2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院：检验科
2. Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，也是女性死于癌症的首位死因。在我国，乳腺癌发病率在城市及农村都位于女性癌症首位，乳腺癌患者每年的死亡数量和新发数量分别占全世界的9.6%和12.2%，疾病负担日益加重[1]。乳腺癌受多种遗传和环境因素共同所致，候选基因的单核苷酸多态性与乳腺癌易感性密切相关[2]。
生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族IAPs (inhibitor of apoptosis proteins)中抗凋亡作用最强，但结构最简单的蛋白[3]。其基因BIRC5位于17q25，长14.7 kb，具有3个内含子及4个外显子，含有一个杆状病毒IAP的重复序列。BIRC5在胎儿组织和各种人类恶性肿瘤组织中大量表达，但在正常组织或分化良好的成人组织中无表达[4]。既往研究发现，BIRC5基因在乳腺癌中高表达，并且和乳腺癌患者不良的预后相关[5, 6]。敲低BIRC5基因会抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡[7]。rs9904341位点是BIRC5启动子的一个功能性单核苷酸多态位点，(-31G>C; rs9904341)能改变细胞周期依赖元件和细胞周期同源性区域，影响BIRC5的表达，进而影响肿瘤遗传易感性[8-9]。然而关于BIRC5基因rs9904341位点多态性与乳腺癌易感性的关联，目前研究报道较少。本研究针对中国人群的遗传背景，结合病例对照研究设计，探索BIRC5基因rs9904341位点多态性与乳腺癌易感性之间的关联。
1 资料与方法 1.1 研究对象及样本收集病例组：为2012年1月到2013年8月期间在陆军军医大学西南医院就诊并经病理组织学确诊的新发女性乳腺癌患者，共709人。纳入标准：①经病理确诊的女性乳腺癌患者；②血样采集前未接受任何治疗。排除标准：①妊娠状态；②心衰、缺血性心脏病；③严重肝肾功能不全；④其他恶性肿瘤病史；⑤乳腺癌家族史患者。
对照组：同期来自医院同一时期门诊体检人群，749例。纳入标准：①女性，无肿瘤病史；②非妊娠状态。排除标准：①心衰、缺血性心脏病患者：②严重肝肾功能不全者；③乳腺癌家族史患者。
所有研究对象均无亲缘关系。病例组在接受治疗前抽取5 mL外周静脉血，对照组在体检后抽取5 mL外周静脉血。将收集后的标本进行单个核细胞分离，于-80 ℃保存。本研究经陆军军医大学西南医院伦理委员会审核批准，所有纳入研究对象均签署知情同意书。
1.2 基因组DNA的提取采用Wizard ®基因组DNA纯化试剂盒(Promega，USA)从外周血细胞中提取基因组DNA，于80 ℃冰箱保存待用。
1.3 基因分型 1.3.1 引物设计根据GenBank提供的基因序列，使用Oligo 7进行引物设计。引物序列：正向引物5′-AGGACTACAACTCCCGGCACAC-3′，反向引物5′-AGATGCGGTGGTCCTTGAGAAA-3′。
1.3.2 PCR扩增利用聚合酶链反应-连接酶反应(polymorphism chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR)技术对rs9904341位点进行基因分型。PCR扩增体系包括：1× PCR buffer, 3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U Taq酶，1 μL引物，20 ng模板，总反应体积为20 μL。反应条件为：首先95 ℃反应2 min；然后94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min 30 s，共扩增11个循环；94 ℃ 20 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s共扩增24个循环；最后72 ℃延伸2 min。
1.3.3 LDR检测LDR缓冲溶液中加1× buffer, 80 U DNA连接酶，1 μL标记的寡核苷酸混合物，2 μL探针混合物和5 μL PCR产物。反应条件为：95 ℃反应2 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min共38个循环。取0.5 μL反应产物用ABI 3730xl DNA测序仪进行检测，原始数据用Genemapper 4.1 (Applied Biosystems, USA)软件进行分析。
1.3.4 质量控制随机抽取5%的样本，共29例，由两位实验者重复检测，结果100%一致。
1.4 统计学分析病例和对照组间年龄和绝经状态的比较分别采用t检验和卡方检验。采用拟合优度χ2检验评估SNP位点在对照组中基因型频率分布是否满足哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。在不同遗传模型(共显性、显性、隐性、等位基因模型)下，采用非条件多因素Logistic回归模型评估SNP位点与乳腺癌易感性的关联，计算比值比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence, interval, CI)，校正年龄(连续变量)和绝经状态。再按年龄和绝经状态进行分层分析，分析在不同亚组中，SNP位点与乳腺癌易感性的关联。使用SAS 9.3(SAS Institute, Cary, NC, USA)软件进行统计分析，所有统计检验为双侧概率检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 研究对象基本情况本研究共纳入女性乳腺癌病例709人，对照749人，两组研究对象的基本情况如表 1所示。病例组年龄(48.37±10.35)岁，对照组年龄(44.81±10.01)岁，两组年龄差异有统计学意义(P＜0.001)，病例组已绝经的比例显著高于对照组(36.95%与30.71%, P=0.012)(表 1)。
| n | 年龄(岁) | 年龄段 | 绝经状态 | ||||
| ≤ 50岁[例数(%)] | ＞50岁[例数(%)] | 未绝经[例数(%)] | 已绝经[例数(%)] | ||||
| 病例组 | 709 | 48.37±10.35 | 460(64.88) | 249(35.12) | 447(63.05) | 262(36.95) | |
| 对照组 | 749 | 44.81±10.01 | 556(74.23) | 193(25.77) | 519(69.29) | 230(30.71) | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | 0.012 | ||||
2.2 哈迪-温伯格平衡检验
对照组位点的基因型分布频率符合HWE平衡(P=1.000)，提示样本来自一个稳定的群体。病例组的最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)为0.48，对照组为0.44。
2.3 rs9904341位点基因型分布频率及与乳腺癌易感性的关联病例组中GG、GC、CC基因型分布分别为191(26.9%)、354(49.9%)、164(23.1%)；对照组中GG、GC、CC基因型分布分别为184(24.6%)、382(51.0%)、183(24.4%)。基因型频率分布差异无统计学意义(P=0.566)(表 2)。
| 组别 | n | 共显性 | 显性 | 隐性 | 等位基因 | ||||||||
| GG | GC | CC | GG | GC+CC | GG+GC | CC | G | C | |||||
| 病例组 | 709 | 191 | 354 | 164 | 191 | 518 | 545 | 164 | 736 | 682 | |||
| 对照组 | 749 | 184 | 382 | 183 | 184 | 565 | 566 | 183 | 750 | 748 | |||
| 校正OR (95%可信区间) |
参照 | 0.87 (0.68, 1.12) |
0.81 (0.60, 1.09) |
参照 | 0.85 (0.67, 1.08) |
参照 | 0.89 (0.70, 1.14) |
参照 | 0.90 (0.78, 1.05) |
||||
| P值 | 0.283 | 0.169 | 0.187 | 0.352 | 0.169 | ||||||||
| 校正OR值调整了年龄(连续变量)和绝经状态 | |||||||||||||
采用非条件多因素Logistic回归模型，校正年龄和绝经状态，分析rs9904341位点与乳腺癌易感性的关联，结果显示：基于共显性、显性、隐性、等位基因模型，rs9904341位点与乳腺癌易感性均无显著性关联(P>0.05)(表 2)。
2.4 rs9904341位点及与乳腺癌易感性关联的分层分析按照年龄进行亚组分析，发现在>50岁年龄组，共显性模型中，GC基因型相比于GG基因型者患乳腺癌的风险显著降低(校正OR=0.61，95%CI=0.38~0.98，P=0.043)。在显性模型中，显性基因者患乳腺癌的风险显著降低(校正OR=0.61，95%CI=0.38~0.96，P=0.031)(表 3)。
| 分组 | n | 共显性 | 显性 | 隐性 | 等位基因 | |||||||||
| GG | GC | CC | GG | GC+CC | GG+GC | CC | G | C | ||||||
| ≤50岁 | 病例组 | 460 | 119(26%) | 236(51%) | 105(23%) | 119(26%) | 341(74%) | 355(77%) | 105(23%) | 474(52%) | 446(48%) | |||
| 对照组 | 556 | 144(26%) | 278(50%) | 134(24%) | 144(26%) | 412(74%) | 422(76%) | 134(24%) | 566(51%) | 546(49%) | ||||
| 校正OR (95%可信区间) |
参照 | 0.98 (0.74, 1.35) |
0.93 (0.65, 1.33) |
参照 | 0.98 (0.73, 1.30) |
参照 | 0.93 (0.69, 1.25) |
参照 | 0.97 (0.81, 1.15) |
|||||
| P值 | 0.982 | 0.686 | 0.861 | 0.637 | 0.695 | |||||||||
| ＞50岁 | 病例组 | 249 | 72(29%) | 118(47%) | 59(24%) | 72(29%) | 177(71%) | 190(76%) | 59(24%) | 262(53%) | 236(47%) | |||
| 对照组 | 193 | 40(21%) | 104(54%) | 49(25%) | 40(21%) | 153(79%) | 144(75%) | 49(25%) | 184(48%) | 202(52%) | ||||
| 校正OR (95%可信区间) |
参照 | 0.61 (0.38, 0.98) |
0.60 (0.34, 1.05) |
参照 | 0.61 (0.38, 0.96) |
参照 | 0.84 (0.53, 1.32) |
参照 | 0.78 (0.59, 1.02) |
|||||
| P值 | 0.043 | 0.072 | 0.031 | 0.439 | 0.072 | |||||||||
| 校正OR值调整了绝经状态 | ||||||||||||||
按照绝经状态进行亚组分析，发现在绝经后的女性亚组中的结果与>50岁年龄组相似，rs9904341位点在共显性和显性模型下都与乳腺癌易感性显著相关，共显性模型中GC基因型、显性模型中显性基因者(GC+CC)相比于GG基因型者患乳腺癌的风险显著降低(校正OR=0.61，95% CI=0.41~0.97，P=0.038；校正OR=0.63，95% CI=0.42~0.95，P=0.029)(表 4)。
| 分组 | n | 共显性 | 显性 | 隐性 | 等位基因 | |||||||||
| GG | GC | CC | GG | GC+CC | GG+GC | CC | G | C | ||||||
| 未绝经 | 病例组 | 447 | 112(25%) | 228(51%) | 107(24%) | 112(25%) | 335(75%) | 340(76%) | 107(24%) | 452(51%) | 442(49%) | |||
| 对照组 | 519 | 134(26%) | 255(49%) | 130(25%) | 134(26%) | 385(74%) | 389(75%) | 130(25%) | 523(50%) | 515(50%) | ||||
| 校正OR (95%CI) |
参照 | 1.02 (0.74, 1.40) |
0.94 (0.65, 1.36) |
参照 | 0.99 (0.74, 1.34) |
参照 | 0.93 (0.69, 1.25) |
参照 | 0.97 (0.81, 1.16) |
|||||
| P值 | 0.913 | 1.355 | 0.952 | 0.622 | 0.736 | |||||||||
| 已绝经 | 病例组 | 262 | 79(30%) | 126(48%) | 57(22%) | 79(30%) | 183(70%) | 205(78%) | 57(22%) | 284(54%) | 240(46%) | |||
| 对照组 | 230 | 50(22%) | 127(55%) | 53(23%) | 50(22%) | 180(78%) | 177(77%) | 53(23%) | 227(49%) | 233(51%) | ||||
| 校正OR (95%CI) |
参照 | 0.63 (0.41, 0.97) |
0.63 (0.38, 1.07) |
参照 | 0.63 (0.42, 0.95) |
参照 | 0.86 (0.56, 1.32) |
参照 | 0.8 (0.62, 1.03) |
|||||
| P值 | 0.038 | 0.085 | 0.029 | 0.489 | 0.077 | |||||||||
| 校正OR值调整了年龄 | ||||||||||||||
3 讨论
survivin在抑制凋亡、促进增殖方面发挥重要作用，已有研究表明其在多种癌症包括乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、卵巢癌中高表达[10]。转录水平的调控对survivin的表达有着重要影响，其编码基因BIRC5启动子的活性受到多种因子的调控，其中之一是启动子区的细胞周期依赖性元件和细胞周期同源性区域。BIRC5基因启动子区多态性位点-31G>C(rs9904341)位于启动子区细胞周期依赖性元件和细胞周期同源性区域的抑制因子结合位点，可能通过影响抑制因子结合的亲和力从而影响启动子活性，进而影响BIRC5在肿瘤和正常组织中的表达[11]。
目前已有较多研究探索-31G>C(rs9904341)位点多态性与多种癌症易感性的关联，但结论并不一致。几项meta分析显示，-31G>C(rs9904341)位点多态性与癌症易感性显著相关，CC基因型者较G等位基因携带者(CG+GG)的癌症易感性增加，这可能是由于与G等位基因相比，C等位具有较高的转录活性，CC基因型者较CG和GG者BIRC5基因表达增加[12-16]。但在不同肿瘤、不同人群中结果不完全一致，-31G>C(rs9904341)位点多态性与胃癌、食管癌易感性无显著性关联[13]，在亚洲人中与癌症有显著关联，但是在白种人中与癌症的关联并不显著[16]。
在乳腺癌方面，目前关于rs9904341位点多态性与乳腺癌易感性的关联研究较少，RASOOL等[17]在印度北部人群中开展了一项相关研究，发现C等位基因与G等位基因相比，能显著增加乳腺癌的发病风险。而在本研究中，总的分析结果显示，rs9904341位点多态性与乳腺癌易感性无显著关联；在特征的亚组人群中，C等位基因携带者(CG+CC)较GG基因者患乳腺癌易感性显著降低。我们的研究结果与这项印度研究结果并不一致，可能是由于研究人群来自不同种族。此外，样本量差异较大，本研究纳入709名病例和749名对照，而印度研究仅纳入190名病例和200名对照，样本量较小可能会导致统计学效能不足。本研究病例和对照组的年龄有显著差异，由于条件限制并未收集和调整其他混杂变量，可能对结果造成影响。因此，还需要更多大样本的研究进一步明确-31G>C(rs9904341)位点多态性与乳腺癌易感性的关联，探索其影响乳腺癌发病风险的确切机制。
在本研究中，我们发现rs9904341位点与乳腺癌易感性的关联局限于>50岁年龄组和已绝经女性，提示该位点与雌激素可能存在交互作用，从而影响高龄和已绝经人群乳腺癌的发生风险。查阅HaploReg在线数据库[18] POL2(DNA polymerase epsilon catalytic subunit，DNA聚合酶ε催化亚基)等转录因子。而已有文献报道雌激素与雌激素受体结合后可通过转录调控POL2发挥生物学功能[19]。结合本研究结果，我们推测rs9904341可能通过参与雌激素-雌激素受体-POL2这一信号通路的生物学作用和调控，进而影响乳腺癌的发生。
本研究是基于医院的大样本病例对照研究，探索了亚洲女性人群BIRC5基因rs9904341位点多态性与乳腺癌易感性的关联。但本研究也存在一些局限性：第一，本人群比单一，需要在多个人群中进行验证。第二，应用以医院为基础的病例对照研究设计可能存在选择偏倚，本研究中病例组与对照组的年龄有显著差异，但我们在统计分析中校正了年龄的影响，尽可能降低偏倚。第三，本研究收集到的其他混杂因素较少，可能存在残余混杂。
综上所述，本研究发现BIRC5基因-31G>C(rs9904341)位点多态性与乳腺癌易感性无显著关联，在>50岁年龄组和已绝经女性人群中，C等位基因携带者(CG+CC)较GG基因者患乳腺癌易感性显著降低。本研究的结果需要在其他人群中，采用更多大样本的研究进一步证实，以及功能研究探索-31G>C(rs9904341)位点多态性影响乳腺癌发病风险的确切机制。
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