0
文章快速检索  
高级检索
海南地区静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抵抗与凝血因子V基因多态性研究
陈浩, 肖占祥, 戚悠飞, 曾昭凡, 岳劼, 刘飒华, 李振振, 吴鸿飞, 张文波     
570311 海口, 海南省人民医院血管外科
[摘要] 目的 了解海南地区静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism, VTE)患者及健康人群活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance, APCR)情况以及可能的凝血因子V基因缺陷(FV Leiden、FV HongKong/Cambridge)。方法 收集2014年1月至2017年1月在海南省人民医院住院的海南籍汉族VTE患者共计101名以及海南籍健康人群104名,检测两组人群中是否存在APCR现象,用多聚酶链反应-限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RLFP)以及基因测序方法检测FV Leiden、FV HongKong/Cambridge基因。结果 VTE组APCR阳性率明显高于对照组(P < 0.05)。在101名VTE患者当中检出1例杂合突变FV Leiden和3例FV HongKong基因型,未发现纯合突变FV Leiden以及FV Cambridge基因型。对照组人群中未发现上述异常基因。结论 APCR可能是导致海南地区人群VTE发病的危险因素,FV Leiden基因在海南人群中少见,FV HongKong可能是海南地区VTE人群较特异的致病基因。
[关键词] 静脉血栓栓塞症     凝血因子V     基因多态性     活化蛋白C抵抗    
Activated protein C resistance and genetic polymorphisms of factor V in patients with venous thromboembolism in Hainan Province
CHEN Hao , XIAO Zhanxiang , QI Youfei , ZENG Zhaofan , YUE Jie , LIU Sahua , LI Zhenzhen , WU Hongfei , ZHANG Wenbo     
Department of Vascular Surgery, Hainan Provincial People's Hospital, Haikou, Hainan Province, 570311, China
Supported by the Natural Science Foundation of Hainan Province (814317)
Corresponding author: XIAO Zhanxiang, Tel: 86-898-68642504, E-mail: xiaozxhn@163.com
[Abstract] Objective To explore the prevalence of activated proteinCresistance (APCR) and accompanying factor V gene defects (FV Leiden, FV HongKong, and FV Cambridge) in patients with venous thromboembolism (VTE) and healthy adults in Hainan Province of China. Methods This study was conducted among 101 patients with VTE and 104 healthy adults of Han Nationality from Hainan Province, who were admitted in our hospital between January, 2014 and January, 2017. Blood samples were obtained from the participants for testing of APCR, and factor V gene mutations (FV Leiden, FV HongKong, and FV Cambridge) were detected using PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RLFP) and gene sequencing. Results The patients with VTE had a significantly higher rate of APCR than the control subjects (P < 0.05). Of the 101 patients with VTE, 1 patient was identified as a factor V Leiden heterozygote carrier and 3 patients were found to carry FV HongKong mutation, while no mutations in factor V gene were found in the control group. Conclusions APCR might serve as a risk factor for VTE in the population in Hainan Province, in whom carriers of FV Leiden gene are scarce. FV HongKong may be a specific mutation in the local residents with VTE in Hainan Province.
[Key words] venous thromboembolism     factor V     polymorphism, genetic     activated protein C resistance    

静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism, VTE)是一种严重危害人民群众健康与生命安全的一种疾病,它是肢体深静脉血栓与肺动脉栓塞的合称。静脉血栓栓塞症的发病与诸多因素有关,包括先天性凝血功能异常、长期制动、高脂血症、肿瘤、抗磷脂综合征、妊娠、口服避孕药等[1]。而有相当一部分VTE的发生是与一种叫作活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance, APCR)的先天性凝血机制障碍密切相关,进一步研究发现大部分APCR的发生是由凝血因子V(FV)的单个点核苷酸突变所导致。本研究旨在观察海南地区VTE人群中APCR现象的发生情况以及有无凝血因子V基因缺陷(FV Leiden、FV HongKong/Cambridge),并与正常人群进行对照,了解FV的基因多态性及在VTE发病中所起的作用。

1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2014年1月至2017年1月在海南省人民医院住院的海南籍汉族VTE患者共计101名,所有患者均通过下肢静脉彩超确诊,且排除以下疾病:恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、慢性肾病、系统性红斑狼疮、长期口服避孕药等。其中男性57名,女性44名,年龄18~86(56.3±17.9)岁。为对照了解APCR情况,同时选取海南省人民医院体检健康人群104人,其中男性64名,女性40名,年龄23~87(59.6±16.3)岁。两组性别及年龄差异经χ2检验均未发现有统计学意义。本研究通过海南省人民医院医学伦理委员会审查(2013-08-20),所有研究对象在纳入研究前均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集

两组均采用EDTA抗凝管采集,清晨空腹抽取上肢静脉血3~4 mL,2 500 r/min离心15 min后,分别提取上层血浆及中层血细胞,置于冻存管内并放在-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 APCR检测

利用凝固法,分别计算加活化蛋白C/不加活化蛋白C的APTT计算活化蛋白C敏感性比率,该比值< 2.0提示为APCR阳性。

1.2.3 DNA抽提

常规酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA。

1.2.4 FV Leiden的检测

采用多聚酶链反应-限制性内切酶长度多态性分析(polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism,PCR-RLFP)检测。PCR扩增引物参照文献[2],上游引物:5′-ATTG-GTTCCAGCGAAAGC-3′, 下游引物:5′-CCATTATTTAG-CCAGGAGACC-3′,共386 bp;反应体系为25 μL,其中包括DNA 1 μL,上游、下游引物各1 μL,缓冲液2.5 μL,dNTPs 2 μL,Taq酶0.2 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环。72 ℃延伸5 min。酶切体系共25 μL,包括10×NEB缓冲液2.5 μL, PCR纯化产物20 μL,MnⅡ酶0.5 μL。反应条件:37 ℃酶切3 h。酶切产物用2%琼脂糖电泳后在紫外灯下观察、拍照。

1.2.5 FV HongKong/Cambridge检测

采用PCR后直接测序的方法对目标位点进行检测。对FV基因第7外显子(228 bp)PCR扩增, 上游引物:5′-TGTCTT-TCTGTCCTAAC-3′, 下游引物:5′-TCTTGAACCTTTGC-CCA-3′,共228 bp;反应体系为25 μL,其中包括DNA 1 μL,上游、下游引物各1 μL,缓冲液2.5 μL,dNTPs 2 μL,Taq酶0.2 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环。72 ℃延伸5 min。采用美国ABI公司基因分析仪3 730对样本FV基因部分第7外显子(228 bp)扩增后的产物进行分析,应用DNAMAN软件,对测序结果与原序列进行比对。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件分别对对照组、VTE组APCR阳性例数进行统计,对两组间阳性率进行χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 APCR检测结果

VTE组APCR阳性率为16.8%,对照组APCR阳性率为4.8%。经χ2检验计算两组之间APCR阳性率存在统计学差异(χ2=7.733,P=0.005)。结果如表 1所示。

表 1 VTE组与对照组血清APCR阳性情况对照[例(%)]
组别 n APCR(+) APCR(-)
VTE组 101 17(16.8) 84(83.2)
对照组 104 5(4.8) 99(95.2)

2.2 FV Leiden检测结果

FV Leinden突变表现为FV基因第1691位G→A,野生型基因扩增后的DNA片段经MnⅡ限制性内切酶作用后,被酶切成248、101、37 bp 3个片段(图 1),其中37 bp片段由于片段较短,在凝胶电泳时染色较浅不甚明显。如1691位碱基G突变为碱基A,突变纯合子在琼脂糖凝胶电泳只出现2个片段,即285 bp和101 bp;若突变为杂合子,则出现37、101、248、285 bp 4个片段。结果提示在VTE组当中仅有1例出现杂合突变,其余均为野生基因型,未发现纯合突变基因型(表 2)。

M:DNA标准;P:未剪切的PCR产物386 bp;1,2,4-11:3条凝胶条带,为野生型纯合子;3所示的凝胶条带为4条,提示为突变杂合子 图 1 FV Leiden凝胶电泳结果

表 2 FV Leiden基因型及等位基因频率(例)
组别 n 基因型频率 等位基因频率
GG GA AA G A
VTE组 101 100 1 0 0 1
对照组 104 104 0 0 0 0
野生纯合子GG,杂合突变GA,纯合突变AA

2.3 FV HongKong/Cambridge突变检测

FV HongKong突变表现为第1 091位A→G,FV Cambridge突变表现为第1 090位G→C,测序结果如图 2所示。结果显示在VTE组当中,有3例表现为FV HongKong突变,其余样本均未检测出FV HongKong/Cambridge(表 3)。

A:未突变基因;B: FV A1090G;箭头所示为突变碱基 图 2 FV HongKong/Cambridge基因测序结果

表 3 FV HongKong/Cambridge基因型[例(%)]
组别 n FV HongKong FV Cambridge
VTE组 101 3(2.97) 0(0)
对照组 104 0(0) 0(0)

2.4 FV基因突变型与APCR的关系

3例FV HongKong阳性患者活化蛋白C敏感性比率分别为1.65、2.16、1.81,判定为2例APCR阳性,1例阴性,阳性率为66.6%。1例FV Leinden杂合子测得活化蛋白C敏感性比率为1.95,判定为APCR阳性,阳性率为100%。

3 讨论

FV是人体血浆当中一种高分子糖蛋白,分子量大约为330×103,是凝血过程当中一个重要的辅因子,其基因组全长80 kb,含有25个外显子。活化蛋白C(activated protein C,APC)在其辅因子蛋白S的作用下,可作用于活化凝血因子V(FVa)上的Arg306、Arg506和Arg679,使FVa失活从而达到抗凝作用。如果凝血因子V的基因上存在某些特定碱基的突变,会导致FVa被APC的灭活作用减弱,从而导致血液高凝状态,这种现象被称为APCR。FV Leiden是凝血因子V基因的1691位核苷酸发生点突变(FV G1691A),由此使第506位Arg被Gln置换(FV R506Q)。随后在1998年又相继发现了FV HongKong、FV Cambridge,分别表现为FV 1091A>G、FV 1090G>C,这两种突变可导致FV第306位Arg分别被Gly和Thr取代。实验发现在缺乏Arg306和Arg506作用位点的情况下,FVa不能被APC显著地灭活[2],这可能解释了FV Leiden、FV HongKong/ Cambridge导致APCR的原因。

FV Leiden的表达存在地域和人种的差别[3],其携带者主要分布欧洲白人当中,且FV Leiden是导致欧美白人APCR现象最主要的原因[4],也被认为是西方人群最重要的遗传性易栓症的致病因素[5]。据统计欧洲人群FV Leiden等位基因频率高达3.5%[6],JUSIĆ-KARIĆ等[7]发现,南斯拉夫人群中深静脉血栓人群中18.0%为杂合突变,2.70%为纯合突变,健康人群中有3.86%表现为杂合突变。而非洲本土人群FV Leiden较少见[8],在亚洲FV Leiden的分布也存在明显差异,西亚地区如伊朗,中、南亚地区如印度、巴基斯坦地区人群FV Leiden的表达明显较高[9-11],东亚人群(黄种人)中该基因表达率最低,日本、韩国国内报道FV Leiden病例数极少[12-13],我国国内人群也只有极少量报道[3, 14-16],且FV Leiden以杂合子居多,纯合子极为罕见。FV HongKong最初在我国香港地区报道,迄今在国内外文献当中极少有相关报道[15-17]。FV Cambridge也仅在欧洲国家中发现,在中国乃至亚洲地区都未见发现。

本研究发现在VTE患者当中APCR发生率约为16.8%,同国内相关研究结果相近,明显高于对照组,显示APCR是海南地区VTE发病当中一个相对危险因素。在101例VTE患者当中仅有1例表达为FV Leiden,呈APCR阳性,表明FV Leiden基因在海南地区VTE人群中较为罕见,这与西方研究当中的高表达率不同,而与国内其他研究结果相吻合,表明FV Leiden并不是导致海南地区人群VTE发病的主要原因。然而不同于国内外研究当中极少量的报道,本研究在VTE人群还发现3例FV HongKong突变,其中2例表现为APCR阳性,可能为中国南方地区人群所特有的致病因素。然而这两种基因型在海南地区人群的频率较低,并不足以代表该地区人群VTE发病的遗传学规律,提示可能有其他原因导致APCR的发生。因此,海南地区VTE人群的发病可能是与包括FV Leiden、FV HongKong等多种因素相关,有待进一步研究。

参考文献
[1] HEIT J A. Epidemiology of venous thromboembolism[J]. Nat Rev Cardiol, 2015, 12(8): 464–474. DOI:10.1038/nrcardio.2015.83
[2] BARHOOVER M A, KALAFATIS M. Cleavage at both Arg306 and Arg506 is required and sufficient for timely and efficient inactivation of factor Va by activated protein C[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2011, 22(4): 317–324. DOI:10.1097/MBC.0b013e3283456c4e
[3] 方碧晴, 张纪蔚. 遗传性静脉血栓栓塞症的研究进展[J]. 中国血管外科杂志(电子版), 2014, 6(1): 12–15.
FANG B Q, ZHANG J W. Research progress of hereditary venous thromboembolism[J]. Chin J Vase Surg(Electr Vers), 2014, 6(1): 12–15.
[4] CROUS-BOU M, HARRINGTON L B, KABRHEL C. Environmental and genetic risk factors associated with venous thromboembolism[J]. Semin Thromb Hemost, 2016, 42(8): 808–820. DOI:10.1055/s-0036-1592333
[5] CAMPELLO E, SPIEZIA L, SIMIONI P. Diagnosis and management of factor V Leiden[J]. Expert Rev Hematol, 2016, 9(12): 1139–1149. DOI:10.1080/17474086.2016.1249364
[6] CLARK J S, ADLER G, SALKIC N N, et al. Allele frequency distribution of 1691G> A F5 (which confers Factor V Leiden) across Europe, including Slavic populations[J]. J Appl Genet, 2013, 54(4): 441–446. DOI:10.1007/s13353-013-0166-9
[7] JUSIĆ-KARIĆ A, TERZIĆ R, JERKIĆ Z, et al. Frequency and association of 1691 (G>A) FVL, 20210 (G>A) PT and 677 (C>T) MTHFR with deep vein thrombosis in the population of Bosnia and Herzegovina[J]. Balkan J Med Genet, 2016, 19(1): 43–50. DOI:10.1515/bjmg-2016-0006
[8] ABDI A A, OSMAN A. Prevalence of common hereditary risk factors for thrombophilia in Somalia and identification of a novel Gln544Arg mutation in coagulation factor V[J]. J Thromb Thrombolysis, 2017, 44(4): 536–543. DOI:10.1007/s11239-017-1543-8
[9] HOSSEINI S, KALANTAR E, HOSSEINI M S, et al. Genetic risk factors in patients with deep venous thrombosis, a retrospective case control study on Iranian population[J]. Thromb J, 2015, 13: 35. DOI:10.1186/s12959-015-0064-y
[10] SAEED A, SUMREEN, KASHIF M A. To determine the frequency of Factor V Leiden in cases of deep vein thrombosis and healthy controls[J]. Pak J Med Sci, 2015, 31(5): 1219–1222. DOI:10.12669/pjms.315.8088
[11] KUMAR A, MISRA S, SAGAr R, et al. Relationship between Factor V Leiden gene variant and risk of ischemic stroke: a case-control study[J]. Ann Indian Acad Neurol, 2017, 20(3): 284–288. DOI:10.4103/aian.AIAN_31_17
[12] SUETA D, ITO M, UCHIBA M, et al. A case of pulmonary thromboembolism due to coagulation factor V Leiden in Japan-usefulness of next generation sequencing[J]. Thromb J, 2017, 15: 8. DOI:10.1186/s12959-017-0132-6
[13] KIM S, SONG I, KIM H K, et al. Thrombophilia in Korean patients with arterial or venous thromboembolisms[J]. Ann Surg Treat Res, 2016, 90(6): 340–345. DOI:10.4174/astr.2016.90.6.340
[14] 张金辉, 冯曜宇, 金辉. 静脉血栓栓塞患者携带LeidenV因子杂合子病例报告[J]. 中国血管外科杂志(电子版), 2014, 6(3): 170–174.
ZHANG J H, FENG Y Y, JIN H. Research of patient with venous thromboembolism carrying Factor V Leiden[J]. Chin J Vase Surg(Electr Vers), 2014, 6(3): 170–174. DOI:10.3969/j.issn.1674-7429.2014.03.016
[15] 褚国芳, 赵凤芹, 石少敏. 临床高危因素及凝血酶原基因G20210A突变和FVL突变对肺栓塞的诊断预测价值[J]. 中国老年学杂志, 2016, 36(5): 1136–1139.
CHU G F, ZHAO F Q, SHI S M. Clinical risk factors and prognostic value of prothrombin gene G20210A mutation and FVL mutation in pulmonary embolism[J]. Chin J Gerontol, 2016, 36(5): 1136–1139. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.053
[16] 高丽霞, 丁秋兰, 吴克雄, 等. 血栓及血栓前状态与凝血因子V基因多态性和APCR及HHcy的相关性研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2016, 24(6): 1850–1855.
GAO L X, DING Q L, WU K X, et al. Correlation of Thrombosis and Prothrombotic State with Coagulation Factor V Gene Polymorphism and APCR.HHcy[J]. J Exp Hematol, 2016, 24(6): 1850–1855.
[17] SHARMA A, BHAKUNI T, BISWAS A, et al. Prevalence of Factor V genetic variants associated with Indian APCR contributing to thrombotic risk[J]. Clin Appl Thromb Hemost, 2017, 23(6): 596–600. DOI:10.1177/1076029615623376
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201804140
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

陈浩, 肖占祥, 戚悠飞, 曾昭凡, 岳劼, 刘飒华, 李振振, 吴鸿飞, 张文波.
CHEN Hao, XIAO Zhanxiang, QI Youfei, ZENG Zhaofan, YUE Jie, LIU Sahua, LI Zhenzhen, WU Hongfei, ZHANG Wenbo.
海南地区静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抵抗与凝血因子V基因多态性研究
Activated protein C resistance and genetic polymorphisms of factor V in patients with venous thromboembolism in Hainan Province
第三军医大学学报, 2018, 40(20): 1894-1897
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(20): 1894-1897
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201804140

文章历史

收稿: 2018-04-20
修回: 2018-06-25

相关文章

工作空间