食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。近年来,其发病率和死亡率在世界范围内有上升趋势,严重威胁人类的生命和健康。根据病理组织学类型主要分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),我国食管癌患者90%以上是鳞癌[1-2]。食管鳞癌发生、发展和侵袭、转移机制复杂,涉及多种发病分子机制[3-5]。由于其发病隐匿,大多数患者确诊时已属中晚期。因此,明确肿瘤发生、发展的分子机制,尽早监测肿瘤细胞的演变过程,有利于食管鳞癌的诊断和靶向治疗[6-7]。近年研究表明miRNA在胚胎发育、器官形成、肿瘤发生与发展过程中发挥一定的作用[8-9]。其中miR-142-5p在肝癌、肾癌以及B细胞淋巴瘤等中起着重要作用,与肿瘤发生、发展密切相关[8],而在ESCC中的作用尚不清楚。因此,本研究通过监测ESCC患者癌组织中miR-142-5p的表达,探讨其表达与ESCC患者病理分期与预后的关系,以期为食管癌的防治提供理论依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象选取2014年4-12月经本院进行手术治疗的ESCC患者100例,确定未合并其他影响患者生存的重大疾病,术中取切除的癌组织以及癌旁组织(距离癌组织5 cm以上的正常食管上皮组织)适量,迅速置于液氮中保存,其中男性患者62例,女性患者38例,年龄52~76(64.5±7.6)岁。ESCC诊断最终经病理证实,分化程度明确。TNM分期标准参照国际抗癌联盟(International Union Against Cancer,UICC) 2009年第7版,其中Ⅰ期患者9例,Ⅱ期患者51例,Ⅲ期40例;淋巴结发生转移的有57例,无淋巴结转移43例。本研究经本院医学伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。对患者进行复诊或电话随访,随访截止时间为2017年6月。
1.2 试剂与耗材DMEM培养液购自美国Gbico公司,0.25%胰酶购自美国Invitrogen公司,ALP活性检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司,CO2细胞培养箱购自德国Heraeus公司,采用日本OLYMPUS倒置显微系统(TH4-200),荧光定量PCR仪(LightCycler480)为罗氏公司产品,TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription kit试剂盒购自美国ABI公司。
1.3 细胞复苏以及培养ESCC细胞株Eca109、Kyse150以及正常食管上皮细胞Het-1a均购自中科院上海细胞库。由液氮罐中迅速取出冻存的细胞,至于37 ℃水浴锅解冻,然后接种于一次性细胞培养瓶(25 cm2)中,加入新鲜DMEM培养液5 mL,放入5% CO2培养箱内37 ℃培养,每2天换液1次。当贴壁细胞汇合度达到90%左右时,再进行传代(用0.25%的胰酶消化),对细胞进行计数后按1×105/mL浓度接种继续培养,用传至第3~5代的细胞进行诱导分化实验。
1.4 RNA提取 1.4.1 组织中RNA的提取由液氮中取出食管癌患者组织,加入研钵中,迅速磨成粉末状;取出100 mg新鲜研磨的粉末加入含有1 mL TRIzol裂解液的EP管中,混合均匀;室温静止5 min,加入200 μL氯仿,然后充分混匀,室温放置10 min;然后4 ℃,12 000 r/min离心15 min,取上层水相,于RNase-free的1.5 mL离心管中,加入等体积异丙醇,充分震荡混匀,冰上放置30 min;取出离心管,然后再4 ℃,12 000 r/min离心15 min,得到RNA沉淀;采用500 μL,75%的酒精对RNA沉淀进行2次洗涤,而后风干;加入50 μL RNase-free的水,室温溶解RNA;采用NanoDrop对总抽提的RNA进行浓度测定,而后置于-20 ℃备用。
1.4.2 细胞中RNA的提取对各组食管癌鳞状细胞经0.25%的胰酶进行消化,收集消化后的细胞悬液于15 mL离心管中;进行4 ℃低速(1 000 r/min)离心2 min,弃去上清,置于冰上;加入1 mL TRIzol裂解液,重悬并混匀细胞,置于冰上;向TRIzol裂解液中加入200 μL氯仿,剧烈震荡细胞悬液,室温放置5~10 min,然后采用4 ℃、12 000 r/min离心15 min;取离心之后的上层水相,于RNase-free的1.5 mL离心管中,加入等体积异丙醇,充分震荡混匀后,于冰上放置30~40 min;取出离心管,然后再4 ℃,12 000 r/min离心15 min,得到RNA沉淀;采用500 μL,75%的酒精对RNA沉淀进行2次洗涤,而后风干;加入50 μL RNase-free的水,室温溶解RNA;采用NanoDrop对总抽提的RNA进行浓度测定,而后置于-20 ℃备用。
1.5 细胞转染Eca109细胞转染严格按照Invitrogen公司的Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent说明书进行操作,其中miR-142-5p mimics以及mimics control均在上海生工生物进行合成(表 1),miR-142-5p mimic转染组转染miR-142-5p mimic,阴性对照组转染mimics control,空白对照组不做任何转染操作。
名称 | 序列(5′→3′) |
miR-142-5p mimics | 正义链:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU 反义链:AUCAAGGUCCGCUGUGAACACG |
mimics control | 正义链:UAGCCAUAUCGUCGAUACU 反义链:AGUAUCGACGAUAUGGCUA |
1.6 荧光定量PCR检测
按照ABI公司的TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription kit试剂盒操作说明书,对抽提的RNA进行体外反转录实验,得到cDNA产物;反应条件为:16 ℃,孵育30 min,42 ℃孵育30 min,85 ℃加热5 min,4 ℃保存。以得到的cDNA为模版,进行荧光定量PCR。采用TaqMan® Universal PCR Master Mix 20 μL反应体系,在罗氏LightCycler480仪器上操作,以U6作为表达检测的内参,ΔCt表示miR-142-5p的相对表达量,其中ΔCt=CtU6-CtmiR-142-5p,反应条件为:95 ℃,预变性10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s进行40个循环的扩增,引物信息见表 2。检测癌组织与癌旁组织的miR-142-5p的表达,与癌旁组织表达相比降低,称之为相对低表达。
基因 | 引物序列(5′→3′) |
miR-142-5p | 上游:CATAAAGTAGAAAGCAC 下游:CTAGGTGCGTTCAGTG |
U6 | 上游:TAGGGTGCTCGCTTCGGC 下游:CTGGTGTCGTGGAGTCG |
β-actin | 上游:GCTGTCCCTGTATGCCTC 下游:GATGTCACGCACGAT |
1.7 Western blot检测
分别取各转染组等量细胞,加入10倍的蛋白变性缓冲液,100 ℃变性5 min,将变性之后的蛋白液加入12.5% SDS-PAGE胶,90V恒压电泳100 min,至溴酚蓝跑出变性胶即可终止电泳,然后进行后续的转膜操作;取SDS-PAGE胶置于硝酸纤维素膜上,进行恒流转移,转膜完成后,采用3% BSA进行4 ℃封闭过夜,封闭完成后,先采用PBS缓冲液对硝酸纤维素膜进行洗涤,按1 :500浓度加入TGF-β2单克隆抗体,室温孵育45 min,然后采用PBS缓冲液对硝酸纤维素膜进行洗涤;开始二抗的孵育,按照1 :1 000加入HRP标记的二抗,室温孵育30 min,然后用PBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜,之后向膜上加入ECL化学发光剂进行化学发光,采用Kodak X进行曝光3 min左右,对硝酸纤维素膜进行成像。对成像之后的胶片,采用密度扫描仪对各个条带的光密度值进行定量,以β-actin作为内参照,使用其灰度值差值,来表示TGF-β2的相对表达量。
1.8 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件。其中计量资料以x±s表示,两组间比较采用t检验,计数资料以百分比表示,采用χ2检验。对随访结果绘制Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05为差异统计学意义。
2 结果 2.1 食管癌细胞株中miR-142-5p的表达荧光定量PCR检测结果显示:在Het-1a细胞系中miR-142-5p的相对表达最高(2.04±0.68),在低分化的Kyse150细胞株中miR-142-5p表达最低(1.12±0.31),在Eca109细胞株中miR-142-5p的相对表达量为1.53 ± 0.27。3种细胞系两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 食管鳞癌患者癌组织中miR-142-5p的表达荧光定量PCR检测结果显示:在食管鳞癌患者癌组织中miR-142-5p的相对表达量为0.78± 0.16,显著低于癌旁组织中的表达(1.43± 0.34,P<0.05)。
2.3 食管鳞癌患者临床特征与miR-142-5p表达的关系100例食管鳞癌患者癌组织中miR-142-5p相对低表达的有52例。<60岁患者与≥60岁患者miR-142-5p相对低表达的差异无统计学意义(P>0.05);不同性别患者癌组织中miR-142-5p相对低表达差异亦无统计学意义(P>0.05);临床Ⅲ期食管鳞癌患者共40例,miR-142-5p相对低表达的高达31例,较Ⅰ、Ⅱ期患者显著升高(P<0.05),miR-142-5p低表达率显著提高;淋巴结有转移的患者较淋巴结无转移的患者癌组织中miR-142-5p相对低表达率显著升高(P<0.05),表明miR-142-5p与食管鳞癌的转移相关;有饮酒史的患者较无饮酒史的患者miR-142-5p低表达率显著升高(P<0.05);有吸烟史的患者与无吸烟史的患者比较,miR-142-5p低表达差异无统计学意义(P>0.05,表 3)。
临床指标 | n | miR-142-5p相对低表达/例(%) | χ2值 | P值 |
年龄 | ||||
≥60岁 | 64 | 32(50.00) | 0.285 | 0.594 |
<60岁 | 36 | 20(55.56) | ||
性别 | ||||
男 | 62 | 29(46.77) | 1.785 | 0.182 |
女 | 38 | 23(60.53) | ||
临床分期 | ||||
Ⅰ期 | 9 | 1(11.11) | 19.79 | <0.001 |
Ⅱ期 | 51 | 20(39.22) | ||
Ⅲ期 | 40 | 31(77.50) | ||
淋巴结转移 | ||||
有 | 57 | 41(71.93) | 21.09 | <0.001 |
无 | 43 | 11(25.58) | ||
饮酒史 | ||||
有 | 67 | 43(64.18) | 12.07 | <0.001 |
无 | 33 | 9(27.27) | ||
吸烟史 | ||||
有 | 63 | 34(53.97) | 0.264 | 0.607 |
无 | 37 | 18(48.65) |
2.4 各组细胞中TGF-β2的表达
Western blot检测结果显示:miR-142-5p转染组细胞中TGF-β2蛋白表达显著下降,与阴性对照组以及空白对照组比较,差异均有统计学意义(0.54±0.08 vs 0.78±0.10、0.81±0.11,P<0.05,图 1)。
2.5 食管鳞癌患者中miR-142-5p的表达与预后
对食管鳞癌患者癌组织中52例miR-142-5p表达降低以及48例miR-142-5p表达未降低的患者进行为期3年的随访,其中miR-142-5p表达下降组的患者中位无进展期为19个月,而miR-142-5p表达未下降组患者中位无进展期为29个月,两组比较差异有统计学意义(P<0.05,图 2)。
3 讨论
我国是食管癌高发国家,发病人数占全球一半以上[10]。近年来,对miRNA和食管癌关系的研究日益深入。miRNA在食管癌中的表达存在差异,并且能调节食管癌的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学特性,表明miRNA参与了食管癌发生、发展等病理过程[11-12]。对miRNA与食管癌关系的研究,目前主要集中在miR-21、miR-143、miR-203、miR-375、miR-328、miR-196a、miR-106b-25等的异常表达[13]。王江峰等[14]的研究发现在84例食管鳞癌组织中,相比于癌旁组织,癌组织中miR-29b低表达有48例,正常表达的有28例,而高表达只有8例;进一步分析发现癌组织中miR-29b低表达的患者,其肿瘤浸润程度低,TMN分期早,预后效果较好;罗君等[15]在食管鳞癌患者组织中检测miR-31的表达发现:其较正常组织中的表达显著上调,推测其表达上调可能会促进鳞癌的发生、发展。KURASHIGE等[16]对患者血浆中的miR-21进行检测发现:食管鳞癌患者手术后血浆中miR-21存在明显的表达下调,暗示血浆miR-21水平可能与食管癌患者预后相关;在肝癌细胞中,miR-142-5p通过靶向调控IGF2BP3蛋白的表达,参与HCC细胞凋亡过程[9];在人巨噬细胞凋亡过程中,miR-142-5p通过下调靶基因TGF-β2的表达,促进巨噬细胞凋亡的发生[17]。
本研究选取100例食管鳞状细胞癌患者,进行miR-142-5p的表达检测发现:其在患者癌组织中存在显著低表达,与癌旁组织比较,差异有统计学意义(P<0.05);进一步通过细胞学培养实验发现:miR-142-5p在食管鳞癌细胞中低表达,相比于正常食管上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.05),并且在低分化组癌细胞中表达最低,相比于高分化组癌细胞差异有统计学意义(P<0.05);分析患者的临床特征与miR-142-5p在癌组织的表达关系发现:miR-142-5p的表达与患者性别、年龄以及吸烟史无关,而与患者食管鳞癌的分期、有无转移及饮酒史相关,随着食管癌疾病的发展,miR-142-5p在癌组织中呈现较低水平的表达,其中Ⅲ期患者癌组织中其表达较Ⅰ期显著降低(P<0.05);在食管癌转移的患者中,miR-142-5p在癌组织中呈现较低水平的表达,相比于未转移组差异有统计学意义(P<0.05);有饮酒史的患者中,miR-142-5p在癌组织中呈现较低水平的表达,相比于无饮酒史差异有统计学意义(P<0.05),表明食管鳞癌组织中miR-142-5p的表达与食管癌的发生有关,其表达上调与食管鳞癌的发展以及转移相关,暗示着其在食管鳞癌的发生、发展过程中起着重要的作用。本研究对100例患者进行了随访观察,其中有52例患者食管鳞癌组织中的miR-142-5p存在低表达,而48例患者食管鳞癌组织中的miR-142-5p表达与癌旁组织比较差异无统计学意义;绘制生存曲线进行分析发现:低表达miR-142-5p组的患者中位进展期为19个月,而表达未下降的食管鳞癌患者中无进展期为29个月,显著高于miR-142-5p低表达组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。体外细胞学实验还发现:在食管鳞癌细胞中miR-142-5p的表达与TGF-β2的表达相关,其可能通过在RNA水平调控TGF-β2基因的表达,从而参与到食管鳞癌的发生、发展过程中。
综上所述,在食管鳞状细胞癌患者中,癌组织中miR-142-5p较癌旁组织存在低水平表达。进一步细胞实验验证结果表明:miR-142-5p在食管鳞癌细胞中存在低表达,其可能通过调控TGF-β2基因的表达参与食管鳞癌的发展过程,与食管癌的发生、发展以及预后密切相关。本研究为临床治疗以及预后风险评估提供了实验基础。
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