动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)严重威胁人类心血管健康[1-2]，在其进程中，血管内皮细胞氧化应激损伤是始动环节，已成为AS防治的重要靶点[3-5]。前期研究表明，多种植物性食物中广泛存在的多酚类植物化学物——白藜芦醇(resveratrol，RSV)具有潜在的心血管保护和抗AS效应，但其具体机制尚未完全阐明[6]。新近研究表明，细胞转录因子EB(transcription factor EB, TFEB)作为螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子MiTF/TFE家族成员之一，在调节细胞代谢稳态和抑制氧化应激损伤中发挥了关键作用[7-8]。TFEB不仅参与了个体发育、血管形成，还是自噬以及溶酶体合成等代谢调控通路中的重要调控分子[9-11]。本实验室前期研究发现，RSV可以通过调节自噬发挥内皮保护效应[12]。但是，白藜芦醇对TFEB是否存在相关调控机制尚无相关研究。同时，TFEB是否是白藜芦醇发挥内皮保护效应的关键因素也亟待探索。棕榈酸(palmitate，PA)学名“十六烷酸”，又叫软脂酸，是一种饱和高级脂肪酸，常用于建立细胞氧化应激、脂质过氧化等损伤模型。因此，本研究以原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为研究对象，用PA处理细胞，建立氧化应激损伤模型，围绕TFEB探讨了RSV在抑制HUVECs氧化应激损伤中的可能作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂RSV、PA以及Histone H3抗体均购自美国Sigma公司；CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒购自日本Dojindo公司；DMEM液体培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)荧光探针、脂质氧化MDA检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；TFEB siRNA (human, sc-38509)、control siRNA (sc-44230)、siRNA转染试剂(sc-29528)以及β-actin抗体均购自美国Santa公司；TFEB抗体购自Cell Signaling Technology公司；RSV以DMSO溶解至储备浓度100 mmol/L，于-20 ℃保存，全程避光；PA用NAOH梯度温度溶解，储备浓度为5 mmol/L，-20 ℃保存。
1.1.2 细胞原代人脐静脉内皮细胞来源于陆军军医大学第一、二附属医院妇产科，取足月新生儿脐静脉，按照本实验室原代内皮细胞分离培养方法进行实验，取第3~5代细胞用于实验[13]。本研究2014年获得第三军医大学伦理委员会批准。
1.2 实验处理和分组用不同浓度(100、150、200、250、300 μmol/L)、不同时间(14、16、18、20、22、24 h)的PA处理内皮细胞，CCK-8法检测细胞增殖活力，确定PA建模的适宜浓度和时间。100、200、300 μmol/L PA处理细胞24 h，荧光酶标仪检测细胞内ROS和MDA水平，建立内皮细胞氧化应激损伤模型。
检测RSV对PA诱导的内皮细胞氧化应激损伤的影响，实验分组为:①对照组；②200 μmol/L PA处理24 h组；③不同浓度白藜芦醇预处理2 h，再加200 μmol/L PA处理24 h组；④白藜芦醇(10 μmol/L)单独处理组。
检测TFEB在RSV抗氧化应激中的作用，Western blot实验分组为:①对照组; ②200 μmol/L PA处理24 h组；③白藜芦醇(10 μmol/L)预处理2 h，再加200 μmol/L PA处理24 h组。细胞增殖活力、ROS水平以及MDA水平检测实验分组为：①对照组; ② 200 μmol/L PA处理24 h组; ③白藜芦醇(10 μmol/L)预处理2 h，再加200 μmol/L PA处理24 h组；④TFEB siRNA转染，再白藜芦醇(10 μmol/L)预处理2 h，然后200 μmol/L PA处理24 h组。
1.3 方法 1.3.1 细胞增殖活力检测取生长状态良好的第3~5代HUVECs，以2.5×104个/mL密度接种到96孔板。待细胞贴壁后，按CCK-8试剂盒说明书进行后续处理。结果用酶标仪在490 nm处检测各组光密度值[D(490)]。设空白组细胞增殖活力为100%，其余各组细胞增殖活力=[处理组D(490)/空白组D(490)]×100%。
1.3.2 荧光酶标仪检测ROS生成接种HUVECs方法同上，用无血清培养基稀释DCFH-DA荧光染料至10 μmol/L，处理细胞后于37 ℃避光孵育20 min，吸弃染料，用无血清培养基轻洗细胞3次，荧光酶标仪检测荧光强度，全过程避光。DCFH-DA本身没有荧光，进入细胞后被ROS氧化为有带绿色荧光的DCF，通过检测DCF的荧光强度即可判断细胞内活性氧的水平。IPP 5.0软件分析各组平均荧光强度。
1.3.3 MDA试剂盒检测脂质过氧化水平丙二醛(malondialdehyde, MDA)是一种脂质氧化的天然产物。氧化应激时，细胞会发生脂质氧化，通过检测MDA的含量即可代表脂质氧化的水平。收集细胞进行充分裂解，1 600×g离心10 min，取上清，按试剂盒说明书进行后续处理。酶标仪检测读数，再根据标准曲线计算出样品上清液中的MDA含量，最后通过单位质量的蛋白含量来表示最初样品中的MDA含量。
1.3.4 qRT-PCR法检测TFEB mRNA表达用TRIzol总RNA提取试剂，提取各组RNA，核酸蛋白分析仪测定D(260)/D(280)及总RNA浓度。各组分别取2 μg总RNA，按照常规方法进行逆转录反应，cDNA产物放于-20 ℃保存。配制qPCR反应体系，进行实时荧光定量PCR，每组各3个平行。目的基因(TFEB)和内参基因(GAPDH、β-actin)的引物序列如表 1所示。IQ5.0软件进行结果分析。
| 基因 | 引物序列 | 产物大小/bp |
| TFEB | 正义链：5′-ACCTGTCCGAGACCTATGGG-3′ | |
| 反义链：5′-CGTCCAGACGCATAATGTTGTC-3′ | 1 073 | |
| β-actin | 正义链：5′-CGAGGCCCCCCTGAAC-3′ | |
| 反义链：5′-GCCAGAGGCGTACAGGGATA-3′ | 324 | |
| GAPDH | 正义链：5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′ | |
| 反义链：5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′ | 616 |
1.3.5 Western blot检测TEFB在白藜芦醇抑制氧化应激损伤中的作用
使用Solarbio公司核蛋白提取试剂盒(货号R0050)，按说明书操作分离各组的核蛋白和浆蛋白。用Solarbio公司的BCA蛋白定量试剂盒(货号PC0020)测定蛋白浓度，变性各组蛋白，保存在-80 ℃备用。各组分别取60 μg蛋白进行电泳，然后电转移至0.22 μm的PVDF膜上。5% BSA封闭2 h，用一抗稀释液按1 :1 000稀释一抗，4 ℃摇床孵育过夜，用TBST振摇洗膜10 min×3次，按1 :5 000稀释二抗，室温孵育2 h，然后再洗膜10 min×3次。ECL底物化学发光显色后机器扫描存盘，用Image lab软件进行条带分析。
1.3.6 抑制TFEB对RSV调控HUVECs氧化应激损伤的影响① 接种：取第3~5代呈对数生长的HUVECs，2×105个细胞每孔接种到6孔板培养。②制备A液：6 μL的siRNA加入100 μL无血清培养基中轻柔混匀。③制备B液：6 μL siRNA转染试剂加入100 μL无血清培养基中混匀。④将A液轻柔加入B液混匀，室温放置30 min。⑤无血清培养基洗细胞2次，弃上清。⑥在原EP管中(即A+B=200 μL)，加入800 μL无血清培养基，混匀后加入6孔板中。⑦孵箱培养5~7 h，根据细胞状态确定终止孵育时间。⑧终止：每孔加入1 mL含双倍血清、双倍双抗的培养基。⑨继续培养24 h后换液为完全培养基，接着开始进一步实验。
1.4 统计学分析数据以x±s表示，用GraphPad Prism 6软件作图，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 HUVECs形态学观察实验中选取P3~P6代的HUVECs，正常组HUVECs呈贴壁生长，鹅卵石样排列，增殖状态良好(图 1A)。浓度为200 μmol/L的PA处理24 h后，HUVECs出现形态学改变，细胞梭变呈不规则形态，细胞贴壁减少(图 1B)。
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| A:空白对照组；B: 200 μmol/L PA处理组 图 1 倒置显微镜观察两组HUVECs形态变化(×200) |
2.2 细胞增殖活力检测
用不同浓度(100、150、200、250、300 μmol/L)的PA处理HUVECs 24 h，以及用200 μmol/L PA处理HUVECs不同时间(14、16、18、20、22、24 h)，CCK-8法检测细胞增殖活力发现，PA的半抑制浓度(IC50)约为200 μmol/L，处理24 h能显著抑制HUVECs增殖活力(P＜0.01，图 2)。
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| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与空白对照组比较 图 2 不同浓度(A)、不同时间(B)PA处理对HUVECs增殖活力的影响 |
2.3 PA诱导的HUVECs氧化应激损伤检测
荧光酶标仪检测HUVECs的ROS和MDA水平发现，与对照组比较，200、300 μmol/L的PA处理24 h后，细胞内ROS和MDA水平显著升高(P < 0.01，图 3)，并与PA浓度呈剂量依赖关系，说明PA可诱导HUVECs氧化应激损伤。
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| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与空白对照组比较 图 3 荧光酶标仪检测细胞内ROS(A)及MDA(B)水平 |
2.4 RSV对PA诱导的内皮细胞氧化应激损伤的影响
CCK-8法检测细胞增殖活力发现，不同浓度(0.1、1.0、10.0 μmol/L)白藜芦醇预处理2 h后，可以抑制PA诱导的内皮细胞活力降低，并与RSV浓度呈剂量依赖关系(P < 0.05, 图 4A)。荧光酶标仪检测ROS和MDA水平发现，PA 200 μmol/L处理HUVECs 24 h，能显著升高细胞ROS和MDA水平，而10 μmol/L白藜芦醇预处理2 h能显著抑制该作用(P < 0.01, 图 4B、C)。结果显示：白藜芦醇能显著抑制PA诱导的内皮细胞氧化应激损伤。
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| 1：对照组；2：PA 200 μmol/L组；3~5:0.1、1.0、10.0 μmol/L白藜芦醇+PA 200 μmol/L组；6：10 μmol/L白藜芦醇组A：CCK-8法检测细胞增殖活力；a：P < 0.05，与4组比较；b：P < 0.01，与5组比较；B：荧光酶标仪检测ROS水平；a：P < 0.01，与2组比较；C：荧光酶标仪检测MDA水平；a：P < 0.01，与PA 200 μmol/L组比较 图 4 RSV对PA诱导的内皮细胞氧化应激损伤的影响 |
2.5 RSV对TFEB的mRNA和蛋白表达水平的影响
qRT-PCR法检测RSV对TFEB的mRNA表达水平的影响，结果显示，与对照组相比，PA 200 μmol/L处理HUVECs 24 h，对TFEB mRNA表达有明显抑制作用，而10 μmol/L的RSV预处理后，TFEB的mRNA表达显著增加(P < 0.01，图 5A)。Western blot检测结果显示，与对照组比较，PA对细胞核TFEB和细胞质TFEB的蛋白表达均有明显抑制作用(P < 0.01)，白藜芦醇预处理后，细胞核TFEB和细胞质TFEB的蛋白表达均显著增加(图 5B、C)，且细胞核TFEB的表达增加更多。结果显示:白藜芦醇可以显著上调PA刺激下的TFEB表达水平，且可能促进了TFEB的核转位。
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| 1：对照组；2：PA 200 μmol/L组；3: 10 μmol/L白藜芦醇+PA 200 μmol/L组A：qRT-PCR法检测TFEB的mRNA表达水平；B：Western blot检测TFEB的蛋白表达水平；C：半定量分析；a：P < 0.01，与PA 200 μmol/L组比较 图 5 RSV对TFEB的mRNA和蛋白表达水平的影响 |
2.6 抑制TFEB对RSV调控HUVECs氧化应激损伤的影响
细胞进行siRNA转染后，RSV预处理2 h，PA处理24 h，酶标仪检测ROS和MDA水平，结果显示，RSV预处理能明显抑制PA诱导的内皮细胞ROS和MDA水平升高，而TFEB siRNA转染组中，RSV的作用被明显抑制(P < 0.01，图 6A、B)。CCK-8法检测结果显示，白藜芦醇预处理能显著抑制PA诱导的细胞活力降低，而TFEB siRNA转染组，白藜芦醇的作用明显减弱(P < 0.01，图 6C)。结果显示：RSV是通过调控TFEB从而抑制PA诱导的内皮细胞氧化应激损伤。
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| 1：对照组；2：PA 200 μmol/L组；3: 10 μmol/L白藜芦醇+PA 200 μmol/L组；4：10 μmol/L白藜芦醇+PA 200 μmol/L+siTFEB干扰组；A：ROS水平检测；B：MDA水平检测；C：细胞增殖活力检测；a：P < 0.01，与10 μmol/L白藜芦醇+PA 200 μmol/L组比较 图 6 抑制TFEB对RSV调控HUVECs氧化应激损伤的影响 |
3 讨论
RSV作为多酚类植物化合物的代表，已有许多研究表明其具有多种健康生物学功效，可以调节脂质代谢，减少血小板聚集，诱导血管舒张，还可以抑制ROS的生成，增加NO生成，抑制炎症因子表达，维持内皮功能稳态，具有显著的心血管保护作用[14-19]。但是，RSV的具体作用机制至今尚未完全阐明。本研究用PA处理HUVECs，通过检测细胞活力指标、氧化应激指标以及脂质过氧化指标，发现PA处理诱导了内皮细胞氧化应激损伤，RSV预处理可显著抑制细胞氧化应激水平，维持内皮细胞稳态。在这一抗氧化效应基础上，我们进一步探索RSV可能的作用机制。
前期研究表明，RSV可以通过调节沉默信息调节子SIRT1依赖的自噬信号通路，发挥与能量限制(caloric restriction，CR)相似的促长寿效应[20]。RSV可以通过激活自噬，维持内皮细胞稳态[12]。并且，RSV可以通过激活AMPK-SIRT1-PGC1α轴减轻肾脏脂毒性[21]，以及可以通过激活AMPK-PGC1α-SIRT3轴发挥抗氧化应激效应[6]。SETTEMBRE等[9]研究发现，饥饿可以诱导TFEB产生，TFEB是一种调节溶酶体生成和自噬产生的重要转录因子，可以激活PGC1α相关脂质代谢通路，同时，激活TFEB也可以产生CR类似效应。因此，我们推测，TFEB的激活可能是RSV发挥保护性生物效应的关键因素，而目前尚少见相关研究报道。因此，我们运用TFEB siRNA转染等实验技术，开展了围绕TFEB的RSV新机制探索研究。
本研究发现，RSV可显著抑制PA诱导的TFEB mRNA和蛋白表达水平降低，并且，胞核蛋白中的TFEB增加程度较胞质蛋白更为明显，提示RSV有促进TFEB核转位，激活TFEB效应。转染TFEB siRNA后，RSV的抗氧化应激保护效应被明显减弱，由此，揭示了在RSV抑制PA诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤中，TFEB是其关键环节。TFEB的研究将可能成为RSV抗AS研究的一个突破点，因此，下一步可以围绕TFEB的上下游通路进行探索，例如上游可能存在RSV-AMPK-TFEB-PGC1α调节轴。此外，TFEB作为调节自噬及溶酶体生成过程中的关键分子，我们还可以进一步探索TFEB对相关的基因如ATP6V0D1、LAMP1、CTSB、MAP1LC3B、UVRAG等mRNA表达的影响；以及对LC3、P62、LAMP1等蛋白表达的影响；还可以做自噬小体检测、溶酶体生成检测、TFEB核转位荧光检测等，这也都是本团队后续的研究重点。
综上所述，本研究发现RSV通过激活TFEB，抑制了PA诱导的HUVECs氧化应激损伤(图 7)。这对于探索AS防治的新策略具有重要价值，为将来围绕TFEB开展RSV抗AS研究提供了实验基础和理论支持。
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| 图 7 RSV通过激活TFEB抑制PA诱导的HUVECs氧化应激损伤模式 |
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