2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药学综合实验中心;
3. 400044 重庆,重庆大学生物工程学院生物医药与健康工程实验室
2. Comprehensive Experimental Center, Faculty of Pharmacy and Laboratory Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
3. Biomedical and Health Engineering Laboratory, College of Biological Engineering, Chongqing University, Chongqing, 400044, China
许多因素均可以导致创伤的发生,而创伤愈合又是多种因素参与的复杂过程。创伤发生后,伤口极易发生病原微生物的感染,因此在创伤治疗中,控制感染尤其重要。首先,感染控制不佳会延缓伤口愈合速度,并引起医疗成本增加;其次,感染引起的发热、疼痛等并发症会降低患者的生活质量[1-2]。目前超级细菌导致伤口感染的报道日益增多,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)引起的伤口感染在临床中更为常见[3-5]。传统的抗菌药物如万古霉素,在临床应用中可能会诱导细菌耐药,目前临床上已有耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)感染病例的出现。近年来获得广泛关注的纳米银等抗菌敷料在治疗伤口感染方面表现出一定的优势,但因较大的细胞毒性,易积聚在机体造成器官和组织的损伤等限制了其进一步应用于临床。因此,设计开发一种抗MRSA活性好、不易诱导细菌耐药且生物安全性高的新型创伤敷料对临床上治疗MRSA引起的伤口感染意义重大。
我们课题组前期成功制备了桧木醇/纳米氧化锌/聚己内酯(beta-thujaplicin/zinc oxide nanoparticles/polycaprolactone, β-T/ZnONPs/PCL)纳米纤维[6],对其进行了初步的抗菌活性测定和生物安全性评价,结果发现该纳米纤维体外对MRSA有较好抗菌活性,且生物安全性也符合GB/T 16886.5-2011标准[7]。但是,由于载体材料聚己内酯(polycaprolactone,PCL)脂溶性很强,较难测定其对伤口的保湿效果,因此本研究将对前期制备的纳米纤维进行改性研究,拟添加一定比例亲水性材料聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)。PEG是生物相容性较好的人工合成聚合物,优良的溶解性、亲水性,使其能溶解于水和众多的有机溶剂中。PEG可用于高分子材料表面改性,可改善与血液接触的医用高分子材料的生物相容性[8]。PEG具有较好的保湿性和吸湿性,将其与PCL共混,通过静电纺丝技术制备纳米纤维,可以改善单纯以PCL为载体材料的保湿效果,从而有利于创伤伤口的愈合。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂主要仪器:高压静电纺丝机(陆军军医大学药学与检验医学系自组装), 扫描电镜(S-3400N,日本HITACHI公司), 酶标仪(Bio-Rad公司), 电热恒温培养箱(上海盛欣科技公司)。主要试剂:聚己内酯(PCL,平均分子量80 000,美国Sigma-Aldrich公司),聚乙二醇(PEG,平均分子量8 000,上海麦克林公司),纳米氧化锌[ZnONPs,(30±10)nm,上海麦克林公司],桧木醇(β-T,东京化成工业株式会社),2, 2, 2-三氟乙醇(上海麦克林生化科技有限公司),戊二醛(川东化工),多聚甲醛(武汉博士德),DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),青霉素-链霉素双抗(碧云天),MHB培养基(北京陆桥),TSA培养基(海博生物),MRSA菌株(陆军军医大学第一附属医院检验科提供的临床菌株)。
1.2 实验动物SPF级BALB/c雄性小鼠,6~8周龄,体质量为(18±2)g,由陆军军医大学第三附属医院(野战外科研究所)实验动物中心提供,动物实验过程中严格遵循Belmont Report中提出的伦理原则。
1.3 β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维的制备按照PCL与PEG的质量比(8 :2)各称取一定量,混合成总质量为0.5 g的载体材料,按照药物与载体材料质量比(0.5%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG、0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/0.25% ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG、PCL/PEG)称取一定量原料药,分别加入三氯甲烷2.60 mL,在搅拌条件为200 r/min、35 ℃下,用磁力搅拌器搅拌3 h,得到不同比例静电纺丝液。设置纺丝条件为电压8 kV、喷速0.2 mL/h、接收距离9 cm。
1.4 β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维的理化性质表征纳米纤维在扫描电镜下观察外观形貌,并运用Image J软件计算纳米纤维直径分布(n=50根)。采用傅里叶变换红外光谱仪(fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)考察纳米纤维和药物之间的结构和化学键、差示扫描量热仪(differential scanning calorimeter, DSC)测定纳米纤维的热力学性质。纳米纤维(β-T/ZnONPs/PCL/PEG)在扫描电镜下观察,操作同前。红外光谱的测定是将纳米纤维(β-T/ZnONPs/PCL/PEG、PCL/PEG、PCL)和PEG原料药按照要求裁剪后固定于样品台上,测定在500~4 500 cm-1范围内的红外光谱。纳米纤维的热力学测定是将纳米纤维(β-T/ZnONPs/PCL/PEG、PCL/PEG、PCL)和PEG原料药置于DSC样品台,温度从10 ℃加热至100 ℃,加热速率为10 ℃/min,N2流量为50 mL/min,待反应完全后观察图谱。
1.5 纳米纤维抗菌活性测定将5种组分纳米纤维(0.5%β-T/0.25% ZnONPs/PCL/PEG、0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/0.5%ZnONPs/ PCL/PEG、PCL/PEG)制成直径为6 mm的圆形薄膜块,选取其中厚度、质量相近的,在紫外下灭菌后贴在接种MRSA菌株的培养皿上,37 ℃恒温培养箱中孵育24 h后测抑菌圈大小。
1.6 纳米纤维细胞毒性评价选择人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts,HSFs)对纳米纤维0.5%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/ PEG、0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/ 0.25% ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/0.5% ZnONPs/PCL/PEG、PCL/PEG进行细胞毒性评价,不加药组为对照。将纳米纤维膜制成直径为6 mm的圆形薄膜块,称取质量相近的灭菌处理。HSFs培养至对数生长期,配成浓度为5 000个/mL的细胞悬液,按每孔150 μL的体积接种至96孔板,贴壁生长24 h后加入纳米纤维膜。分别在孵育24、72 h后移去纳米纤维膜,每孔加入20 μL MTT,细胞培养箱中继续孵育4 h,吸净DMEM培养基后加入150 μL DMSO,室温下避光振摇至结晶溶解消失,在490 nm下测光密度D(490)值。
1.7 MRSA感染小鼠伤口模型的建立选择SPF级、体质量(18±2)g的BALB/c雄性小鼠,背部脱毛,1.5%戊巴比妥麻醉并消毒后,制造约1.8 cm×1.8 cm的皮肤创面,不破坏筋膜层。伤口涂浓度为108 CFU/mL、20 μL的MRSA菌液,利用枪头轻轻涂抹均匀,24 h后同样操作再次接种1次,在首次涂菌48 h后观察伤口情况,有淡黄色脓液渗出,创面边缘有炎症反应,分泌物培养有MRSA菌株生长,即造模成功。
1.8 纳米纤维对MRSA感染小鼠伤口的治疗作用按照上述模型,选择25只BALB/c雄性小鼠,与上述造模同法操作,在首次涂菌48 h伤口感染后,给予纳米纤维覆盖伤口。共设置无纳米纤维覆盖裸露组、PCL/PEG组、0.25%ZnONPs/PCL/PEG组、1%β-T/PCL/PEG组、1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组5组。每组5只小鼠,其中3只小鼠用于观察伤口愈合情况,另2只用于取做HE染色的皮肤标本。以制造伤口时间为起点,每天给予伤口换药,并观察伤口愈合情况。在第3、7、11、15天,观察伤口愈合情况,并拍照。利用Image J软件计算小鼠伤口愈合面积后统计伤口愈合率。
1.9 HE染色以制造伤口时间为起点,在第7、15天,每组各取1只小鼠取伤口皮肤标本做HE染色,标本放在4%多聚甲醛固定。切片制作好后在显微镜下观察,并拍照。
1.10 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行分析,计量资料以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维的理化性质在扫描电镜下观察β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维结构,如图 1所示,纳米纤维直径为(255.98±56.08)nm。采用FT-IR考察纳米纤维β-T/ZnONPs/PCL/PEG和药物之间的结构和化学键,结果表明药物与载体材料之间的相容性较好,见图 2。纳米纤维β-T/ZnONPs/PCL/PEG的热力学性质通过差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)来表征,结果显示载药纳米纤维、PCL纳米纤维与PCL/PEG纳米纤维均只有1个熔融峰,说明各组分之间相容性较好,结果见图 3。
2.2 β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维的抑菌活性测定
考察不同载药比例纳米纤维对MRSA的体外抑菌活性,结果见图 4。实验结果显示,1%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG组纳米纤维与其他组相比,对MRSA抑制效果明显,差异有统计学意义(P < 0.05),纳米纤维0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG组与1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组之间对MRSA抑制作用相似,差异无统计学意义(P>0.05),但其分别与0.5%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组、PCL/PEG组间比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.3 β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维的细胞毒性研究
运用MTT法,对不同组分纳米纤维进行细胞毒性评价,结果见图 5。进一步进行统计学分析结果显示,不载药纳米纤维PCL/PEG几乎没有细胞毒性,载药纳米纤维中0.5%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组毒性最小,与其他载药组相比,差异有统计学意义(P < 0.05);0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG组与1%β-T/0.25% ZnONPs/PCL/PEG组细胞毒性相似,差异无统计学意义(P>0.05);1%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG组细胞毒性最大,与其他组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.4 MRSA感染小鼠伤口模型的确定
通过对BALB/c小鼠皮肤伤口进行涂菌,首次涂菌48 h后观察伤口,见图 6。结果显示,小鼠伤口分泌大量脓液,取分泌物经甘露醇氯化钠琼脂选择性培养后显示有大量MRSA菌落形成,说明MRSA感染小鼠伤口模型建立成功。
2.5 纳米纤维对MRSA感染小鼠伤口的治疗作用
通过对载药纳米纤维的体外抗菌活性和细胞毒性测定,选择纳米纤维1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG评价其对小鼠MRSA伤口感染的治疗作用。共设置了无纳米纤维覆盖裸露组、PCL/PEG组、0.25%ZnONPs/PCL/PEG组、1%β-T/PCL/PEG组、1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组5组。以制造伤口时间为起点,在第3、7、11、15天,观察伤口并拍照,结果见图 7。由图 7可见,载药纳米纤维组与裸露组、PCL/PEG组相比,伤口恢复速度较快,1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组小鼠伤口在第15天基本已经痊愈。通过对伤口愈合面积的统计分析结果显示(图 8),在第7天,给予0.25%ZnONPs/PCL/PEG、1%β-T/PCL/PEG与1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维治疗的小鼠伤口面积比裸露组和PCL/PEG组小,差异有统计学意义(P < 0.05)。在第11天,纳米纤维1% β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组比0.25%ZnONPs/PCL/PEG组对伤口治疗作用更加明显(P < 0.05),而与1%β-T/PCL/PEG组相似(P>0.05),3组载药组均优于其他2组(P < 0.05)。在第15天,载药纳米纤维各组之间伤口愈合速度相似,虽然1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组伤口愈合似乎更快,但差异无统计学意义(P>0.05)。β-T与ZnONPs通过静电纺丝技术制备的1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维能够对MRSA感染的伤口有较好的治疗作用,β-T与ZnONPs单药制备的纳米纤维对MRSA感染的伤口也具备一定的治疗作用,但疗效相对较弱,可能是单药对MRSA的抑制作用较差导致。
2.6 HE染色结果
通过HE染色,细胞核被染成蓝色,细胞质被染成紫色,胶原纤维呈粉红色。HE染色结果显示,正常小鼠皮肤组织有完整的皮肤结构,表皮、真皮、皮下组织(如毛囊等)清晰可见,见图 9。
在给予纳米纤维治疗后,以制造伤口时间为起点,在第7、15天,各组分别取小鼠皮肤愈合组织进行HE染色。如图 10所示,在第7天,各组染色结果显示伤口组织没有完整的结构,表皮缺失,甚至有明显的组织缺损,伤口部位有大量炎性细胞浸润、聚集,其中裸露组、PCL/PEG组炎症反应更加明显,0.25%ZnONPs/PCL/PEG组与1%β-T/PCL/PEG组炎症反应较轻,1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组炎性细胞浸润、聚集比前几组明显减轻。在第15天的HE染色结果显示,裸露组、PCL/PEG组小鼠伤口仍没有形成明显完整的皮肤结构,而0.25%ZnONPs/PCL/PEG组、1%β-T/PCL/PEG组与1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG组已经有明显的表皮形成,联合给药组小鼠伤口甚至有毛囊等皮下组织形成,小鼠伤口愈合速度明显优于其他各组。
3 讨论
伤口的愈合是多因素参与的过程,微生物导致的伤口感染是伤口愈合缓慢的重要原因之一。感染会引起伤口闭合的延迟,降低抗拉强度,增加患者住院时间,甚至引起患者脓毒血症、多器官功能衰竭和死亡[9]。目前关于感染性伤口的治疗措施,主要包括清创术、伤口清理和应用抗菌药物。而一些毒性较大、被证明对伤口愈合无益的消毒剂应该避免使用。因此,临床上急需一种能治疗感染性伤口的新方法。近年来,通过静电纺丝技术制备的新型创伤敷料得到研究者的广泛关注,这种敷料是由纳米纤维构成,具有较好的透气性和保湿性等特点,且在敷料中装载一定的目标药物,可以使其具备抑制细菌生长、促进伤口愈合等多种生物功能。本课题主要针对临床上MRSA引起的伤口感染,通过静电纺丝技术制备能够局部治疗感染性伤口的纳米纤维型创伤敷料。
本研究通过静电纺丝技术制备β-T/ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维,通过体外抗菌活性和细胞毒性的测定,0.5%β-T/0.5%ZnONPs/PCL/PEG与1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG两种组分的纳米纤维对MRSA抗菌活性相似,且细胞毒性较小。选择BALB/c小鼠建立MRSA伤口感染模型,分别给予不同的治疗措施,实验结果显示1%β-T/0.25%ZnONPs/PCL/PEG纳米纤维对伤口的治疗效果明显。取小鼠伤口组织HE染色观察,同样证实β-T与ZnONPs制备的纳米纤维对感染性伤口的治疗作用显著。
AGREN等[10]认为局部给予锌治疗,可以促进溃疡部位上皮细胞的再生,减少炎症反应和抑制微生物的生长,从而促进腿部溃疡的愈合。RAGUVARAN等[11]合成了ZnONPs/海藻酸钠/阿拉伯胶型水凝胶,并通过体外伤口愈合实验验证了其对皮肤成纤维细胞的作用。KUMAR等[12]制备了ZnONPs/壳聚糖型水凝胶,利用SD大鼠建立伤口模型,并验证了其制备的水凝胶可以通过促进上皮形成和胶原沉积来促进伤口愈合。由上述可知,ZnONPs近年来在创伤愈合方面的研究众多,其促进伤口愈合的详细机制尚不十分明确,但由于其独特的生物特性,获得了越来越多的关注。β-T是一个天然小分子化合物,其具有广谱抗菌活性和抗炎效应,尤其对金黄色葡萄球菌的抗菌作用明显。FOTOPOULOU等[13]证明其具有较强的抗菌活性,且可以抑制细菌形成生物膜。HUANG等[14]将β-T加入硅酸钙型水泥,发现其不仅能抑制炎性细胞因子的表达,而且表现出更好的生物相容性和抗菌活性,甚至激活了成牙质细胞的分化。以上研究均表明ZnONPs和β-T具有较好的生物活性,在促进创伤愈合和抗感染方面具有重要的应用价值。本课题组运用静电纺丝技术将两种药物装载于PCL/PEG为载体的纳米纤维中,在MRSA感染BALB/c小鼠伤口的模型中,验证了其较强的抗菌活性和促进伤口愈合的疗效,同时HE染色也表明两种药物均可以减轻伤口部位的炎症反应,且两种药物联合给药较单药制备的纳米纤维效果更显著。
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