非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是导致肝细胞癌的主要因素之一[1]，目前NAFLD在中国的发病率已经超过了10%，而在发达国家中更是高达20%左右[2]，但针对NAFLD仍缺乏特效的预防和治疗药物。“二次打击假说”认为：第一次打击以脂质在肝脏中大量蓄积为主要特征，而没有炎症性改变或仅伴有非常轻微的炎症改变；然后引发第二次打击，以肝脏的炎症性改变、坏死甚至纤维化的发生为主要特征，由异常细胞因子释放、细胞氧化应激所引起，是疾病发生发展的重要过程[3]。肝脏产生炎症反应及脂代谢紊乱是NAFLD发生过程中的重要因素，而炎症反应更是贯穿其始终[4]。CD36属于B类清道夫受体家族，是一个双跨膜表面糖蛋白[5-6]。CD36能够与众多的配体识别并发生反应[7]。CD36在脂肪酸转运中具有重要的作用，如与肌肉、心肌对脂肪酸的摄取能力有关[8-9]。
本课题组已有研究表明，炎症因子能够刺激肝脏、肾脏等CD36的表达上调[10-11]。本研究使用炎症因子TNF-α和IL-6处理HepG2细胞，诱发肝细胞炎症反应，观察炎症对细胞脂质沉积和外源性脂肪酸摄取的影响；进一步对HepG2细胞进行CD36 siRNA干扰，旨在阐明CD36在其中所扮演的角色。
1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂HepG2购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)。细胞培养基(DMEM)及胎牛血清购自美国HyClone公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)购于美国Sigma公司；Trizol RNA抽提试剂、SYBR Green PCR Master Mix及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。TG和FFA检测试剂盒分别购于南京建成、武汉华美；细胞ROS和H2O2检测试剂盒均购于碧云天生物技术研究所；荧光标记脂肪酸(BODIPY FL C16)购自美国Invitrogen公司。转染试剂X-treme GENE SiRNA Transfection Reagent购自瑞士Roche公司。PCR引物采用TaqMan Primer Express软件设计，由北京六合华大基因科技公司合成，CD36 siRNA由上海吉玛制药有限公司化学合成。
1.2 细胞培养HepG2细胞在DMEM高糖(不含丙酮酸钠)培养基中培养，其中含有胎牛血清(10%)和青链霉素(100 U/mL、100 μg/mL)。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，1~2 d换液，3~4 d传代。
1.3 实验分组待细胞生长至汇合度70%~80%时，用含0.2% BSA的无血清DMEM培养基处理，24 h后再按照以下处理分为3个组：(1)Control组：0.2% BSA+0.04 mmol/L软脂酸；(2)TNF-α组：0.2% BSA+0.04 mmol/L软脂酸+25 ng/mL TNF-α；(3)IL-6组：0.2% BSA+0.04 mmol/L软脂酸+20 ng/mL IL-6。以上3组处理24 h后收集细胞进行以下检测。
1.4 小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)的合成及转染siRNA交由上海吉玛公司设计和合成(CD36-siRNA正义链：5′-GGCUGUGUUUGGAGGUAUUCUTT-3′，反义链：5′-AGAAUACCUCCAAACACAGCCTT-3′)和阴性对照siRNA(NC-siRNA正义链：5′-UUCUCCGA-ACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUU-CGGAGAATT-3′)。
当细胞融合度至30%~50%时，将CD36-siRNA及NC-siRNA分别转染到HepG2细胞：50 μL DMEM培养基加入0.5 μg DNA，短暂轻柔漩涡，加入1.5 μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，短暂轻柔漩涡，室温孵育15~30 min(15~25 ℃)，将转染复合物逐滴加入到细胞中，7~8 h在显微镜下观察转染效率。
1.5 实时荧光定量PCR检测mRNA的表达使用RNAiso Plus提取细胞总RNA，然后用PrimeScript®RT reagent Kit将总RNA反转录成cDNA。反转录条件是：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，保存于-20 ℃。再以cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达水平。PowerSYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行扩增，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，40个循环。反应体系为25 μL，用ΔΔCt计算基因的表达水平，公式如下：ΔCt=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，实验组相对于对照组基因表达水平的倍数=2-ΔΔCt。设计的引物序列见表 1。
| 基因名称 | 引物序列 |
| CD36 | 上游: 5′-ACGGGCTGAGCAAGGTTGA-3′ |
| 下游: 5′-TTCGTTGGGTGGGTAGATGG-3′ | |
| β-actin | 上游: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′ |
| 下游: 5′-GCCGATCCACACGGAGTA-3′ |
1.6 TG及FFA含量的测定
使用6孔板接种细胞(每孔接种约5×105个)，经过实验处理后，收集细胞并提取细胞脂质，然后收集细胞上清液，在真空条件下进行干燥。用比色法检测其TG含量，ELISA法检测FFA的含量；再分别计算TG、FFA与细胞总蛋白量的比值，得出各组TG及FFA的相对含量。
1.7 H2O2及ROS含量测定分别按照检测试剂盒说明书进行操作，对于ROS的测定，需先使用10 μmol/L的2’, 7’-二氯荧光素二醋酸盐荧光探针(2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)在37.0 ℃孵育细胞40 min。然后BCA法测定各组细胞的蛋白浓度，分别计算H2O2及ROS含量与总蛋白量的比值，求出各组H2O2及ROS的相对含量。
1.8 统计学分析所有数据采用GraphPad Prism 5统计分析软件进行处理，数据均以x±s表示，独立样本t检验用于两样本均数间的比较，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 炎症因子促进HepG2细胞TG及FFA的累积炎症因子处理后，HepG2细胞的FFA及TG含量均显著增加。其中IL-6组的FFA含量增加110.97%(P=0.000)，TG含量增加45.96%(P=0.229)；TNF-α组的FFA含量增加99.82%(P=0.000)，TG含量增加39.95%(P=0.005)。见图 1。
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| A:FFA含量；B:TG含量；a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较 图 1 炎症因子对HepG2细胞FFA及TG含量的影响(n=5, x±s) |
2.2 CD36低表达的HepG2细胞模型构建成功
在HepG2细胞中瞬时转入CD36-siRNA，成功构建CD36低表达的HepG2细胞(CD36 KD组)和阴性对照HepG2细胞(NC HepG2组)。NC组及CD36 KD组的CD36 mRNA表达定量值分别为1.001±0.056及0.380±0.148。与NC组相比，CD36 KD组中HepG2细胞的CD36 mRNA表达降低了62.03%，差异具有统计学意义(P=0.002)。
2.3 下调CD36抑制HepG2细胞FFA及TG的累积在炎症因子刺激下，对照组HepG2细胞(NC组)的细胞内脂质积聚明显增加(P < 0.05)。而当CD36的表达下调之后，CD36 KD组炎症因子促进胞内FFA及TG含量上升的趋势得到了抑制(P < 0.05)，从而改善了细胞脂质异常积聚的现象(图 2)。
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| A:FFA含量；B:TG含量；a：P < 0.05, 与Control组比较；b：P < 0.05, 与NC比较 图 2 CD36低表达时HepG2细胞中FFA及TG测定结果(n=4, x±s) |
2.4 下调CD36抑制炎症引起的HepG2细胞脂肪酸的动态摄取增加
在炎症因子刺激下，对照组HepG2细胞(NC组)脂肪酸的动态摄取量明显增加(P < 0.05)。而当CD36的表达下调之后，CD36 KD组炎症因子引起的HepG2细胞的脂肪酸动态摄取量增加的现象得到了改善(P < 0.05，表 2、3)。
| 组别 | 0 s | 28s | 56 s | 84 s | 112 s | 140 s | 168 s |
| NC组 | 0.000±0.000 | 5.239±0.287 | 7.452±0.599 | 9.945±0.609 | 12.228±1.082 | 13.725±0.328 | 15.589±1.232 |
| NC+IL-6组 | 0.000±0.000 | 9.558±2.119a | 16.228±2.166b | 21.619±2.559b | 26.088±3.720b | 28.107±3.009b | 29.667±3.989b |
| CD36 KD+IL-6组 | 0.000±0.000 | 5.740±0.313c | 8.442±0.942d | 10.704±2.151d | 13.388±1.483d | 15.623±1.075d | 15.933±1.131d |
| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较；c：P < 0.05，d：P < 0.01，与NC+IL-6组比较 | |||||||
| 组别 | 0 s | 28 s | 56 s | 84 s | 112 s | 140 s | 168 s |
| NC组 | 0.000±0.000 | 5.239±0.287 | 7.452±0.599 | 9.945±0.609 | 12.228±1.082 | 13.725±0.328 | 15.589±1.232 |
| NC+TNF-α组 | 0.000±0.000 | 9.166±2.188a | 13.374±2.778a | 17.938±3.183a | 22.517±4.003a | 26.797±4.300b | 28.628±4.188b |
| CD36 KD+TNF-α组 | 0.000±0.000 | 5.833±0.426 | 8.109±0.887c | 11.364±2.134c | 15.104±2.198c | 17.116±2.512c | 20.063±1.062c |
| a：P < 0.05，b：P < 0.01，与NC组比较；c：P < 0.05，与NC+TNF-α组比较 | |||||||
2.5 CD36下调后缓解炎症引起的HepG2细胞氧化应激
在炎症因子刺激下，对照组HepG2细胞(NC组)中的过氧化氢和活性氧含量明显增加(P < 0.05)。而当HepG2细胞中的CD36表达下调后，炎症因子引起的肝细胞氧化应激被改善(P < 0.01)，从而减轻了对HepG2细胞的损害(图 3)。
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| A:ROS含量；B:H2O2含量；a：P < 0.05, 与Control组比较；b：P < 0.05, 与NC比较 图 3 CD36对炎症状态下HepG2细胞氧化应激的影响(n=4, x±s) |
3 讨论
脂代谢紊乱和炎症反应是NAFLD发生发展的重要原因。我们课题组长期致力于研究炎症与脂质代谢的关系，以阐释炎症与脂质代谢如何相互作用，共同促进NAFLD的发生发展。我们前期大量的研究结果已经表明炎症能够影响脂质代谢平衡：能够通过LDLr调节增加对胆固醇的摄取，通过ABCA1抑制其外流，并通过调节胆固醇合成酶HMG-coA减少胆固醇的合成[12]，且能够通过脂肪酸的内源性合成影响脂肪酸的代谢[13]。脂肪酸的代谢平衡由脂肪酸摄取、内源性合成、TG外排共同维持，其中肝脏的脂质60%左右来源于外源性的脂肪酸摄取，可见脂肪酸摄取对于调节肝脏脂质代谢平衡具有重要贡献。在前期研究的基础上，我们的研究旨在探讨炎症对外源性脂肪酸摄取的影响，以完善炎症对脂质代谢调节的理论。在本研究中，我们发现炎症状态下HepG2细胞的FFA及TG的含量明显增加，同时在FFA动态摄取实验中观察到，炎症刺激能够引起细胞对脂肪酸的摄取增加，提示炎症可能通过促进脂肪酸摄取引起胞内脂质积聚。
前期研究结果提示：CD36与炎症密切相关，互为因果。一方面，CD36能够介导炎症反应的产生[14]。CD36能够与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)结合，激活JNK信号通路诱发炎症反应；另外，CD36能够介导ROS的产生，通过激活NLRP3炎症小体[5]，促进炎症反应的发生。另一方面，炎症也能促进CD36的异常高表达，有研究表明炎症能够刺激肝脏及血管中CD36的蛋白表达增加[15]。由于炎症和CD36的密切相关性，我们进一步探讨了炎症是否通过CD36介导外源性脂肪酸的摄取，诱发脂质积聚。在实验中我们观察到：当CD36被干扰后，炎症引起的脂质积聚得到抑制；并且炎症引起的HepG2细胞的脂肪酸摄取增加得到了控制，说明CD36可能是炎症促进脂肪酸摄取的关键因素。
前期研究也证实了CD36可能是代谢综合征的一个潜在治疗靶点，且与NAFLD的发生密切相关。临床实验表明，NAFLD患者体内CD36表达量上升，与肝脏中脂肪的含量呈正相关[16]，并且人血清中游离的CD36蛋白和肝脏中的CD36含量呈正相关，与NAFLD患者的脂肪变性组织学分级、胰岛素抵抗、体质指数等也呈正相关。目前已有研究证实，在肝脏中，CD36能通过介导脂质积聚导致NAFLD的发生[17-18]。
细胞脂毒性，包括细胞内非酯化的FFA和TG的积累，被认为是导致器官功能障碍的重要因素[19]。比如，肝细胞内的FFA增多会导致很强的细胞毒性，而后又通过加强IL-6等细胞因子的毒性，引起氧化应激和内质网应激等反应，进一步导致细胞功能的下降甚至细胞的凋亡[20]。我们的研究结果表明：炎症因子能够上调HepG2细胞内过氧化氢和活性氧含量，而CD36的表达下调能够缓解炎症因子导致的肝细胞的氧化应激现象，从而减轻了对HepG2细胞的损害，这说明CD36的下调在炎症状态下对肝脏有保护作用。
本研究结果表明，炎症因子能够通过CD36上调HepG2细胞对外源性FFA的摄取，造成胞内大量的脂质积聚，进而诱发细胞脂毒性。本研究为深入研究CD36在肝脏代谢性炎症中的作用提供了初步的实验证据，同时提示CD36可能是防治NAFLD的潜在靶点。
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