改善,胶原相对面积为(0.39±0.03)%(P < 0.01,图 3)。
2.2.2 Western blot检测TXNIP、TGF-β1、α-SMA的蛋白表达水平
Western blot检测鉴定TXNIP-/-小鼠TXNIP基因敲除成功,且与C57BL/6J小鼠相比,TXNIP蛋白表达水平差异有统计学意义(P < 0.01)。同时,NC组与HFD组中,敲除TXNIP基因小鼠TGF-β1及α-SMA蛋白表达均较C57BL/6J小鼠明显下调(P < 0.05);与C57BL/6J NC组相比,HFD组TGF-β1及α-SMA蛋白水平也明显增加(P < 0.05,图 4)。
2.2.3 免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白在肾脏表达情况
α-SMA阳性染色区域主要定位在肾小管细胞间质,不管是在NC组还是HFD组中,C57BL/6J小鼠中其表达量均多于TXNIP-/-小鼠(P < 0.01);HFD组C57BL/6J小鼠α-SMA表达量多于NC组(P < 0.05,图 5)。
2.3 Western blot检测肾脏组织p38 MAPK信号通路的表达改变
为探究TXNIP促进肾脏纤维化是否与p38 MAPK磷酸化相关,Western blot检测p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平,在NC组与HFD组中显示,TXNIP-/-小鼠的p-p38 MAPK蛋白水平较C57BL/6J小鼠均明显下降(P < 0.05),且C57BL/6J HFD组较NC组p38 MAPK磷酸化蛋白水平明显增加(P < 0.05,图 6)。
3 讨论
肾脏纤维化是一个由多种因素参与的复杂病变过程,与转化生长因子、细胞分泌因子、氧化应激、炎症反应等有关[14]。研究证实,氧化应激与肾脏纤维化密切相关[15]; 是UUO肾纤维化发病机制中的重要参与者,抑制氧化应激能明显改善肾脏纤维化[16]。且氧化应激可诱导一种促纤维化的关键因子——TGF-β1表达上调,从而刺激细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达增加,并促进间质纤维化和上皮-间质转分化(epithelial to mesenchymal transdifferentiation,EMT)等[17-19]。此外,肾小管上皮分化成为肌成纤维细胞,分泌一种细胞骨架蛋白α-SMA[20]。因此,TGF-β1和α-SMA被视为衡量肾脏纤维化的特征性指标。硫氧还蛋白相互作用蛋白是硫氧还蛋白(TRX)的抑制剂,能与TRX活性位点上的半胱氨酸残基结合而抑制其活性,诱导氧化应激发生[21],其在肾脏纤维化中发挥的作用尚不清楚。本实验结果提示,TXNIP可能是氧化应激与肾脏纤维化之间重要的桥梁蛋白。
本研究结果显示,TXNIP基因敲除后,PAS与Masson染色示肾小球系膜基质及胶原纤维明显减少,同时TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平明显下调,说明氧化应激因子TXNIP能促进肾脏纤维化的发生。经高脂饲养后,肾脏HE和PAS染色结果显示肾小球肥大、系膜基质增多及肾小管上皮细胞空泡化及间质增生等病变,Western blot检测结果显示TGF-β1和α-SMA在高脂组肾脏表达明显增加,说明高脂能一定程度加速肾脏纤维化的发生。同时,本研究发现高脂喂养后肾脏组织中TXNIP的表达增加,且敲除TXNIP基因后能明显抑制高脂诱导下的TGF-β1和α-SMA表达水平的上调及肾小球胶原纤维的沉积,明显缓解肾脏纤维化水平,进一步说明TXNIP不仅参与了肾脏纤维化进程,还促进了高脂诱导下的肾脏纤维化发展。
p38丝裂原活化蛋白激酶通路是MAPK家族成员之一,参与细胞炎症、细胞转分化及免疫调节过程[22]。目前研究证实p38 MAPK信号通路与氧化应激密切相关,认为ROS能激活p38 MAPK信号通路,使用抗氧化剂能抑制p38 MAPK的磷酸化[23]。同时p38 MAPK信号通路在导致肾脏纤维化中起着重要作用[24],越来越多实验证明可通过抑制p38 MAPK的磷酸化水平来下调TGF-β1的表达,改善肾脏纤维化[25]。本研究发现敲除TXNIP基因后,p-p38 MAPK/p38 MAPK在肾脏表达明显下调;同时,高脂诱导下p-p38 MAPK/p38 MAPK在肾脏的表达上调,敲除TXNIP基因能下调高脂诱导下的p38磷酸化。说明TXNIP很可能是通过氧化应激激活p38 MAPK通路促进肾脏纤维化发生、发展。
综上所述,TXNIP能通过诱导氧化应激促进肾脏纤维化的发生,当机体处于高脂高糖等代谢紊乱状态,肾脏氧化应激水平也增加,处于慢性低浓度炎症状态,导致肾脏纤维化的发生、发展。TXNIP作为一种氧化应激因子,在高脂诱导下,在肾脏表达水平明显增加,进一步加重肾脏氧化应激,加速肾脏纤维化进程,其机制可能与促进p38 MAPK的磷酸化水平有关。本研究只对动物进行在体研究,具体机制有待结合离体研究进一步明确。
[1] | ZHANG L, WANG F, WANG L, et al. Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional survey[J]. Lancet, 2012, 379(9818): 815–822. DOI:10.1016/S0140-6736(12)60033-6 |
[2] | DUFFIELD J S. Cellular and molecular mechanisms in kidney fibrosis[J]. J Clin Invest, 2014, 124(6): 2299–2306. DOI:10.1172/JCI72267 |
[3] | ZHONG J, GUO D, CHEN C B, et al. Prevention of angiotensin Ⅱ-mediated renal oxidative stress, inflammation, and fibrosis by angiotensin-converting enzyme 2[J]. Hypertension, 2011, 57(2): 314–322. DOI:10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.164244 |
[4] | GRANDE M T, SÁNCHEZ-LAORDEN B, LÓPEZ-BLAU C, et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease[J]. Nat Med, 2015, 21(9): 989–997. DOI:10.1038/nm.3901 |
[5] | LV W, BOOZ G W, FAN F, et al. Oxidative stress and renal fibrosis: recent insights for the development of novel therapeutic strategies[J]. Front Physiol, 2018, 9: 105. DOI:10.3389/fphys.2018.00105 |
[6] | RICHTER K, KONZACK A, PIHLAJANIEMI T, et al. Redox-fibrosis: impact of TGFβ1 on ROS generators, mediators and functional consequences[J]. Redox Biol, 2015, 6: 344–352. DOI:10.1016/j.redox.2015.08.015 |
[7] | YOSHIHARA E, MASAKI S, MATSUO Y, et al. Thioredoxin/Txnip: redoxisome, as a redox switch for the pathogenesis of diseases[J]. Front Immunol, 2014, 4: 514. DOI:10.3389/fimmu.2013.00514 |
[8] | HAMADA Y, FUKAGAWA M. A possible role of thioredoxin interacting protein in the pathogenesis of streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J]. Kobe J Med Sci, 2007, 53(1/2): 53–61. |
[9] | SHAH A, XIA L, MASSON E A, et al. Thioredoxin-inter-acting protein deficiency protects against diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2015, 26(12): 2963–2977. DOI:10.1681/ASN.2014050528 |
[10] | TAN C Y, WEIER Q, ZHANG Y, et al. Thioredoxin-interacting protein: a potential therapeutic target for treatment of progressive fibrosis in diabetic nephropathy[J]. Nephron, 2015, 129(2): 109–127. DOI:10.1159/000368238 |
[11] | WEI J, SHI Y, HOU Y, et al. Knockdown of thioredoxin-interacting protein ameliorates high glucose-induced epithelial to mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells[J]. Cell Signal, 2013, 25(12): 2788–2796. DOI:10.1016/j.cellsig.2013.09.009 |
[12] | PINHAL C S, LOPES A, TORRES D B, et al. Time-course morphological and functional disorders of the kidney induced by long-term high-fat diet intake in female rats[J]. Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(10): 2464–2476. DOI:10.1093/ndt/gft304 |
[13] | CAO J, SODHI K, PURI N, et al. High fat diet enhances cardiac abnormalities in SHR rats: protective role of heme-oxygenase-adiponectinaxis[J]. Diabetol Metab Syndr, 2011, 3(1): 37. DOI:10.1186/1758-5996-3-37 |
[14] |
孙阳, 赵艳红, 卢永新, 等. 肾脏纤维化的发病机制及治疗进展[J].
实用临床医药杂志, 2015, 19(9): 173–176.
SUN Y, ZHAO Y H, LU Y X, et al. Pathogenesis and treatment progress of renal fibrosis[J]. J Clin Med Pract, 2015, 19(9): 173–176. DOI:10.7619/jcmp.201509059.jcmp.201509059 |
[15] | CHENG X, ZHENG X, SONG Y, et al. Apocynin attenuates renal fibrosis via inhibition of NOXs-ROS-ERK-myo-fibroblast accumulation in UUO rats[J]. Free Radic Res, 2016, 50(8): 840–852. DOI:10.1080/10715762.2016.1181757 |
[16] | REN Y, DU C, SHI Y, et al. The Sirt1 activator, SRT1720, attenuates renal fibrosis by inhibiting CTGF and oxidative stress[J]. Int J Mol Med, 2017, 39(5): 1317–1324. DOI:10.3892/ijmm.2017.2931 |
[17] |
霍振霞, 王保兴. p38MAPK在氧化应激诱导肾间质纤维化中的研究进展[J].
中华临床医师杂志(电子版), 2016, 10(7): 1029–1032.
HUO Z X, WANG B X. Research progress of p38MAPK in oxidative stress-induced renal interstitial fibrosis[J]. Chin J Clinicians(Electr Ed), 2016, 10(7): 1029–1032. DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2016.07.026 |
[18] | QI F, CAI P, LIU X, et al. Adenovirus-mediated P311 inhibits TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition in NRK-52E cells via TGF-β1-Smad-ILK pathway[J]. Biosci Trends, 2015, 9(5): 299–306. DOI:10.5582/bst.2015.01129 |
[19] | TANG F, HAO Y, ZHANG X, et al. Effect of echinacoside on kidney fibrosis by inhibition of TGF-β1/Smads signaling pathway in the db/db mice model of diabetic nephropathy[J]. Drug Des Devel Ther, 2017, 11: 2813–2826. DOI:10.2147/DDDT.S143805 |
[20] | XU L, CUI W H, ZHOU W C, et al. Activation of Wnt/β-catenin signalling is required for TGF-β/Smad2/3 signalling during myofibroblas proliferation[J]. J Cell Mol Med, 2017, 21(8): 1545–1554. DOI:10.1111/jcmm.13085 |
[21] |
邓文珍, 李杨, 贾彦军, 等. 过表达硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)通过激活p38MAPK通路促进MIN6细胞凋亡[J].
细胞与分子免疫学杂志, 2017, 33(10): 1323–1327.
DENG W Z, LI Y, JIA Y J, et al. Over-expression of thioredoxin-interacting protein promotes apoptosis of MIN6 cells via activating p38MAPK pathway[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2017, 33(10): 1323–1327. DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.008448 |
[22] |
邓小芳. 黄芪三七合剂通过影响p38 MAPK的表达改善CKD大鼠肾脏纤维化[J].
检验医学与临床, 2016, 13(11): 1494–1496.
DENG X F. Huangqisanqi mixture improves kidney fibrosis in CKD rats by affecting the expression of p38 MAPK[J]. Lab Med Clin, 2016, 13(11): 1494–1496. DOI:10.3969/j.issn.1672-9455.2016.11.015 |
[23] | TSIANI E, LEKAS P, FANTUS I G, et al. High glucose-enhanced activation of mesangial cell p38 MAPK by ET-1, ANG Ⅱ, and platelet-derived growth factor[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2002, 282(1): E161–E169. DOI:10.1152/ajpendo.2002.282.1.E161 |
[24] | LI X, LIU W, WANG Q, et al. Emodin suppresses cell proliferation and fibronectin expression via p38MAPK pathway in rat mesangial cells cultured under high glucose[J]. Mol Cell Endocrinol, 2009, 307(1/2): 157–162. DOI:10.1016/j.mce.2009.03.006 |
[25] | NISHIDA M, OKUMURA Y, SATO H, et al. Delayed inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase ameliorates renal fibrosis in obstructive nephropathy[J]. Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(8): 2520–2524. DOI:10.1093/ndt/gfn309 |